This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Achtung: Bitte beachten Sie Sicherheitsdatenblätter (MSDS) für alle Materialien und Reagenzien vor der Verwendung (dh MSDS für Methanol). Achten Sie darauf, den Einsatz aller geeigneten Praktiken Sicherheit bei Lösungsmitteln und High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Eluent Handhabung. Stellen Sie sicher, angemessene Nutzung von Engineering-Kontrollen von HPLC, Analysenwaage und Detektor Instrumentierung, und sorgen für die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe). Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt 3 Methoden der Reaktionsströmungs Nachsäulenderivatisierung (RF-PCD) -Techniken, die jeweils mit einem anderen Reagenz, spezifisch für die Art einer chemischen Verbindung von Interesse. Gehen Sie für die Analyse von ROS Abschnitt &quot;1. Detektion von ROS mit DPPH •&quot; für die Analyse von primären Aminen Abschnitt &quot;2. Nachweis von primären Aminen unter Verwendung von Fluorescamin&quot; und für die Analyse von phenolischen Verbindungen gehen in Abschnitt &quot;3 sehen . Nachweis von PhenolenVerwendung von 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid &quot;. Verwenden von ultrareinem Wasser (zB Milli-Q - Wasser) im gesamten Gebäude . Hinweis: Der Anschluss der RF-Säule wird in fast der gleichen Weise wie eine herkömmliche HPLC-Säule mit dem wichtigen Unterschied, die Anzahl der Endarmaturen auf einer RF-Säule erreicht. verwendeten Armaturen eine Standard-HPLC-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden, können verwendet werden, um eine RF-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden. 1. Nachweis von ROS Mit DPPH • <ol><li> Einrichten von HPLC - Instrument <ol><li> Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit 100% Wasser auf der Linie A und 100% Methanol auf Linie B als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpen gemäß Herstelleranforderungen. </li><li> Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die zusätzliche Derivatisierung Pumpe wie in 4A dargestellt. </li><li> Stellen Sie die UV-Vis-Detektor bei einer Wellenlänge von 520 nm zu analysieren. </li></ol></li><li> Einrichten vonRF-Säule <ol><li> Verbinden des Einlasses der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument. </li><li> Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass. </li><li> Schließen Sie einen Ausgang Peripherieschnittstelle an die UV-Vis-Detektor mit einer 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden. </li><li> Schließen Sie die DPPH • Pumpenleitung an einen Peripherie - Anschluss am Ausgang des HF - Säule. </li><li> Blockieren die nicht verwendeten Peripherieschnittstelle am Ausgang der RF Spalte einen Spalten Stopper verwendet wird. </li><li> Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min -1 bei 100% -Linie B - 100% Methanol. </li><li> Äquilibrierung der Säule mit 100% Methanol mobile Phase für 10 min für eine 4,6 mm ID x 100 mm Säule Länge. Diese Zeit sollte entsprechend den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann. </li></ol></li><li> Herstellung von DPPH • Reagenz <ol><li> Bereiten Sie eine 0,1 mg / ml Lösung von DPPH • in Methanol. </li&gt; <li> Beschallen den Kolben , der die DPPH • Reagenz für 10 min enthält. </li><li> Decken Sie den Kolben in Folie Lichteinwirkung zu verhindern. </li><li> Spülen Sie die DPPH • Pumpe mit dem vorbereiteten DPPH • Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen. </li></ol></li><li> Einstellen des HF - Kolonnenauslaß <ol><li> Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher. </li><li> Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert. </li><li> Wieder wiegen den Zentralbehälter Port und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie folgt: Gewicht des Zentralanschluss (g) = Endgewicht Zentral Hafen Schiffs (g) - Anfangsgewicht von Zentral Hafen Schiffs (g) </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2 und 1.4.3 für das Abwasser Austritt aus dem UV-Vis, die an den Peripherieanschluss des HF-Säule und berechnen Gewicht für die Peripherieschnittbehälter angebracht ist, wiefolgt: Gewicht der Peripherieschnittstelle (g) = Endgewicht Peripherieschnittbehälter (g) - Anfangsgewicht von Peripherieschnittbehälter (g) </li><li> Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie folgt: % Zentral Port = Gewicht der Zentralanschluss (g) / (Gewicht des Zentralanschluss (g) + Gewicht der Peripherieschnittstelle (g)) x 100 % Peripherieschnitt = Gewicht der Peripherieschnittstelle (g) / (Gewicht des Zentralanschluss (g) + Gewicht der Peripherieschnittstelle (g)) x 100 </li><li> Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripheren Strömungs 30:70 (Zentral: periphere). Wenn die zentrale Strömung oberhalb von 30% liegt, verringern die Menge der Strömung austritt durch eine Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass des zentralen Port hinzufügen. Wenn der zentrale Strömungs unter 30% ist, die Länge von 0,13 mm Schlauch von dem zentralen Port verringern. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.4.1 bis 1.4.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 30:70 (Zentral: periphere) erreicht wird. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des DPPH • Reagenzienpumpe auf 0,5 ml min -1. Hinweis: Die HF - Säule mit DPPH • Reagenz einrichten nun zur Analyse bereit ist. Proben können nun eingespritzt werden. </li></ol></li><li> Beitrag laufen Abschaltbedingungen <ol><li> Sobald alle Proben injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, stoppen Sie die Strömungspumpe Derivatisierungsreagenzes. </li><li> Entfernen Sie die DPPH • Reagenz Pumpenleitung aus dem peripheren Anschluss und Stopper auf den Hafen. </li><li> Durch die Säule zu passieren , auf 1 ml min -1 für 10 min Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase , in der sie , indem die mobile Phase gespeichert werden soll. </li><li> Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe auf dem HPLC-Instrument. </li><li> Ersetzen Sie das DPPH • Reagenz mit Methanol und spülen Sie das zusätzliche Pumpe. Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann. </li></ol></li></ol> 2. Nachweis von primären Aminen FluorescAmin <ol><li> Vorbereitung der mobilen Phase <ol><li> Vorbereitung 1 l einer 10 mM Ammoniumacetat-Lösung, um den pH der Lösung auf 9,0 mit 5 M Ammoniumhydroxid vor dem Verdünnen auf das Volumen eingestellt wird. </li><li> In 52,6 ml Acetonitril (ACN) mit dem Ammoniumacetatpuffer einer vorgemischten mobilen Phase von 95:05 (Puffer: ACN) zu erreichen. </li></ol></li><li> Einrichten von HPLC - Instrument <ol><li> Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit dem vorgemischten vorbereitete Puffer auf der Linie A als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpe gemäß Herstelleranforderungen. </li><li> Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die zusätzliche Derivatisierung Pumpe wie in 4A dargestellt. </li><li> Bringen Sie ein Pulsationsdämpfer Spule an die Derivatisierung Pumpe. </li><li> Set-up der Fluoreszenzdetektor (FLD) mit einer Anregungswellenlänge von 390 nm und Emissionswellenlänge von 475 nm. </li></ol></li><li> Einrichten von HF - Säule <ol><li> Schließen Sie the Einlass der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument. </li><li> Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass. </li><li> Schließen Sie einen Ausgang Peripherieanschluss des HF-Säule mit dem FLD Detektor eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden. </li><li> Verbinden der Derivatisierung Pumpenleitung zu einem peripheren Anschluss am Auslass der RF-Säule. </li><li> Blockieren die nicht verwendeten Peripherieschnittstelle am Ausgang der RF Spalte einen Spalten Stopper verwendet wird. </li><li> Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min -1 bei 100% -Linie A - 10 mM Ammoniumacetat - Puffer pH 9, vorgemischt mit 5% ACN. </li><li> Äquilibrierung der Säule mit der 100% -Linie Eine mobile Phase für 10 min für eine 4,6 mm ID x 100 mm Säule Länge. Diese Zeit kann je nach den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann. </li></ol></li><li> Herstellung von Fluorescamin Reagenzes <ol><li> Stellen Sie 100 ml einer 0,1 mg ml -1 Fluorescamin Reagenz. </li> &lt;li&gt; Ultraschallbad für 1 min. </li><li> Mit Folie abdecken Lichteinwirkung zu verhindern. </li><li> Spülen Sie die Reagenzienpumpe mit dem vorbereiteten Fluorescamin Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen. </li></ol></li><li> Einstellen des HF - Kolonnenauslaß <ol><li> Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher. </li><li> Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert. </li><li> Wieder wiegen den Zentralbehälter und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie in Schritt 1.4.3 folgt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.5.2 für das Abwasser zu 2.5.3 die FLD austretende, die an den Peripherieanschluss des HF-Säule und berechnen Gewicht für periphere angebracht ist, wie in Schritt 1.4.4 folgt. </li><li> Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie in Schritt 1.4.5 folgt. </li><li> Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripherenFlow ist 43:57 (Zentral: periphere). Wenn die zentrale Strömung oberhalb 43% ist, verringern die Menge der Strömung austritt durch eine Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass des zentralen Port hinzufügen. Wenn der zentrale Strömung unter 43% ist, verringern Sie die Länge von 0,13 mm Schlauch aus dem zentralen Anschluss. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.5.1 bis 2.5.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 43:57 (Zentral: periphere) erreicht wird. </li><li> Stellen Sie die Durchflussrate der mobilen Phase Pumpe auf 0,7 ml min -1. </li><li> Stellen Sie die Derivatisierung Pumpe bei 0,1 ml min -1 fließen. Hinweis: Die HF-Säule mit Fluorescamin Reagenz eingerichtet für die Analyse ist nun fertig. Proben können nun eingespritzt werden. </li></ol></li><li> Beitrag laufen Abschaltbedingungen <ol><li> Sobald alle Proben injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, stoppen Sie die Derivatisierung Pumpe. </li><li> Entfernen Sie die Derivatisierung Pumpenleitung aus dem peripheren Anschluss und Stopper. </li><li> Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase indie es gespeichert werden soll , indem die mobile Phase durch die Säule passieren bei 1 ml min -1 für 10 min. </li><li> Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe. </li><li> Ersetzen Sie das Fluorescamin Reagenz mit Acetonitril und spülen Sie das Derivatisierung Pumpe. Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann. </li></ol></li></ol> 3. Nachweis von Phenolen Unter Verwendung von 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid <ol><li> Vorbereitung der mobilen Phase <ol><li> Vorbereitung 1 l eines 100 mM Ammoniumacetat-Lösung, um den pH der Lösung auf 9,0 mit 5 M Ammoniumhydroxid vor dem Verdünnen auf das Volumen eingestellt wird. </li><li> Hinzufügen 52,6 ml Methanol zu dem Ammoniumacetatpuffer einer vorgemischten mobilen Phase von 95 zu erreichen: 5 (Puffer: Methanol). </li></ol></li><li> Einrichten von HPLC - Instrument <ol><li> Bereiten Sie die HPLC-Instrument mit dem vorgemischten vorbereitete Puffer auf der Linie A als mobile Phase. Spülen Sie die Pumpe nach Hersteller; S Anforderungen. </li><li> Stellen Sie die HPLC instrumentalen Komponenten und die beiden zusätzlichen Reagenzienpumpen , wie in 4B dargestellt. </li><li> Bringen Sie ein Pulsationsdämpfer Spule an jedem der Reagenzienpumpen. </li><li> Stellen Sie die UV-Vis-Detektor bei einer Wellenlänge von 500 nm zu analysieren. </li></ol></li><li> Einrichten von HF - Säule <ol><li> Verbinden des Einlasses der RF-Säule mit dem HPLC-Instrument. </li><li> Schließen Sie eine 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch zentralen Anschluss der HF-Säule zum Auslass. </li><li> Schließen Sie einen Ausgang Peripherieanschluss des HF-Säule mit dem UV-Vis-Detektor mit einer 15 cm Länge von 0,13 mm id Schlauch verwenden. </li><li> Verbinden jedes Reagenz (dh 4-Aminoantipyren und Kaliumferricyanid) Pumpenleitung zu einem peripheren Anschluss am Auslass der RF - Säule. </li><li> Bringen die Strömungsrate der HPLC - Pumpe auf 1 ml min -1 bei 100% -Linie A - 100 mM Ammoniumacetat - Puffer pH 9, vorgemischt mit 5% Methanol. </li><li> Äquilibrieren der Säule wit der 100% -Linie Eine mobile Phase für 10 Minuten für eine 4,6 mm ID x 100 mm Länge Spalte. Diese Zeit kann je nach den Abmessungen der anderen Spalten skaliert der Benutzer verwenden kann. </li></ol></li><li> Herstellung von 4-Aminoantipyren Reagenzes <ol><li> Vorbereiten eines Ammoniumacetat-Puffer mit einem pH-Wert von 9 durch Schritt 3.1.1 folgende. </li><li> Wiegen 150 mg 4-Aminoantipyren und lösen sich in 100 ml der vorbereiteten Ammoniumacetat-Puffer (pH 9). </li><li> Beschallen für 1 min. </li><li> Mit Folie abdecken Lichteinwirkung zu verhindern. </li><li> Spülen Sie die erste Reagenz Pumpe mit der hergestellten 4-Aminoantipyren Reagenz gemäß den Herstelleranforderungen. </li></ol></li><li> Herstellung von Kaliumferricyanid Reagenzes <ol><li> Wiegen 150 mg Kaliumferricyanid und lösen sich in 100 ml Ammoniumacetatpuffer (pH 9), hergestellt gemäß Schritt 3.1.1. </li><li> Beschallen für 1 min. </li><li> Decken Sie in Folie Lichteinwirkung zu verhindern. </li><li> Purge das zweite Reagenz Pumpe mit dem vorbereiteten Kaliumferricyanid Reagenz nach den Anforderungen des Herstellers. </li></ol></li><li> Tuning von HF - Säule <ol><li> Exakt zwei saubere und trockene Gefäße wiegen. Beschriften Sie ein Gefäß als zentrale und die andere als peripher. </li><li> Sammeln Sie die Abwasser den zentralen Anschluss in das Gefäß verlass für 1,0 min zentrale markiert. </li><li> Wieder wiegen den Zentralbehälter und berechnen das Gewicht der Strömung von dem zentralen Port wie in Schritt 1.4.3 folgt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.6.2 für das Abwasser zu 3.6.3 die UV-Vis-Austritt aus, die an die Peripherieschnitt der HF-Säule angebracht ist, und berechnen Gewicht für periphere wie in Schritt 1.4.4 folgt. </li><li> Berechnen des Prozentsatzes der Strömung aus den zentralen und peripheren Ports kommen, wie in Schritt 1.4.5 folgt. </li><li> Sicherstellen, dass die Segmentierung Verhältnis zwischen dem zentralen Strömungs und dem peripheren Strömungs 50:50 (Zentral: periphere). Wenn der zentrale Strömungs über 50% liegt, verringert sich dieStrömungsmenge durch Addieren einer Länge von 0,13 mm id Schlauch mit dem Auslass zentrale Öffnung austritt. Wenn der zentrale Strömung unter 50% liegt, verringern Sie die Länge von 0,13 mm Schlauch aus dem zentralen Anschluss. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6.1 bis 3.6.6, bis ein Segmentierungsverhältnis von 50:50 (Zentral: periphere) erreicht wird. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des 4-Aminoantipyren Pumpe auf 0,5 ml min -1. </li><li> Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit des Kaliumferricyanid Pumpe auf 0,25 ml min -1. Hinweis: Die HF-Spalte mit den Zweikomponenten-Reagenzien aufgebaut nun zur Analyse bereit ist. Proben können nun eingespritzt werden. </li></ol></li><li> Beitrag laufen Abschaltbedingungen <ol><li> Sobald alle Proben der Lauf beendet injiziert wurden, was darauf hinweist, dass der Lauf beendet ist, beide der Reagenz Pumpen stoppen. </li><li> Entfernen Sie die Reagenzienpumpleitungen von den peripheren Ports und ersetzen Sie sie mit einem 15 cm Stück 0,13-mm-Schlauch. </li><li> Äquilibrieren der Säule mit der mobilen Phase in WHIch ist es , indem die mobile Phase gespeichert werden , durch die Säule zu passieren , auf 1 ml min -1 für 10 min. </li><li> Stoppen Sie den Fluss der mobilen Phase Pumpe auf dem HPLC-Instrument. </li><li> Ersetzen Sie beide die Reagenzien auf dem Reagenz Pumpen mit Methanol und spülen die zusätzlichen Pumpen gemäß Hersteller Anforderung. Hinweis: Das HPLC-System jetzt abgeschaltet werden kann. </li></ol></li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+Detectors+in+Modern+Liquid+Chromatography.">Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography.</a> Chromatographia. 15, 161-166 (1982).</li><li>Pravadil-Cekic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Reaction+Flow+Chromatography+for+the+Analysis+of+Amino+Acid:+Derivatisation+With+Fluorescamine+Reagent.">Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent.</a> Microchem. J. , (2015).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li><li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures.">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li><li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography.">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li><li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCD ermöglicht die effiziente Durchmischung des Derivatisierungsreagens mit dem HPLC Abstrom säulennachgeordneten ohne die Verwendung von Reaktionsspulen, die Effekte der Bandverbreiterung zu minimieren und die Trennleistung verbessert. RF-PCD Methoden wurden auch Verbesserungen in der Signalantwort in Bezug auf Nachweisverfahren gezeigt. Camenzuli et al. 28 war die erste die Verwendung von Reaktionsströmungsspalten mit DPPH • zum Nachweis von ROS in einer Espressokaffeeprobe zu me...

Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), gekoppelt mit Nachsäulenderivatisierung (PCD) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das bei der Lösung einer Reihe von Fragen im analytischen Labor nützlich ist. Es kann verwendet werden , um Verbindungen zu detektieren , die ansonsten nicht nachweisbar mit der Suite von 1,2 verfügbaren Detektoren sind, um das Signal des Zielanalyten erhöhen, was niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs 3-5 oder selektiv ermöglicht Derivatisierung eines Zielanalyten , um zu vermeiden , Matrixeffekte 6. Üblicherweise verwendete PCD Reaktionen schließen die Reaktion von Aminen, wie Aminosäuren, mit ortho-phthaladehyde 7-9, Ninhydrin 9,10 oder Fluorescamin 11,12, die Derivatisierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit dem 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazil Radikal (DPPH) • 13,14 oder 2,2&#39;-Azino-bis (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) 15,16, und die Verwendung des Jodids-Azid - Reagenz Schwefel c zu derivatisierenontaining Verbindungen 17,18. Es gibt jedoch zahlreiche Nachteile bei der Verwendung von PCD Reaktionen mit HPLC - Systemen 6. Hauptsächlich unter diesen ist die Verwendung von Reaktionsspulen zwischen dem Punkt der Zugabe des Derivatisierungsreagenz (n) und dem Detektor, die Zeit für das Mischen und die Reaktion erlauben , 8 auftreten. Diese Reaktionsschleifen haben oft Volumina von 500 &amp; mgr; l oder mehr, was signifikant ist im Vergleich zu dem Volumen der Rest des HPLC - Systems 19. Die Verwendung dieser hohen Volumenreaktionsschleifen führt zu einer erhöhten Spitzenverbreiterung Vergleich zu dem, was ohne die Anwesenheit der Reaktionsschleife beobachtet werden würde. Dies führt zu kürzeren, breiteren Spitzen, die eine höhere Grenzen der Quantifizierung und Detektion haben und negativ bewirkt chromatographische Auflösung. 1 und 2 unterstreichen die Verschlechterung der Peakform , die aus der Zugabe von verschiedenen Nachsäulenderivatisierung Schleife Volumina zur Folge haben . Diese Analysewurde mit einer Zusammensetzung der mobilen Phase von 94% Methanol und 6% Milli-Q-Wasser durchgeführt. Die Flussrate der mobilen Phase betrug 1 ml / min, war das Injektionsvolumen 20 &amp; mgr; l und die Analyse Wellenlänge betrug 265 nm. Spulen unterschiedlicher Totvolumina von 20 &amp; mgr; l bis 1000 &amp; mgr; l wurden zwischen der Säule und dem Detektor eingesetzt, um die Auswirkungen der Reaktionsschleife Totvolumen in PCD Verfahren zu simulieren. Diese Schleifen wurden aus Edelstahlrohr von 0,5 mm Innendurchmesser hergestellt. Das Experiment wurde an einem HPLC-System durchgeführt, bestehend aus einer Steuereinheit (SCL-10AVP), eine Niederdruck-Gradient Ventil (FCL-10ALVP), eine Pumpe (LC-20AD), einem Injektor (SIL-10ADVP) und einem PDA-Detektor ( SPD-M10ADVP). Die mobile Phase war durch einen Entgaser vor der Einführung in das HPLC-System gepumpt. Die Trennung wurde unter Verwendung einer 250 mm x 4,6 mm ID-Säule 5 um durchgeführt. Versuchsbedingungen wurden gewählt, um die typisch für PCD Reaktionen, die vor kurzem in der Literatur veröffentlicht wurden. Daseinfachste, am häufigsten Nachsäulenreaktor Aufbau ist eine nicht-segmentierten Rohrreaktor bezeichnet, die die Flüssigkeit fließt, durch die effektiv eine lange, dünne Röhre ist und die Reaktion stattfinden kann. In diesem System Spitze ist Verbreiterung abhängig nicht nur das Totvolumen zu dem System hinzugefügt, sondern auch der Innendurchmesser des Rohres , wie durch Iijima hervorgehoben et al. 8. Darüber hinaus spielt Spulengeometrie eine Rolle bei der Marke Verbreiterung beobachtet. Stewart 20 festgestellt , dass die sekundären Strömungsprofile des Reaktors Aufwickeln ändert, in eine bessere Durchmischung ergibt, was bedeutet , dass das Totvolumen minimiert werden kann. Es wurde festgestellt , dass die Peakverbreiterung nicht signifikant ist , wenn eine offene röhrenförmige Spule 21 gestrickt werden. Wenn die Peakverbreiterung zu große, andere Arten von Reaktoren ist auch 20,22 angesehen werden kann. Diese können Bettreaktoren oder segmentierte Strömungsreaktoren umfassen. Diese Reaktoren sind besonders nützlich für langsame Reaktionen, die sonst require große Reaktionsschleifen. Als nicht-segmentierten Rohrreaktoren sind die häufigsten Arten von Reaktoren in PCD-Anwendungen verwendet werden, der Rest dieses Artikels befasst sich mit diesem Reaktortyp-Setup. Die Gestaltung der Reaktionsstrom (RF) Spalte enthält einen Multiport-Endanschlußstück, die mobile Phase (oder Eingabe) die Säule entweder durch einen einzelnen Port an dem radialen mittleren Bereich der Kolonne oder drei Öffnungen an der äußeren Lage angeordnet zu verlassen erlaubt Wandbereich der Säule (siehe Abbildung 3). Diese beiden Ströme werden getrennt Endfitting mit einer zentralen porösen Fritte enthält, die durch eine undurchlässige Ring umgeben ist, der wiederum durch eine äußere poröse Fritte umgeben ist, die an der Kolonnenwand heraus erstreckt. Aufgrund der zentralen Strömungs undurchlässige Ringquer ist zwischen den beiden porösen Bereichen nicht möglich. Während der Reaktionsströmungs Chromatographie das Derivatisierungsreagenz (s) gegen die Strömungsrichtung der mobilen Phase gepumpt in einen oder two der äußeren Öffnungen des Reaktionsstromkolonne. Die Säule wird mit dem Eluens Derivatisierungsreagenz (s) in der äußeren Fritte vermischt und zu dem Detektor durch einen freien Außen Port geleitet. Die Reaktionsstrom kann entweder für ein einzelnes Reagenz Derivatisierung verwendet werden oder einem dualen Reagenzsystem (2 Anschlüsse für die Derivatisierungsreagenzien (1-Port für den Derivatisierungsreagenzes, 1 Anschluss des Säuleneluent an den Detektor und 1 Port blockiert passieren) und 1-Port passieren die Säuleneluent zum Detektor). Die Strömung aus dem zentralen Strom kann entweder verwendet werden , um die nicht derivatisierte Säuleneluent zu erfassen, effektiv Multiplexen Detektions 23 oder Abfall geleitet. Eine Hauptabstimmungstechnik, die verfügbar ist, wenn ausgeführt RF-PCD-Chromatographie ist das Verhältnis der zentralen und peripheren fließt. Das optimale Verhältnis für jede Derivatisierung hängt von einer Reihe von Faktoren ab, wie beispielsweise, ob die zentralen Strömungs wird Abfall nachgewiesen oder übergeben werden. Daher einmal das optimale Verhältnis bestimmt worden istSollte es, dass die richtige Strömungsverhältnis wird jedem Lauf durchgeführt wird, bevor erreicht werden gewährleistet. Es wurde gefunden, dass die Verwendung einer Fritte in effizienter Vermischung im Vergleich zu herkömmlichen Mischtechniken, verwenden typischerweise einen Null Totvolumen T-Stück oder geringes Totvolumen der Säule Eluentenstrom und das Derivatisierungsreagenz in RF-PCD Ergebnisse zu mischen W- Stück die beiden Ströme zu mischen. Dies hat sich für die Verwendung von relativ kleinen Reaktionsschleifen, oder sogar die Eliminierung der Reaktionsschleife insgesamt erlaubt. Die Reduktion der Reaktionsschleife Größe führt zu schärferen Peaks im Vergleich zu herkömmlichen Nachsäulenderivatisierung Methoden. Das bedeutet, dass, trotz der Tatsache, dass nicht alle der Säule Eluent wird derivatisiert, größeres Signal-Rausch-Verhältnisse eingehalten werden und somit niedrigere Nachweisgrenzen und Bestimmungs erreicht werden. Die Reaktionsfluss-Chromatographie wurde Schwierigkeiten bei der Anpassung von PKD-Reaktion zu überwinden entwickelts zu modernen HPLC-Säulen und Systeme, insbesondere der Effizienzverlust durch Band verursachte Verbreiterung aufgrund der großen Post-Säule Toten durch die Notwendigkeit verursacht Volumina großes Volumen Reaktion zu verwenden Schleifen. Die effizientere Mischprozesse in RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD bedeuten, dass kleinere Reaktionsschleife Volumina verwendet werden in beobachteten Abscheideleistung zu einer Erhöhung führt. Weiterhin RF-PCD-Chromatographie zeigt sowohl Signal erhöht und verringert Lärm im Vergleich zu herkömmlichen Techniken PCD in unteren Grenzen der Nachweis und die Quantifizierung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden PCD führt. Ein zusätzlicher Vorteil des RF-PCD im Vergleich zu herkömmlichen PCD Methoden ist die Fähigkeit, den underivatisierten Strom zu überwachen, die von dem zentralen Port des RF-Säule sowie der derivatisierten Strom eluiert, die aus dem Umfangsbereich der Säule eluiert. RF-PCD ist ein relativ neues, aber vielversprechende Technik, die viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden PCD zeigt. <p class="jove_content"&gt; Anschluss der RF-Säule wird in fast der gleichen Weise wie eine herkömmliche HPLC-Säule mit dem wichtigen Unterschied, die Anzahl der Endarmaturen auf einer RF-Säule erreicht. verwendeten Armaturen eine Standard-HPLC-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden, können verwendet werden, um eine RF-Säule mit dem HPLC-System zu verbinden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HPLC instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Series HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Pump(s) for derivatisation system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>LC-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF colum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-commercial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z227307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided with column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tube cutter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z290882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-point analytical balance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-Scientific equiptment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eluent collection vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will depend on instrument used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Laboratory glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminoantipyrene&#160;</td>
			<td>Acros Organics BVBA</td>
			<td>AC103151000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide&#160;</td>
			<td>AnalaR</td>
			<td>B10204-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Die erste PCD - Verfahren, die zur Verwendung von RF-PCD wurde die Derivatisierung von Antioxidantien mit der 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazil Radikal (DPPH) • 24 angepasst. Diese Reaktion wurde durch Koleva et al vorgestellt. 25 und seit weit verbreitet ist. Die Detektion beruht auf der Entfärbung des DPPH • Radikale in Gegenwart von reaktiven Sauerstoffspezies, damit die Anwesenheit von Antioxidationsmitteln führt zu einem Abfall in der beobachteten Extinktion. D...

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Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Nachsäulenderivatisierung Mit Reaktionsfluß High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

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14.9K Aufrufe.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Serie: Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Forschung

Chemie

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Abstimmen eines Parallel Segmented Flow Säule und Aktivieren von Mehrfachanalysen

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Vorhang-Flow-Säule: Optimierung der Effizienz und Empfindlichkeit

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Programmable Main-chain Liquid-crystalline Elastomers Using a Two-stage Thiol-acrylate Reaction

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline elastomers (LCEs) with facile control over network structure and programming of an aligned monodomain. Tailored LCE networks were synthesized using routine mixing of commercially available starting materials and pouring monomer solutions into molds to cure. An initial polydomain LCE network is formed via a self-limiting thiol-acrylate Michael-addition reaction. Strain-to-failure and glass transition behavior were investigated as a function of crosslinking monomer, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) (PETMP). An example non-stoichiometric system of 15 mol% PETMP thiol groups and an excess of 15 mol% acrylate groups was used to demonstrate the robust nature of the material. The LCE formed an aligned and transparent monodomain when stretched, with a maximum failure strain over 600%. Stretched LCE samples were able to demonstrate both stress-driven thermal actuation when held under a constant bias stress or the shape-memory effect when stretched and unloaded. A permanently programmed monodomain was achieved via a second-stage photopolymerization reaction of the excess acrylate groups when the sample was in the stretched state. LCE samples were photo-cured and programmed at 100%, 200%, 300%, and 400% strain, with all samples demonstrating over 90% shape fixity when unloaded. The magnitude of total stress-free actuation increased from 35% to 115% with increased programming strain. Overall, the two-stage TAMAP methodology is presented as a powerful tool to prepare main-chain LCE systems and explore structure-property-performance relationships in these fascinating stimuli-sensitive materials.

A novel methodology is presented to synthesize and program main-chain liquid-crystalline elastomers using commercially available starting monomers. A wide range of thermomechanical properties was tailored by adjusting the amount of crosslinker, while the actuation performance was dependent on the amount of applied strain during programming.

Synthese von Programmierbare Hauptkettenflüssigkristalline Elastomere unter Verwendung eines Zwei-Stufen-Thiol-Acrylat-Reaktions

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

Eine einfache Methode zur Glucosinolate Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and related diseases, but their precise measurement is still a challenge. Many protocols have been described for neurotransmitter measurement by a variety of instruments, including high-pressure liquid chromatography (HPLC). However, there are shortcomings, such as complicated operation or hard-to-detect multiple targets, which cannot be avoided, and presently, the dominant analysis technique is still HPLC coupled with sensitive electrochemical or fluorimetric detection, due to its high sensitivity and good selectivity. Here, a detailed protocol is described for the pretreatment and detection of catecholamines with high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ECD) in real urine samples of infants, using electrospun composite nanofibers composed of polymeric crown ether with polystyrene as adsorbent, also known as the packed-fiber solid phase extraction (PFSPE) method. We show how urine samples can be easily precleaned by a nanofiber-packed solid phase column, and how the analytes in the sample can be rapidly enriched, desorbed, and detected on an ECD system. PFSPE greatly simplifies the pretreatment procedures for biological samples, allowing for decreased time, expense, and reduction of the loss of targets. 
Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for solid-phase extraction coupled to an HPLC-ECD system for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters (norepinephrine (NE), epinephrine (E), dopamine (DA)) and two of their metabolites (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) and 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid (DOPAC)) in infants' urine. The established protocol was applied to assess the differences of urinary catecholamines and their metabolites between high-risk infants with perinatal brain damage and healthy controls. Comparative analysis revealed a significant difference in urinary MHPG between the two groups, indicating that the catecholamine metabolites may be an important candidate marker for early diagnosis of cases at risk for brain damage in infants.

We present a convenient solid-phase extraction coupled to high-pressure liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection (ECD) for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters and two of their metabolites in infants' urine. We also identify the metabolite MHPG as a potential biomarker for the early diagnosis of brain damage for infants.

Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and cost savings through the &#34;scaling out&#34; strategy as opposed to the traditional &#34;scaling up&#34;. Herein, we report the reaction of diphenyldiazomethane with p-nitrobenzoic acid in both batch and flow modes. To effectively transfer the reaction from batch to flow mode, it is essential to first conduct the reaction in batch. As a consequence, the reaction of diphenyldiazomethane was first studied in batch as a function of temperature, reaction time, and concentration to obtain kinetic information and process parameters. The glass flow reactor set-up is described and combines two types of reaction modules with &#34;mixing&#34; and &#34;linear&#34; microstructures. Finally, the reaction of diphenyldiazomethane with p-nitrobenzoic acid was successfully conducted in the flow reactor, with up to 95% conversion of the diphenyldiazomethane in 11 min. This proof of concept reaction aims to provide insight for scientists to consider flow technology&#39;s competitiveness, sustainability, and versatility in their research.

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Flow chemistry carries environmental and economic advantages by leveraging superior mixing, heat transfer and cost benefits. Herein, we provide a blueprint to transfer chemical processes from batch to flow mode. The reaction of diphenyldiazomethane (DDM) with p-nitrobenzoic acid, conducted in batch and flow, was chosen for proof of concept.

Kontinuierlicher Fluss Chemie: Reaktion des Diphenyldiazomethane mit p- Nitrobenzoic Säure

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and ...