Wir danken den Tiereinrichtungen des Cordelier Research Center (CEF, Paris, Frankreich), Genethon (Evry, Frankreich) und Genopole (CERFE, Evry, Frankreich). Wir danken Jo Ann Cahn für ihre sorgfältige Lektüre des Manuskripts. Diese Forschung wurde vom Institut National de la Santé Et de la Rechercher Médicale, Universität Paris Descartes, Pierre &amp; Marie Curie-Universität, der Vereinigung pour la Recherche contre le Cancer unterstützt, die tunesische Direction Générale de la Recherche Scientifique, die französisch-tunesische CMCU Projekt und die Aktionen Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) Fonds. JC wurde von den Grenzen in der Life-Science-Doktorandenschule und durch ein Stipendium vom INCA (Institut National du Cancer) unterstützt. RBA war ein Empfänger von Zuschüssen aus dem DGRS-INSERM und dem CMCU. SD erhielt einen Zuschuss aus dem Institut National du Cancer.

Alle Verfahren Mäuse denen mit EU-Richtlinien erfüllt, Französisch Vorschriften für Tierversuche (Ministerium für Landwirtschaft Gesetz Nr 2001-464, Mai 2001) und den Richtlinien des Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Ausschuss für Tierforschung und wurden von der zuständigen lokalen Kommission gebilligt (die Charles Darwin Ethikkommission für Tierversuche, Paris, Frankreich; Zulassungsnummer: p3 / 2009/004). 1. Zellpräparation <ol><li> Wachsen Maus-B-Lymphom-Zellinie A20.IIA-luc2 in RPMI-1640-Glutamax-Medium mit 10% fötalem Kälberserum, 100 ug / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM Natriumpyruvat, 50 &amp; mgr; M 2-Mercaptoethanol und 0,50 mg / ml Hygromycin B. </li><li> Pflegen Zellkultur bei 37 ° C, 5% CO 2 und ändern Medium alle zwei bis drei Tage. Ernte 5 ml der Zellsuspension mit einer Pipette einen Tag nach dem Wechsel des Mediums. </li><li> Spin-Zellen bei 3005; g für 10 min, und die Zellen in 3 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) suspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um die Zellen zu waschen. </li><li> Mischen Sie 15 ul Zellsuspension mit 30 ul Trypanblau Markierung vor einer Malassez Zählkammer geladen werden. Berechne die Zellkonzentration mit der Formel: Konzentration (Zellen / ml) = Anzahl der Zellen in der Zählung grid * 3 * 1000. </li><li> Drehen Sie die Zellen ein weiteres Mal bei 300 g für 10 min. Entfernen Überstand mit einer Pipette. Mit der C-Konzentration in dem Schritt berechnet 1.4), ist die Anzahl der Zellen N = C * 3. </li><li> Berechne das Volumen steriler PBS 1x erforderlich , um Zellsuspension A bei einer Konzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml mit der folgenden Formel erhalten: PBS - Volumen (ml) = N / (5 x 10 7). Suspendiere das Zellpellet (aus Schritt 1.5)) in dem Volumen steriler PBS 1x im vorhergehenden Satz berechnet. Die Zellsuspension A ist in der SCL - Modell verwendet werden (in vivo injizierte Volumen beträgt 100 &amp; mgr; l: 5 x 10 6 Zellens). </li><li> Pipette 10 ul Suspension einer Zelle und fügen 90 ul sterilem PBS in einem 1,5 - ml - Röhrchen 100 &amp; mgr; l der Zellsuspension B zu erhalten , auf 5 x 10 6 Zellen pro ml. Die Zellsuspension B ist in pIOL Modell verwendet werden (in vivo injizierte Volumen beträgt 2 &amp; mgr; l: 1 x 10 4 Zellen). </li></ol> 2. Luciferin <ol><li> Verdünnen Sie 1 g D-Luciferin-Kaliumsalz-Pulver in 30 ml sterilem PBS 1x in einem 50-ml-Röhrchen und schütteln für ein paar Sekunden, um die Aggregate aufzulösen. Hinweis: Da Luciferin lichtempfindlich ist, bereiten 500 ul Aliquots in dunkel 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Speichern Sie die Aliquots bei -20 ° C. HINWEIS: Die Aliquots können mehrere Monate gelagert werden. Nach dem Auftauen sind die Aliquots nicht länger als 1 Tag bei + 4 ° C gelagert werden. Gefrier-Tau-Zyklen sind vorzuziehen Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Injizieren von 100 &amp; mgr; l D-Luciferin-Kaliumsalzlösung intraperitoneal für jede Abbildungs ​​ASSAy. ANMERKUNG: Diese Lösung entspricht 3,3 mg pro Maus für eine Dosis von 150 mg / kg. </li></ol> 3. Anästhetikagemischs und Betäubung <ol><li> Bereiten Sie eine Anästhesielösung durch Mischen von Ketamin 120 mg / kg und Xylazin 6 mg / kg in steriler PBS 1x. </li><li> Injizieren 60 ul Anästhetikagemischs intraperitoneal für jeden Abbildungs ​​Test mit einer 25 G-Nadel. Für Chirurgie (mit pIOL oder SCL-Modell), injizieren 80 ul der Mischung eine tiefere Anästhesie zu erhalten. Setzen Sie die Maus zurück in seinen Käfig. </li><li> Wenn die Maus unbeweglich erscheint, entfernen Sie sie aus dem Käfig und sanft die Maus des Beines zwischen den Fingern zusammendrücken. Wenn die Maus mit einem Escape-Reflex reagiert, warten Sie einige Minuten. Wiederholen Sie die Aktion, bis die Maus nicht reagiert, die eine zufriedenstellende anesthetization bestätigt. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einer Wärmeplatte oder unter einem wärmenden Licht. </li><li> Bewerben Augensalbe Augentrockenheit während anesthetization für die Bildgebung Assay oder für SCL Operation zu vermeiden. Tragen Sie dieAugensalbe nach der Operation für pIOL Modell. </li></ol> 4. Chirurgie und Zellinokulation HINWEIS: Führen Sie alle chirurgischen Eingriffe auf einer Wärmeplatte oder unter einem wärmenden Licht in einem Typ-1-MSW in einem Tierbiosicherheitsstufe 2 Möglichkeiten. Alle chirurgischen Werkzeuge in diesem Abschnitt verwendet wurden vor der Verwendung autoklaviert. <ol><li> Subkutan Lymphom Modell: <ol><li> Herstellung von 100 ul der Zellsuspension in Schritt erhaltenen 1,6 in einer 1-ml-Spritze mit einer 25 G Nadel. Drücken Sie vorsichtig die Haut von Mäusen auf der Flanke zwischen den Fingern, an der Injektionsstelle. Führen Sie die Nadel genau in die Hautfalte. Um eine subkutane Injektion zu gewährleisten, muss die Nadel nicht tief in das Gewebe. <ol><li> Injizieren der Zellen in den skinfold. Beobachten Sie, ob ein wenig Flüssigkeit Ball unter der Haut erscheinen, um zu bestätigen, dass die Injektion korrekt durchgeführt wurde. </li></ol></li></ol></li><li> PIOL Modell: HINWEIS: Diese procedure erfordert 2 Betreiber, bezeichnet hier als Operator 1 und Operator 2. <ol><li> Die Entfernung von Binde: <ol><li> Haben Operator 1 Platzieren Sie die Maus unter einem Binokular. Drücken Sie vorsichtig mit den Fingern an jeder Seite des Auges, es zu löschen. Halten Sie diese Position. </li><li> Haben Operator 2 l ook durch das Binokular. Fassen Sie die Bindehaut mit einer kleinen Zange in der Hand; mit der anderen Hand, schneiden Sie die Bindehaut knapp unterhalb der Zange mit einem kleinen chirurgische Schere. </li><li> Haben Operator 1 Release das Auge der Maus in Schritt 4.2.1.1 gedrückt) </li></ol></li><li> Zellinjektion: <ol><li> Bereiten Sie eine 10-ul stumpfe Präzisionsspritze. Waschen Sie es mit sterilem entionisiertem Wasser durch sie gepumpt wird. Zweimal wiederholen oder dreimal um sicherzustellen, gibt es keine Luftblasen in der Spritze. Dann bereiten 2 ul Zellsuspension zur Injektion. </li><li> Haben Operator 2 drücken Sie vorsichtig mit den Fingern aufe Hand auf jeder Seite des Auges um es zu löschen. Halten Sie diese Position. </li><li> Haben Sie Operator 1 greifen den Rand des Auges mit einer kleinen Zange in einer Hand und ziehen Sie sie vorsichtig nach hinten um das Gewebe zu dehnen. </li><li> Haben Operator 2 l ook durch das Binokular. Mit der anderen Hand, machen ein kleines Loch in der unteren Augapfel der Maus mit einer 32 G-Nadel. </li><li> Haben Operator 2 die Nadel setzen nach unten und holen (mit der gleichen Hand) , um die Präzision Spritze und führen Sie die Nadel in das Loch in dem Schritt 4.2.2.4 gemacht. </li><li> Haben Operator 1 Druck auf den Spritzenkolben mit der anderen Hand. </li><li> Haben Operator 2 v erify mit dem Binokular , die die Zellsuspension in der Spritze in den Augapfel richtig injiziert wurde (der Flüssigkeitsstrom ist leicht zu beobachten). </li><li> Haben Operator 2 r emove die Präzisionsspritze. </li><li> Haben Operator 1 r den Rand des ein Eleaseimal Auge gegriffen in Schritt 4.2.2.3) </li><li> Haben Operator 2 r elease die Seiten des Auges bei Schritt gedrückt 4.2.2.2) </li><li> Tragen Sie die Augensalbe sofort. HINWEIS: Wenn alle Schritte korrekt durchgeführt wurden, sollte die Maus überhaupt nicht während dieses Vorgangs entlüften. </li></ol></li></ol></li></ol> 5. Biolumineszenz-Bildgebung - Tag 0 HINWEIS: Alle Produkte in die Maus injiziert muss vor der Injektion bei RT sein. Nach der Tumorzellen inokuliert wurden, und während das Tier noch anästhesiert wird, um diese Schritte für die Bildgebung stattfindet. <ol><li> Schalten Sie den Scanner und öffnen Sie die Erfassungssoftware. Initialisieren Sie die Kamera, die Stadien und die Linsen, indem Sie auf die Schaltfläche &quot;Initialisieren&quot; klicken. Die Initialisierung wird 10 bis 15 Minuten dauern Vollständigkeit. </li><li> Inject 100 ul D-Luciferin Kaliumsalzlösung intraperitoneal mit einer 25 G - Nadel. intravenös verabreichen Sie es nicht. Wenn intravenous Verwaltung aus irgendeinem Grund erforderlich, die D-Luciferin Natriumsalz muss statt D-Luciferin Kaliumsalz verwendet werden. HINWEIS: Luciferin das überschüssige Reaktanden bei dieser Konzentration ist; daher das Biolumineszenz-Signal ein Plateau erreicht nach 3 bis 7 min und bleibt für mehr als 30 min. </li><li> 10 Minuten nach der D-Luciferin Injektion 13, platzieren Sie das Motiv Maus in den Scanner. Platzieren Sie die Maus in seiner natürlichen Position, den Rücken in Richtung der Kamera, in so einer Position flach wie möglich. Diese Position ist natürlich und leicht reproduzierbar. </li><li> Kreuzen Sie die Belichtungsautomatik - Funktion, und klicken Sie auf Acquire die Rückseite (posterior) Bild des Tieres zu erwerben, mit der automatischen Belichtungsfunktion. HINWEIS: Die Auto-Belichtung Funktion optimiert Belichtungszeit, indem sie es von einem 1-sec Belichtungsbild zu berechnen. Wenn die Biolumineszenzsignal Maus negativ oder sehr gering ist, kann die optimale Belichtungszeit könnteautomatisch auf mehr als 20 min. In diesem Fall kann eine Belichtungszeit von 8 bis 10 min ein guter Kompromiss. Die Belichtungszeit kann manuell eingestellt werden, jedoch müssen die Bilder nicht gesättigten Pixel enthalten. </li><li> Drehen Sie die Maus über die Vorderseite der Maus , um die Kamera zu belichten. Versuchen Sie, die Maus zu glätten und breitete seine vorderen Gliedmaßen, so dass sie nicht über die Brust zu blockieren. </li><li> Erwerben Sie ein Frontbild des Tieres. Stellen Sie sicher, dass die automatische Belichtungskontrollkästchen ist immer noch wieder aktiviert und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Erfassen&quot;. HINWEIS: Das vordere Bild kann vor dem Rück Bild und umgekehrt erworben werden. Die Belichtungszeit der Vorder- und Rückseitenbild kann in Abhängigkeit von der relativen Intensität jeder Seite der Maus unterschiedlich sein. Es wird automatisch berechnet, wenn die Belichtungsautomatik-Funktion. Quantifizierung verwendet nur den Photonenfluss (Photonen pro Sekunde) und hängt nicht von der Belichtungszeit. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf eine wärmende plate oder unter einem wärmenden Licht, bis er aus der Narkose erholt und es dann in seinem Käfig Platz zurück. </li></ol> 6. Biolumineszenz-Bildgebung - Nach dem Tag 0 <ol><li> Schalten Sie den Imager, initialisieren Sie die Kamera, die Stufen und die Linsen, wie in Schritt 5.1). </li><li> Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 60 ul der Ketamin (120 mg / kg) / Xylazin (6 mg / kg) Gemisch (siehe Schritte 3.1 bis 3.5). Hinweis: Diese Methode von anesthetization ermöglicht die Abbildung alle 5 Tage. Zur Durchführung tägliche Bildgebung, eine Methode, die Isofluran als das Anästhetikum und ein Biolumineszenz-Imager für erforderlich ist, mit dieser Betäubung Einsatz verwendet. </li><li> Erwerben Sie Vorder- und Rückseite Bilder des Tieres, mit der Belichtungsautomatik - Funktion, wie in den Schritten 5.5) und 5.6). Gehen Sie mit der Maus, wie in Schritt 5.7). </li></ol> 7. Biolumineszenz Quantifizierung und Bildanalyse HINWEIS: Die luminoscore Methode basiert auf Bild analysis. Sobald die Bilder wurden nach den obigen Schritten erworben wurde, kann die Quantifizierung zu jeder Zeit durchgeführt werden (einschließlich der unmittelbar nach der Übernahme), eine luminoscore jeder Maus zu jedem Zeitpunkt zu assoziieren. <ol><li> Rufen Sie das &quot;Tool-Palette&quot;, indem Sie auf das Menü &quot;Ansicht&quot; klicken und dann auf &quot;Tool-Palette&quot;, wenn nicht bereits angezeigt wird. Klicken Sie auf das &quot;ROI Tool&quot; Register der Tool-Palette. Wählen Sie die &quot;Kontur&quot; Taste und wählen Sie dann &quot;Free Draw&quot;. </li><li> Manuell markieren die Region of Interest (ROI) um die Maus durch die Kanten auf der Vorderansicht der Maus folgen. Schließen Sie die Kontur mit einem Rechtsklick auf die Computer-Maus. </li><li> Klicken Sie auf das Menü &quot;Ansicht&quot; und dann &quot;ROI-Messungen&quot;. Stellen Sie sicher, &quot;Radiance (Photons)&quot; ist in den &quot;Messtypen&quot; Scrolling-Menü auf der linken unteren Ecke des &quot;ROI-Messungen&quot; Fenster ausgewählt. Wenn nicht, wählen Sie es aus. Dann messen die Photonen flux (ph / s) durch Aufzeichnen der Wert in der &quot;Total Flux [p / s]&quot; -Box. HINWEIS: Verwenden Sie Radiance oder andere Gerät nicht, die der ROI-Oberfläche ist relativ. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 7.2) und 7.3) für die Rückansicht. </li><li> Addieren Sie die beiden Flusswerte Photon von Vorder- und Rückansicht erhalten. Das Ergebnis ist die luminoscore. </li><li> Vergleichen Sie die Werte für jede Gruppe eine entsprechende Statistik - Test (nicht-parametrischer zweiseitigen Mann-Whitney - Test, zum Beispiel) 14. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die Lichtabsorption von Organen und Geweben bleibt eine Einschränkung der Biolumineszenz-Bildgebung, obwohl diese Einschränkung auf jede optische Bildgebungsverfahren zu eigen ist. Im Rahmen unseres Ansatzes, die Auswirkungen der anatomischen Strukturen auf der luminoscore erwartet geringe Variabilität haben vorgesehen, dass die Studien in einem bestimmten Modell durchgeführt werden (Standort-und-Maus-Strang), so dass dann Vergleiche. Biolumineszenz nicht Anregungslicht benötigen und somit mehr in - vivo - Bildgebung als Fluoreszenz ganzen Körper angepasst. Die räumliche Auflösung ist auch eine Begrenzung der Biolumineszenz-Bildgebung und genaue Lage des Organs, von dem Biolumineszenz-Photonen emittiert werden, bleibt schwierig. gute Kenntnisse des Modells kann jedoch in der qualitativen Lage der Tumorstellen helfen. Der einzige Ausgang in diesem Biolumineszenz basierende Methode ist die luminoscore. Standort beeinflusst nicht die luminoscore weil die manuelle Aufschlags Region Interest (ROI) deckt die gesamte Maus. Schließlich erfordert Glühwürmchen-Luciferase Sauerstoff. Dementsprechend Biolumineszenz-Bildgebung in der Regel unterschätzt nekrotischen Tumoren. Wiederum eine gute Kenntnis dieser Aspekt des Modells erforderlich ist. In diesem Papier wollen wir nicht auf die Wirksamkeit von CpG als Anti-Tumor - Medikament Beurteilung (die bereits 7,9,11 nachgewiesen wurde) , aber ein Verfahren , wodurch ein Vergleich der Biolumineszenz Datensätze zu beschreiben. Wir beschreiben in der Tat eine Methode Tumorlast zu quantifizieren helfen soll, für den Vergleich verschiedener Tests an verschiedenen Orten zu unterschiedlichen Zeiten die Akquisitionsprotokoll standardisieren und erfordert keine Computerberechnungen. Um Reproduzierbarkeit und korrekte Photonenfluss Quantifizierung zu gewährleisten, muss die Abbildungsvorrichtung mit einer Licht Referenz für hausgemachte Geräte kalibriert werden oder wie vom Anbieter für kommerzielle Geräte empfohlen. Unser Protokoll erfordert eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf mehrere kritische punkte: (i) Erstens ist die Qualität der Maus Anästhesie entscheidend klare Bilder zu erhalten, insbesondere in Fällen, bei langen Belichtungszeiten. (Ii) Die Quantifizierung Einheit muss immer sein, der Photonenfluss, weil Glanz auf der Oberfläche jeder Maus hängt und könnte für den Vergleich verschiedener Mäuse irrelevant. (Iii) Die Biolumineszenz Bilder müssen nicht gesättigte Pixel enthalten, da diese würde Bias die luminoscore. (iv) Vorder- und Rückseite Erwerb sind verpflichtet , alle Photonen , die von der Tumorstelle emittiert wird, zu sammeln (dh kann vordere Erwerb nicht unbedingt erkennen Photonen von der Rückseite des Tumors). Verschiedene ROI Zeichnungen wurden während der Entwicklung des luminoscore Methode getestet. Nur die manuelle mark-up ergab zufriedenstellende Ergebnisse, die wahrscheinlicher sind statistisch signifikant (Daten nicht gezeigt). Inoue et al. empfehlen kg eine Luciferin Dosis von 75 mg / 13. Durch die Verwendung einer Dosis von 150 mg / kg statt, den Zeitpunkt der Bildgebung nach demLuciferin Verwaltung bleibt unverändert und wir stellen sicher, dass das Plateau während einer langen Belichtungs Erwerb dauert. Luciferin muss das überschüssige Reaktanden während des Akquisitionsprozesses sein. Je nach Modell kann die Region von Interesse angepasst werden, wie wir in der SCL - Modell zeigte , wo wir zwei ROI pro Tier zog. Im SCL - Modell, die Behandlung injiziert wird , wenn der Tumor 0,5 cm im größten Durchmesser erreicht Variabilität zu begrenzen von Verpflanzung. In Abhängigkeit von den Mäusen, könnte der Tumor unterschiedlich gewachsen. Zur Standardisierung und vergleichen Mäuse, haben wir beschlossen, ein Verhältnis zwischen behandelten und nicht behandelten Seite zu verwenden, um das relative Wachstum beider Flanken Tumoren aufdeckt. Wenn kein Signal von einer injizierten Maus beobachtet wird erwartet, positiv zu sein, entweder (i) die Anzahl der Zellen ist sehr gering, und das Signal unter der Erfassungsschwelle liegt; oder (ii) fehlt der Maus Sauerstoff und erfordert eine sofortige Versorgung. Mehrere der quantitative bioluminescrenz Analysen von verschiedenen Autoren erfordern komplexe Berechnungen und Instrumente (zB 3D - Biolumineszenz - Tomographie) zu nähern , die absolute Quantifizierung der emittierten Photonen Biolumineszenz 5,15 beschrieben. Es gibt keinen Konsens über ein Verfahren zur Biolumineszenz reproduzierbar zu quantifizieren, insbesondere in Tumormodellen, mit einem 2D-Imager Biolumineszenz. Unser Ziel war es, die Bildaufnahme-Protokoll zu begrenzen Benutzer-Abhängigkeit zu standardisieren. Die Injektion von CpG in situ nach der Tumor - Inokulation der Tumorlast in beiden Modellen verringert. Die luminoscore Methode kann als Werkzeug dienen, um die Tumorlast in anderen Modellen von Tumor Immuntherapien überwachen. Tumorlast Überwachung stellt eine nicht-invasive Methode, die unser Verständnis von Tumorwachstum und Metastasierung Mechanismen, ohne sich mit der Tumor-Mikroumgebung zu verbessern. Die Identifizierung der Tiere, die tun und reagieren nicht mit dieser Methode auf die Behandlung wird durch die Überprüfung der s verstärktUccessful Tumorzellinjektion zu Beginn des Experiments. Wir zeigten hier die Anpassungsfähigkeit des luminoscore Methode in einem SCL Modell A20.IIA-luc2 Zellen. Jedoch kann dieses Verfahren auf andere Tumormodell unter Verwendung von anderen Zelllinien angepasst werden , vorausgesetzt , daß sie die Luciferase oder im Zusammenhang mit T-Zell - Studien (tumorspezifische zytotoxische T-Zellen, regulatorischer T-Zellen, etc.) exprimieren. Die Überwachung von in vivo - Gentransfer im Zusammenhang mit der Gentherapie von seltenen Krankheiten auch die luminoscore Methode durchgeführt werden konnte. Schließlich zeigen die Daten, dass die Biolumineszenz-basierte luminoscore Verfahren Vergleiche zwischen Experiment ermöglicht, bietet Flexibilität und Anpassungsfähigkeit an spezifische experimentellen Anforderungen und ist ein nützliches Werkzeug für die nichtinvasive Längs präklinischen Studien.

Frühe Tumorzelldetektion bleibt eine Herausforderung und ist von entscheidender Bedeutung für die Krebsbehandlung Wirksamkeit verbessert wird . In - vivo - Biolumineszenz - Bildgebung (BLI) ist eine sehr empfindliche, nicht - invasive optische Technik, die weithin für die Überwachung von Tumoren bei Kleintieren eingesetzt. Glühwürmchen - Luciferase-exprimierenden Zellen werden für solche Experimente 1,2 verwendet. Diese Oxygenase oxidiert D-Luciferin mit molekularem Sauerstoff erfordert jedoch zwei Cofaktoren - Mg 2+ und Adenosintriphosphat 3. Glühwürmchen - Luciferase ist besser geeignet für in - vivo - Bildgebung als Renilla - Luciferase 4 , weil seine Quantenausbeute höher ist . Das oxidierte Substrat - Oxyluciferin - emittiert spontan ein Photon zu seiner fundamentalen Zustand zurückzukehren und dann inaktiv wird. Die emittierten Photonen haben eine maximale Wellenlänge um 530 nm. Eine hochempfindliche Kamera kann die Leuchtphotonen von der Innenseite eines kleinen Tieres erfassen und Bilder liefern, die es POSS machenIVK Tumorzellen zu lokalisieren. Die Fähigkeit, Tumorlast genau durch Photonenzählungen dienen zur Quantifizierung der Wirksamkeit der Behandlung als leistungsfähiges und empfindliches Werkzeug könnte zu quantifizieren. Weil Behandlungseffekte früher erkannt werden, kann diese Empfindlichkeit machen es möglich, den genauen Zeitpunkt zu bestimmen, an dem eine Behandlung wirksam wird. Absolute Quantifizierung der gesamten emittierten Photonen ist sehr komplex. Die Anzahl der Photonen hängt von der Tiefe des Tumors gesammelt und auf die Organe durch die Photonen emittiert werden. Korrekturkoeffizienten basierend auf Gewebeabsorptionskoeffizienten können 5, aber die absolute Quantifizierung der Tumorzellzahlen erfordert die Anzahl von Photonen , die von jeder Tumorzelle emittiert zu wissen , berechnet werden. Außerdem Luciferase - Expression, wie die von vielen Reportergene (z. B. fluoreszierende Proteine) nicht homogen ist , auch in einer Zellpopulation aus einem einzigen Klon abgeleitet 6. Die Zahl der Luciferase-Proteine ​​in Zellen kann nicht genau berechnet werden. Die Etablierung von standardisierten experimentellen Bedingungen scheint somit entscheidend für eine zuverlässige semi-quantitative Analyse. Wir wendeten die luminoscore Methode auf zwei verschiedene Maus - Lymphom - Modelle 7.8.9. In diesen Modellen sind syngene Tumorzellen in das Auge injiziert oder unter die Haut zu erhalten, die jeweils eine primäre intraokulare Lymphom (PIOL) Modell und ein subkutanes Lymphom (SCL) Modell. In jedem dieser orthotope Modellen wird die Behandlung in situ verabreicht, sieben Tage nach der Tumor - Inokulation für PIOL und wenn der Tumor 0,5 bis 0,7 cm in ihrem größten Durchmesser für SCL erreicht hat. Wir verwendeten die luminoscore Verfahren die Auswirkungen von in situ CpG - Therapie zu überwachen, vorher wirksamen 7,10,11 erwiesen. CpG ist eine Oligonukleotidsequenz und einem Liganden von TLR9, das wiederum ein intrazellulärer Rezeptor durch zahlreiche ce exprimiertenlls des Immunsystems, einschließlich dendritischen Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten und natürlichen Killerzellen. CpG-DNA ist ein 20-mer-DNA-Sequenz, die das CpG (CG) immunstimulatorischen Motiv enthält; die Steuerung (ODN-Kontrolle) ist die gleiche 20-mer DNA-Sequenz, mit der Ausnahme, dass die immunstimulatorischen CG-Sequenz invertiert wird (GC). TLR9 Engagement im Maus - Lymphom wir studieren induziert Apoptose 10, aktiviert das Immunsystem 12 und reduziert dadurch deutlich Tumorbelastung 7,11. Hier beschreiben wir eine standardisierte Methode zur Quantifizierung von Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung durch Biolumineszenz Bilder. Dieses Verfahren beruht auf verschiedene Aspekte des Bildgebungsverfahrens, von der Erfassung bis zur Analyse, die Zuverlässigkeit zu optimieren, Reproduzierbarkeit, nicht-Benutzerabhängigkeit, und die statistische Signifikanz. Ein Biolumineszenz-Quantifizierungsindex wird jeder Maus zurückgeführt; nicht nur zwischen den Tieren, sondern al kann dieser Wert, der wir eine luminoscore nennen, verglichen werdenso zwischen den Experimenten. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf die Biolumineszenz-Bildgebung Verfahren sowie die Bild Quantifizierung durch die luminoscore Methode. Wir zeigen die Wirksamkeit dieser Methode für die Injektions Verifizieren, Überwachung der Tumorbelastung, und die Beurteilung der Wirksamkeit von in situ Behandlung von Krebs. Jeder dieser Punkte wird in repräsentative Ergebnisse aus Experimenten dargestellt mit verschiedenen Mausmodellen die Anpassungsfähigkeit des luminoscore Methode zu markieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CpG 1826</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT 
			Catalog number: tlrl-1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ODN 1826 control</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT 
			Catalog number: tlrl-1826c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin potassium salt</td>
			<td>Interchim</td>
			<td>Catalog number: FP-M1224D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Virbac, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazin</td>
			<td>Bayer Healthcare</td>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A20.IIA-luc2 cell line</td>
			<td></td>
			<td>A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 
			(Promega E1310)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Balb/cByj</td>
			<td>Six-weeks old females from Charles River</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS lumina Biolumienscence imager</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software (opensource)</td>
			<td>R-project</td>
			<td>Used for statistic tests</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Precision Serynge 10&#181;L&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Product number 7642-01100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Lacrinorm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Stemi 305</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Die Luminoscore Methode kann die Injektion der Tumorzellen Überprüfen Serve Bei Modellen, die Injektion von einer kleinen Zahl von Tumorzellen, oder wenn die Injektionsstelle nicht zulässt visuelle Überprüfung der Injektions beteiligt, kann es sehr schwierig sein, die Qualität der Einspritzung sicherzustellen. Die luminoscore Methode dient als schnelles und bequemes Werkzeug, um die Qualität des Verfahrens zu überprüfen und festzustellen, leicht und schnell, dass alles funktioniert hat. In beiden Modellen ist der Tumor nachweisbar bereits 10 min nach der Injektion (1A). Die Bilder allein ausreichen, dass Tumorzellen in der richtigen Stelle vorhanden sind, zu überprüfen. eine Vorstellung von der Heterogenität der Injektions Dennoch bietet die Bilder zu quantifizieren. Das Punkt - Diagramm (Abbildung 1B) zeigt deutlich einen Unterschied zwischen Tieren , die (schwarze Punkte) erhalten und nicht wiederCEIVE (rote Linie) Injektionen. Interessanterweise ist das Signal in der SCL-Modell erhaltenen 100-mal höher als in der PIOL Modell; Dieser Befund ist mit der Anzahl der Zellen injiziert (5 x 10 6 und 1 × 10 4 Zellen) konsistent. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53609/53609fig1.jpg" /> Abbildung 1. Überprüfung der Injektion in verschiedenen Maus - Lymphom - Modelle. Die luminoscores gemessen 10 min nach der Tumorzellinokulation in verschiedenen Lymphom - Modelle. (A) Repräsentative Bilder der beiden Modelle. (B) Luminoscore jedes Tier in den verschiedenen Modellen. Die rote Linie entspricht der mittleren Hintergrundrauschen gemessen an 10 Tieren vor Tumorzellinokulation; die gepunkteten Linien sind der Mittelwert +/- Standardabweichung. Für jedes Modell werden alle Tiere können vom Hintergrundrauschen unterschieden werden. Im PIOL Modell, 1 x 10 4 Zellen waren INOClierten in den Glaskörper des rechten Auges und in der SCL - Modell, 5 x 10 6 Zellen subkutan in jede Flanke der Maus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53609/53609fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53609/53609fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Die Überwachung der Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung Die luminoscore ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug für das Tumorwachstum und die Wirksamkeit der Behandlung zu studieren. 2A zeigt repräsentative Bilder der Überwachung von Tumorwachstum in der Kontrolle und der behandelten CpG PIOL Gruppen. Die Mäuse wurden mit 1 x 10 4 Tumorzellen inokuliert , jeweils, und die Behandlung wurde in situ an Tag 7. Die Bilder zeigen , dass verabreicht , nachdem eine ausreichende Zeit (28 Tage), Metastasen in der Kontrollgruppe zu erscheinen begann. Obwohl der primäre Tumor auf die Behandlung nicht empfindlich erscheinen, wenigerMetastasen wurden in der CpG-behandelten Gruppe (Tabelle 1) beobachtet. Die quantitative Analyse der Tumorlast in jeder Gruppe (2B) zeigt , dass CpG Tumorentwicklung verlangsamt, einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der behandelten Herstellung und der Kontrollgruppe nach 28 Tagen (nicht-parametrischer two-tailed Mann-Whitney - Test p = 0,0079 ). Dennoch wuchsen die Tumoren noch in den behandelten Mäusen, und keiner von ihnen überlebten (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Berichten: CpG hat keine signifikanten Auswirkungen auf die primäre Augentumoren 10. Der wesentliche Effekt, den wir hier zwischen dem ODN und dem CpG-Gruppe haben kommt von der Metastasierung Wachstumshemmung. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53609/53609fig2.jpg" /> Abbildung 2. Überwachung der Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung. (A) Repräsentative Bilder der beiden Gruppen (ODN-Steuerung und CpG-behandelt) of PIOL tragenden Mäusen. (B) Die Überwachung der Tumorlast mit dem luminoscore. Wie auf dem Punktdiagramm zu sehen ist, signifikant die Wirkung von CpG auf der luminoscore am Tag 28. In diesen beiden Gruppen gemacht dieses Verfahren es möglich, Tumorlast zu überwachen und die leichte, aber signifikante (p = 0,0079) Wirkungen von CpG zu messen DNA, die durch Bilder nicht allein erkennen konnte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53609/53609fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53609/53609fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Gruppen </td><td> Maus </td><td> Das Vorhandensein von Metastasen </td><td> Ort </td><td> Photonenfluss (ph / s) </td></tr><tr><td rowspan="5"> CpG </td><td> 1 </td><td> Nein </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> 2 </td><td> ja </td><td&gt; Eye-Trockenlegung lymp Knoten </td><td> 9.32E + 05 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Nein </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Nein </td><td> X </td><td> X </td></tr><tr><td> 5 </td><td> ja </td><td> Eye-Trockenlegung lymp Knoten </td><td> 2.21E + 07 </td></tr><tr><td rowspan="5"> ODN </td><td> 1 </td><td> ja </td><td> Eye-Trockenlegung lymp Knoten </td><td> 1.06E + 07 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> ja </td><td> Eye-Trockenlegung lymp Knoten </td><td> 7.25E + 07 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> ja </td><td> Eye-Trockenlegung lymp Knoten + kontralateralen </td><td> 7.64E + 08 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> ja </td><td> Eye-Trockenlegung lymp Knoten + kontralateralen </td><td> 1.74E + 09 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> ja </td><td> Eye-Trockenlegung lymp Knoten + kontralateralen </td><td> 9.76E + 07 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Ter Luminoscore Verfahren kann auf verschiedene Ansätze angepasst werden Die luminoscore Verfahren ist nicht auf eine einzige Art von Mausmodell beschränkt. 3 zeigt , dass es an verschiedene Mausmodelle angepasst werden. In der SCL-Modell werden zwei Tumoren auf jeder Seite der Maus transplantiert. Die Behandlung wird in situ auf einer einzigen Seite an Tag 0 und die kontralaterale Tumors dient als Kontrolle (3A) verabreicht. Daher wurden zwei ROI pro Maus gezogen: eine für jede Seite (3C). Das Verhältnis zwischen der luminoscore auf den behandelten und Kontrollseiten beschreibt die relative Verlauf jedes Tumors. Dieses Verhältnis wurde auf 1 gesetzt, am Tag 0, wenn die Behandlung verabreicht wurde. Wir beobachteten eine signifikante Abnahme in diesem Verhältnis 13 Tage nach der Behandlung Verwaltung (3D; nichtparametrischer zweiseitigen Mann-Whitney - Test p = 0,004). Dieser Rückgang zeigt, dass die behandelte seitige Tumorwurde als auf den repräsentativen Biolumineszenz Bilder (3B) gezeigt resorbiert. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53609/53609fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Anpassung der Luminoscore Methode zu einem Modell mit zwei primären Tumorstellen. (A) Experimentelle Gestaltung eines SCL - Test. Die Mäuse wurden mit zwei primären Tumoren in jede Flanke injiziert. Einer Seite eingespritzt wird entweder mit CpG-DNA oder ODN-Steuerung, und die andere Seite mit PBS als Kontrolle zu dienen. (B) Repräsentative Bilder von CpG-behandelten und Kontrollmäusen am Tag 0 und Tag 13. Die Behandlung wurde verabreicht am ersten Tag wurde 0. Das Tumorwachstum auf dem CpG-behandelte Seite der Maus gesperrt. (C) Das markiert manuell Regionen von Interesse pro Tier für zwei primäre Tumorstellen. (D) Das Verhältnis zwischen den luminoscores des CpG-behandelt oder ODN-Steuerseite und die Steuerseite PBS ist ein Index,spiegelt die relative Wachstum jedes Tumors innerhalb des gleichen Tieres. Dieses Verhältnis gesetzt wurde auf 1 am Tag 0. Am Tag 13, das Verhältnis der CpG-behandelten Gruppe signifikant gesunken war (p 0,004 =), durch die Verabreichung von CpG-DNA in situ Hemmung des Tumorwachstums enthüllt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53609/53609fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um zu sehen eine größere Version dieser Figur.</a>

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Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Biolumineszenz-Bildgebung ist ein bekanntes Werkzeug für Tumoren und Metastasen zu lokalisieren, aber Quantifizierung dieser Bilder erfordert oft komplexe Berechnungen und bestimmte Instrumente. Wir beschreiben die einfach zu bedienende luminoscore-Methode, basierend auf genauen Aufnahmebedingungen, keine Berechnungen erfordern, und ermöglicht die Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung in Mausmodellen beobachtet werden.

Biolumineszenz-basierte Tumor Quantifizierung Verfahren zur Überwachung Tumorprogression und Therapieeffekte bei den Maus-Lymphom-Modelle

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

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Serie: Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Forschung

Medizin

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA approved in April 2011 for the treatment of patients 22 years or older with rGBM. The device delivers alternating electric fields and is programmed to ensure maximal tumor cell kill1.
Glioblastoma is the most common type of glioma and has an estimated incidence of approximately 10,000 new cases per year in the United States alone2. This tumor is particularly resistant to treatment and is uniformly fatal especially in the recurrent setting3-5. Prior to the approval of the TTF System, the only FDA approved treatment for rGBM was bevacizumab6. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody targeted against the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein that drives tumor angiogenesis7. By blocking the VEGF pathway, bevacizumab can result in a significant radiographic response (pseudoresponse), improve progression free survival and reduce corticosteroid requirements in rGBM patients8,9. Bevacizumab however failed to prolong overall survival in a recent phase III trial26. A pivotal phase III trial (EF-11) demonstrated comparable overall survival between physicians&#8217; choice chemotherapy and TTF Therapy but better quality of life were observed in the TTF arm10.
There is currently an unmet need to develop novel approaches designed to prolong overall survival and/or improve quality of life in this unfortunate patient population. One appealing approach would be to combine the two currently approved treatment modalities namely bevacizumab and TTF Therapy. These two treatments are currently approved as monotherapy11,12, but their combination has never been evaluated in a clinical trial. We have developed an approach for combining those two treatment modalities and treated 2 rGBM patients. Here we describe a detailed methodology outlining this novel treatment protocol and present representative data from one of the treated patients.

A novel methodology that is employed for the treatment of recurrent glioblastomas is described. This treatment approach employs the application of alternating electric tumor treating fields (TTFields), known as TTF Therapy in combination with bevacizumab, a targeted agent that is currently FDA approved as monotherapy.

Tumor Behandlung Feldtherapie in Kombination mit Bevacizumab für die Behandlung von rezidivierendem Glioblastom

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key element is the quantitative determination of a tumor-specific genetic alteration in relation to a universal sequence using a dual-probe digital PCR assay and the subsequent calculation of the proportion of tumor cells. The assay is carried out on a culture containing tumor cells of an established line and spiked-in non-tumor cells. The mixed culture is treated with a test drug at various concentrations. After the treatment, DNA is prepared directly from the survived adhesive cells in wells of 96-well plates using a simple and inexpensive method, and subjected to a dual-probe digital PCR assay for measuring a tumor-specific genetic alteration and a reference universal sequence. In the present demonstration, a heterozygous deletion of the NF1 gene is used as the tumor-specific genetic alteration and a RPP30 gene as the reference gene. Using the ratio NF1/RPP30, the proportion of tumor cells was calculated. Since the dose-dependent change of the proportion of tumor cells provides an in vitro indication for specificity of the drug, this genetic and cell-based in vitro assay will likely have application potential in drug discovery. Furthermore, for personalized cancer-care, this genetic- and cell-based tool may contribute to optimizing adjuvant chemotherapy by means of testing efficacy and specificity of candidate drugs using primary cultures of individual tumors.

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

The goal of this protocol is to assess specificity of anticancer drugs in vitro using mixed cultures containing both tumor and non-tumor cells.

Die Beurteilung Spezifität von Anti-Krebs-Medikamente<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Biolumineszenz-basierte Tumor Quantifizierung Verfahren zur Überwachung Tumorprogression und Therapieeffekte bei den Maus-Lymphom-Modelle

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133

A Novel Hochauflösende

^In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

Tumor Behandlung Feldtherapie in Kombination mit Bevacizumab für die Behandlung von rezidivierendem Glioblastom

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Die Beurteilung Spezifität von Anti-Krebs-Medikamente