Die Mehrheit der Arbeit wurde an der UMCG Mikroskopie und Imaging Center (UMIC) durchgeführt, die von NWO 175-010-2009-023 und ZonMW 91.111.006 gefördert wird; STW &quot;Mikroskopie-Tal 12718&quot; zu BNGG. Diese Arbeit wurde von einem ZonMW VENI Zuschuss gefördert, eine Marie-Curie-Karriere Eingliederungszuschuss (Einsparung sterbende Neuronen) und einer Alzheimer Nederland Gemeinschaft zu TJvH

Alle Versuche mit Zebrabärblingembryonen wurden von der Tierversuchskommission der Universität von Groningen nach nationalen und EU-Richtlinien zugelassen. 1. Probenvorbereitung <ol><li> Fixation and Embedding <ol><li> Fixierung <ol><li> Betäuben Fischlarven in Tricaine (0,003%) hinzugefügt , um die E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 10 mM HEPES, pH 7,6) Zebrabärbling Wasser und Test für die Tiefe der Anästhesie durch leichtes Stoßen mit einer 200 ul Pipettenspitze unter dem Mikroskop Dissektion , bis die Beweglichkeit nicht mehr erkannt (Abbildung 1A). </li><li> Bei der Bearbeitung von Proben für die korrelative EM nach in vivo Bildgebungsdatenerfassungs mittels konfokaler oder 2 Photon Imaging in 1,8% Agarose wie beschrieben, 5,15 fix Larven in Agarose mit 4% PFA in PBS , das Triton-X-100 (0,05%). </li><li> Schneiden Sie Larven aus Agarose und Verfahren fürGroß EM 5. </li><li> Fix Larven in frischem 4% Paraformaldehyd in PBS, das Triton-X-100 (0,05%) für 2 h bei Raumtemperatur in Kunststoffröhrchen. Hinweis: Zellen in Kultur gezüchtet (in vitro) kann direkt in Glutaraldehyd fixiert werden, wie im nächsten Schritt (1.1.1.5). </li><li> Entfernen Lösung und mit 100 &amp; mgr; l 0,5% PFA, 2% Glutaraldehyd (GA) und 0,1 M Natriumcacodylat (pH 7,4). Lagern über Nacht bei 4 ° C. Rinse Proben zweimal in 0,1 M Natriumcacodylat. </li><li> Schneiden larvalen Köpfe rostral zur hindbrain Eindringen von Osmium zu erleichtern. Verwenden feinen Spritzen / Zange. </li><li> Postfix - Larven in 1% Osmiumtetroxid (OsO 4) /1.5% Kaliumferrocyanid (K 4 [Fe (CN) 6]) in 0,1 M Natriumcacodylat auf Eis für 2 Stunden und Spülen 3 x 5 min in bidestilliertem H 2 O. </li><li> Entwässern in Ethanol durch 20 min Inkubation in steigenden Ethanolkonzentrationen (50%, 70%, 3 x 100%). </li></ol></li><li>Verankerung <ol><li> Bereiten Epoxidharz nach Standardrezepturen in EM-Labors eingesetzt. Hinweis: Wir verwenden Epoxidharz wie folgt: mix 19,8 g glycid Ether 100, 9,6 g 2-Dodecenylbernsteins Säureanhydrids und 11,4 g Methylnadinsäureanhydrid einen Magnetrührer. In 0,5 g DMP-30 (Tris- (dimethylaminomethyl) phenol) und wieder mischen. </li><li> Larven über Nacht in 50% Epoxyharz in Ethanol (v / v) Inkubieren während des Drehens (RT). </li><li> Ersetzen verdünnte Epoxy-Harz mit reinem Harz. Inkubieren für 30 Minuten, fügen Sie frisches Harz wieder und Inkubation für weitere 30 min. Wieder das Harz aktualisieren und dann 3 h bei RT, 15 min bei 58 ° C und noch 1 h bei RT unter niedrigem Druck (200 mbar) und anschließend inkubieren. </li><li> Richten Sie die Köpfe in handelsüblichen Silizium flach Einbettschälchen unter einem Präpariermikroskop mit einer Nadel oder Zahnstocher mit dem vorderen Blick auf die Seite der Form oder nach Bedarf (1B). </li><li> Polymerisieren Epoxy-resin bei 58 ° C über Nacht. Wenn Epoxidharz an einem anderen Tag noch zu weich erlauben ist zu polymerisieren und bei 58 ° C aushärten. Test-Steifigkeit durch Druck mit einer Pinzette Anwendung. Wenn dies leicht lässt eine Vertiefung an einem anderen Tag erlauben bei 58 ° C zu polymerisieren und zu härten. Wenn Probe vollständig ausgehärtet ist, um Trimmen und Schneiden fortzufahren. </li><li> Abschneiden von überschüssigem Harz von den Stub Verwendung Rasierklingen (1B). </li></ol></li></ol></li><li> Sectioning, der Kontrast und die Montage <ol><li> sectioning <ol><li> Abschnitt Epoxidharz Block ein Ultramikrotom verwenden. </li><li> Verwenden Sie ein Glas Messer oder einen Diamanten histoknife zu schneiden Semidünnschnitten (500 nm) für Toluidinblau / Basisfuchsinlösung (1D) Färben der richtige Positionierung zu erkennen. </li><li> Übertragen Semidünnschnitten auf Objektträger, indem sie sie mit einem Glas Pasteur-Pipette, deren Spitze in einer Flamme durch Schmelzen geschlossen wurde Kommissionierung. Trocknen auf einer heißen Platte until kein Wasser gelassen wird. Fleck für 10 sec mit 1% Toluidinblau in Wasser auf einer heißen Platte und nach 10 sec mit 0,05% basischem Fuchsin in 1% Natriumtetraborat mit Wasser, Beize Spülen. Untersuchen Sie mit einem normalen Lichtmikroskop mit 10facher bis 40facher. </li><li> Wenn die richtige Stelle / Orientierung im Gehirn erreicht wird, weiterhin die Epoxidharz - Block mit einem Diamantmesser sectioning ultradünne Schnitte zu schneiden (~ 70 nm; 1E) </li><li> Verwenden Sie leicht identifizierbare anatomische Strukturen in und um das Gehirn, einschließlich Riechgruben, Augen, grau-weißen Substanz Grenzen, die Region von Interesse zu identifizieren während Ultradünnschnitt und die Schneidewinkel einzustellen, wenn die Probe gekippt wird. </li><li> Abschnitt Montage auf Single - Slot - L2 x 1 Kupfergitter (Abbildung 1F), mit dem Erwerb von Gitterstäben ohne Unterbrechung zu ermöglichen. Verwenden Sie Formvar beschichteten Gitter die Abschnitte zu unterstützen. </li></ol></li><li> kontrastierend <ol><li> Stain ultradünne Schnitte auf dem Gitters für 2 min in 2% Uranylacetat in Methanol durch Reynolds gefolgt Bleizitrat für weitere 2 min 16. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Image Acquisition <ol><li> Large Scale STEM Hinweis: Wir verwenden Scan - EM mit einem externen Scan - Generator kann mehrere große Sichtfelder mit hoher Auflösung zu erwerben 3,5,7,17 ​​STEM - Detektion. Typischerweise erzeugt ein Bild auf diese Weise auf die Sichtfelder von ~ 100 Transmissionselektronenmikroskop (TEM) -Bilder äquivalent ist, signifikant die Menge des Nähens zu verringern. <ol><li> Montagebeispiel in Mikroskop <ol><li> Platzieren Sie Gitter mit Abschnitt in der mehrere Gitterprobenhalter und Transfer in die Kammer des SEM. </li></ol></li><li> Die Ausrichtung des STEM - Detektor <ol><li> Setzen Sie das Gitter mit der Probe unter dem Balken und bewegen Sie ihn auf, so dass es etwa sein wird. 5 mm von der Linse Pol. Erwerben Sie ein Bild bei 20 kV unter Verwendung vondie in-Objektiv-Detektor. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf Gitterkante und passen bis 4,0 mm Arbeitsabstand. </li><li> Bewegen Sie den Probenhalter in eine sichere Position und bringen in den STEM-Detektor. </li><li> Zentrieren Sie das Loch des STEM-Detektor in dem Bildfeld durch die Anpassungen Schrauben während Bildgebung bei maximaler Geschwindigkeit mit dem in-lens-Detektor drehen. </li><li> bringen Sie vorsichtig den Probenhalter zurück, die zwischen dem Objektiv Pol und dem Detektor gerade passt. </li><li> Erwerben Sie ein Bild mit dem in-lens-Detektor sicher sein, auf der Schnittfläche zu sein. </li><li> Wechseln Sie in den MINT-Detektion (Verstärkungsmedium und alle setzen Quadranten auf &quot;minus&quot;) und ein Bild erwerben und wählen Sie den zu scannenden Bereich. </li><li> Heben Beschleunigungsspannung bis 21 kV und warten auf eine Stabilisierung des Strahls (stabiles Bild wieder) und dann bis 29 kV in Schritten von 2 kV gehen. </li></ol></li><li> Aufnehmen von Bildern <ol><li> die Probe Pre-bestrahlen (Helligkeitsänderungen durch den E-Strahl verursacht werden) durch Zoomenaus, so dass die gesamte Fläche zu scannende passt das Bildfenster. </li><li> Ändern Öffnung bis 120 &amp; mgr; m (um den richtigen Dynamikbereich die Detektor Gewinne müssen einen Schritt reduziert werden). </li><li> De-Fokus so dass das Bild unscharf wird. </li><li> Machen Sie den Scan-Bereich so dicht wie möglich an die reduzierte Fläche Scan-Option. </li><li> Stellen Sie Scan-Geschwindigkeit, so dass ein Rahmen in ca. abgetastet wird. 1 bis 2 Sekunden. Hinweis: Je nach der Größe und der Gewebe dieses typischerweise dauert ½ h (100 x 100 um FOV) zu bis zu 3 h (1,000 x 500 um). </li><li> Zoom mindestens 100X in und um nur einen kleinen Bereich für 10 Sekunden. Hinweis: Wenn dieser Bereich nicht Helligkeit ändert sich im Vergleich zu seiner Umgebung, vor der Bestrahlung ist ausreichend. </li><li> Bringen Sie die 30 &amp; mgr; m Öffnung zurück (und STEM Gewinn mittel) </li><li> Fokus auf die Probe. </li><li> Richten Sie Öffnung der Wobbler (bei ~ 40.000facher Vergrößerung) verwendet wird. </li><li> Während im Fokus der hellste Bereich / Funktion wählen, Scan-Geschwindigkeit eingestellt, dass Detailssichtbar sind. </li><li> Im Mikroskop-Software stellen Sie die Helligkeit und den Kontrast, indem Sie vorsichtig das Histogramm beobachten alle Pixel im dynamischen Bereich zu halten. Machen Sie dasselbe für den dunkelsten Bereich / Funktionen. </li><li> Zurück zum hellen Bereich und erneut prüfen. Seien Sie auf der sicheren Seite, so gibt es etwas Platz auf beiden Seiten des Histogramms ist. </li><li> Verkleinern, so dass die gesamte Fläche, um das Abbildungsfenster gescannt passt, und starten Sie den großen Bereich Akquisitionsprogramm. </li><li> Verwenden Sie den Assistenten Option, um ein Mosaik einzurichten durch einen Bereich auf dem Bildschirm auswählen. Verwenden Sie Pixel-Größe 2 - 5 nm je nachdem, was Details sind notwendig. Verwenden Sie Verweilzeit 3 ​​&amp; mgr; s für STEM. </li><li> Wählen Sie die Option &quot;Autofokus auf vorherige Fliese&quot;, verwenden Sie die groß angelegte Erfassungssoftware Autofokus mit Standard-Firmeneinstellungen, Kontrollkästchen &quot;überprüfen vor der Ausführung der Einstellung&quot; und definieren, wo die Daten zu speichern. </li><li> Drücken Sie &quot;optimieren&quot; Mikroskop-Einstellungen zu überprüfen. Hinweis: Jetzt wird die benötigte Zeit sein shbesitzen. Dies kann bis zu 1 x 0,5 mm Bereiche bis 72 h betragen. </li><li> Im Fenster &quot;maximale Kachel Auflösung&quot; Typ 20.000 so einzelne Fliesen werden nicht größer als 20k x 20k, verhindert stumpfe Randeffekte. Drücken Sie auf &quot;Ausführen&quot;. </li><li> Wenn für die Überprüfung Fokus und Helligkeit / Kontrast (B / C) aufgefordert, schalten Sie Generator externe Scan und sorgfältig Fokus und Astigmatismus in der Mikroskop-Software einstellen. Nicht B / C ändern. Hinweis: Die Bühne bewegt werden kann und die Vergrößerung geändert, aber Vergrößerung muss wieder auf die gewünschte Pixelgröße eingestellt werden. </li><li> Schalten Sie externe Scan-Generator wieder ein und drücken Sie auf &quot;weiter&quot;. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse <ol style="margin-left: 40px;"><li> Öffnen Sie groß angelegte EM-Datei-Viewer-Programm und öffnen Sie die Datei &quot;Mosaik-Info&quot;. Dies öffnet alle gekachelten tif-Dateien. Diese ist vorzugsweise auf einem anderen Arbeitsplatz durchgeführt, um keine neuen Akquisitionen behindern. </li><li> Wählen Sie die Option &#39;augesamte Mosaik zum Aufnähen (Parameter überlappen Modus auf die Hälfte, Schwellen näht 0,90, Rauschunterdrückung automatisch. Bei Heft Kriterien nicht in und manuell Fliese in Position zu bringen erfüllt, Zoom und klicken Sie auf &quot;weiter wie &#39;). </li><li> Export als HTML-Datei, oder alternativ als einzelne TIF. Beachten Sie, dass für TIF exportieren könnte ein Downscaling benötigt werden. Fügen Sie die endgültige Pixelgröße in den Dateinamen für Messungen später. </li><li> Führen Sie Anmerkungen in der TIF-Datei, indem es in einem Bildbearbeitungsprogramm zu öffnen. Parallel dazu öffnen Sie die zoombare html-Datei in einem Web-Browser für eine optimale Auflösung Beobachtung. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

EM ermöglicht die Analyse von zellulären Kontext mit hochauflösende Abbildung von Makromolekülen in biologischen Kontext. Dies schränkt jedoch typischerweise das Sichtfeld. Größere angelegte 3D - EM ist besonders geeignet für die Zuordnung neuronaler Konnektivität durch nanoskalige Auflösung 3 - dimensionale Rekonstruktion zu schaffen, erfordern komplexe Datenverarbeitung 10. Im Gegensatz dazu 2D großen Maßstab EM erfordert nur einen einzigen Abschnitt und Nähen der Abbildungsdaten, und die Beurteilung der Daten ist möglich, indem jeder, der Zugang zu einem Internet-Browser. Wir und andere bisher in großem Maßstab EM verwendeten Gewebe und ganze Tiere zu analysieren. Wie für die meisten Ansätze, TEM und SEM-basierte Nähte haben ihre eigenen Vorteile. Hier scanning transmission EM (STEM) verwendet, die mit einer hohen Auflösung Erzeugung einer großen Sichtfeld ermöglicht. Typischerweise ist ein STEM Bild auf die Sichtfelder von etwa 100 TEM-Bilder äquivalent, signifikant die Menge an Naht verringert wird, wenn große fiel Abbildends Sicht bei hoher Auflösung. Wenn eine höhere Auflösung benötigt wird, kann TEM vorteilhaft sein. STEM hat den Vorteil gegenüber TEM , dass nicht-kontrastiert Proben mit guter ultra Kontrast 6 verwendet werden. Zusätzlich kann das hier beschriebene Verfahren einfach für mit rückgestreute Elektronendetektion (BSD) Verwendung eingestellt werden auf Abschnitten auf Silica Wafer angebracht ist, die Verwendung auf mehrere Mikroskopsysteme zu erweitern. HTML-zoombaren Gewebe EM - Dateien sind sehr nützlich für die Quantifizierung, gemeinsame Nutzung von Daten , die zu seinem vollen Inhalt kann nicht analysiert wurden, LM und EM - Daten (CLEM) 8, Präsentationszwecke in der wissenschaftlichen Forschung kombiniert, um Patientendaten zu analysieren und für die Bildung. Alternativ kann in EM Groß in einem SEM, aber nicht in einem TEM, Silica Wafer können verwendet werden, was zwei Vorteile hat: BSD verwendet werden kann, die auf Rasterelektronenmikroskopen als STEM Detektions allgemein verfügbar ist. Zweitens Montage großer Teile (&gt; 1 mm 2 BereichenInteresse) ist einfach. Montage auf einzelnen geschlitzten Gittern ist arbeitsintensiv und technisch anspruchsvoll. Detaillierter Vergleich zwischen TEM, SEM und STEM ist an anderer Stelle 6 detailliert beschrieben. Ein Nachteil der BSD-Bildgebung ist, dass STEM verglichen, Bilder haben erhöhtes Rauschen. Dies kann teilweise durch Erhöhen der Pixel-Verweilzeit ausgeglichen werden, was zu einer viel längeren Erfassungszeiten. Obwohl für die Probenvorbereitung relativ Standard EM Verarbeitung (Fixierung, Einbettung und Schneiden) 5-7 benötigt wird, ist es technisch anspruchsvolle große ultradünne Schnitte völlig frei von Artefakten zu schneiden. Abschnitte sind sehr zerbrechlich, leicht brechen, falten oder während der Bildgebung zerstört, die in der Regel mehrere Stunden pro-Datensatz erfolgt. Da jedoch der Online-Sharing der rohen unvoreingenommene Daten sollte es möglich werden, leichter zu veröffentlichten Daten zu vergleichen und veröffentlichten Daten-Set in der offenen Domäne als Kontrollen verwendet werden. Derzeit einige EM-Geräte der Lage, large-Scale-Analyse sind im Einsatz, und daher Zugang zu dieser Technik ist etwas begrenzt, obwohl die meisten Imaging-Zentren gemeinsamen Bemühungen begrüßen. Für großflächige Abschnitte hat das Gewebe richtig in der gesamten Probe zu fixieren. Deshalb ist eine Mischung aus dem schnellen, aber moderate Fixativ PFA in Kombination mit der langsamen, aber starke Fixiermittel GA verwendet wird. Schneiden und Aufnehmen von großen Teilen ohne Artefakte ist schwierig. Arbeiten mit Wafern in Kombination mit BSD ist einfacher, im Vergleich zu den Abschnitten auf einzelne Lochgitter zu sammeln. Schwermetallpfosten Färbung ist kritischer Vergleich zu klassischen EM. Da der ganze Abschnitt jedes Artefakt wird sichtbar abgebildet wird. TEM Benutzer typischerweise finden es schwierig, ein SEM zu wechseln, wegen des Unterschieds in Mikroskopbetrieb. Quantifizierung und gemeinsame Nutzung von Daten - subzellulärer Funktionen Quantifizieren in einzelnen EM Bilder schwierig ist. Die Möglichkeit, zu vergrößern und aus GroßBilder können leicht Identifizierung von Zellen von Interesse, die von nanoskaligen Messungen innerhalb der Zellen folgen kann. Diese Datensätze zeigen, dass bestimmte Zelltypen können schnell in diesen großen Gewebeschnitten in unvoreingenommen identifiziert und quantifiziert werden, basierend auf Eigenschaften nachweisbar in verschiedenen Maßstäben. Beispielsweise Mikroglia können auf der Grundlage ihrer Morphologie und dichten Zytoplasma identifiziert werden. Anschließend, auf auf die einzelnen Zellen Zoomen, nanoskaligen subzellulärer und molekularen Eigenschaften dieser Zellen innerhalb des gleichen Datensatzes gemessen werden, wie wir zuvor für ER Breite in einem großen Maßstab EM Gewebekultur - Datensatz 2 gezeigt. Ein zusätzlicher Vorteil der nanotomy ist, dass Online von großen Datenmengen Hosting erlauben anderen, um die Daten zu überprüfen, vielleicht für andere Funktionen, und ihre Schlussfolgerungen zu neuen Hypothese ziehen. Clem - Zusätzlich zur Erleichterung der quantitativen EM, EM in großem Maßstab macht es einfacher , Licht microsco zu korrelierenpic Kennzeichnung EM Level 8. Im vorliegenden Beispiel wird das Vorhandensein von phagozytischen Mikroglia in einem Zebrabärbling Ablation Modell gezeigt. Eine wichtige Frage in den Neurowissenschaften ist es, was die einzelnen Funktionen und Beiträge sind von Mikroglia und mögliche andere Quellen von phagozytischen und Immunzellen. Frühe EM Studien haben unterscheidenden subzellulären Eigenschaften der Mikroglia bei Krankheit 18 gezeigt. Leider ist es schwierig, selektiv Mikroglia insbesondere in einem pathologischen Einstellung bezeichnen, da sie große Überlappung mit anderen Immunzellen in der Genexpression, der Morphologie und Funktion aufweisen. Daher ist es unklar, ob und wann Mikroglia auf ultrastruktureller Ebene unterscheiden sich von Immunzellen aus anderen Quellen, einschließlich Monozyten-Makrophagen abgeleiteten infiltrieren. Zu verstehen, ob es ultrastrukturellen Unterschiede zwischen diesen Zellen wird ein Ausgangspunkt für die Analyse der funktionellen Unterschiede. Die Kombination von selektiven transgenen oder Expression-Markern und Clem ermöglicht detection von ultrastrukturelle Merkmale selektiv auf bestimmte Bevölkerungsgruppen. Diagnose und Präsentation und Bildung - durch nanoskalige Visualisierung innerhalb eines einzelnen Datensatzes EM Daten zu mikroskaligen stark an ein breites Publikum erleichtert. Mit den erweiterten Möglichkeiten und Werkzeuge für die korrelative und groß angelegte EM erwarten wir eine Belebung der EM in der Grundlagen- und medizinischen Forschung. Unsere Methode , die hier dargestellt ist , an einen Zebrabärbling Hirnverletzung Modell angewendet 5, hat aber auf die menschliche Gewebe 7, Rattenhirn 3, in einem Rattenmodell für Diabetes 4 und in Zellkultur - 2, und kann auch verwendet werden in Kombination mit einem TEM verwendet -basierte Ansatz 1 die Vielseitigkeit dieses Verfahrens zeigt. Das Mikroskop Bediener nicht mehr die Aufzeichnung hoch ausgewählt, und daher voreingenommen Bilder, aber alle zahlreiche ultrastrukturelle Merkmale erfasst und offen für die weltweite Analyse.

Neue technische Entwicklungen haben die Vielseitigkeit, die Anwendbarkeit und quantitative Natur der EM verbessert, was zu einer Wiederbelebung der Ultrastrukturanalyse führt. Die Fortschritte sind 3D - EM, in großem Maßstab 2D - EM und verbesserte Verfahren und Reagenzien für korrelierte Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie (CLEM) andere Formen der mikroskopischen Analyse zum Vergleich direkt auf die EM - Ebene 8-10. Großflächige 2D-EM ist besonders geeignet zu quantifizieren oder (Roman) Krankheit Merkmale für die menschliche Pathologie identifizieren, Tiermodelle für Krankheiten und Gewebekulturmodelle untersuchen. Aufgrund der typischerweise kleinen Sichtfeld ist es schwierig, Veränderungen bei hoher Vergrößerung an ein Gewebe breiten Skala zu korrelieren, sowie unbiasedly und quantitativ ultrastrukturelle Merkmale analysieren. Für pathologische Analyse von menschlichem Gewebe oder die Beurteilung der Pathologie in Tiermodellen, Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) gefärbt Abschnitte von fixierten und in Paraffin eingebettet Formaldehyd (FFPE) tissue ist der Standard. Neben einfachen H &amp; E-Färbung Immunmarkierung auch zur Identifizierung pathologischen Anomalien durchgeführt. Wenn solche Gewebe an der EM-Ebene, spezifische Zelltypen untersucht werden konnten, und subzellulären Veränderungen identifiziert werden konnten. Die unvoreingenommene Art von großen EM ermöglicht unerwartete und neuartige Merkmale der Krankheit zu finden. Durch groß angelegte EM Bereiche Quadratmillimetern können sichtbar gemacht werden. Wir und andere vorher nanotomy angewendet Pankreasinseln 4, Zellkultur 2, Rattenhirn 3, Haut und Schleimhaut 7 und ganze Zebrabärblingembryonen 1,5 (www.nanotomy.org) an Ratten. Zebrabärblinge sind sehr gut geeignet für in - vivo - Bildgebung, in besonders Zelltypen zu visualisieren, die den Zugang in Säugetiergewebe schwer einschließlich Gehirn Immunzellen 11. Hier ist die nanotomy Verfahren wird im Detail beschrieben, angewandt auf Koronalschnitte von Zebrabärbling Köpfe unterzogen bedingten neuronalen Ablation durch Umwandlung von Metronidazol durch neuronaleausgedrückt nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alle Rohdaten werden als zoombare HTML-Dateien vorgestellt, um Änderungen Gewebe Skala molekularen Visualisierung. Die Darstellung der Rohdaten ermöglicht unvoreingenommene Analysen der Datensätze aus anderen Winkeln von Experten weltweit.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>low melting point agarose</td><td>VWR</td><td>444152G</td><td></td></tr><tr><td>tricaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Polysciences</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>sodium cacodylate</td><td>Sigma</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>osmium tetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19114</td><td></td></tr><tr><td>potassium ferrocyanide (K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;[Fe(CN)]&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>4984</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td></td></tr><tr><td>uranyl acetate&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>8473</td><td></td></tr><tr><td>sodium tetraborate</td><td>Merck</td><td>1063808</td><td></td></tr><tr><td>toluidene blue</td><td>Merck</td><td>1273</td><td></td></tr><tr><td>basic fuchsin</td><td>BDH</td><td>340324</td><td></td></tr><tr><td>lead citrate</td><td>BDH</td><td>discontinued</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EPON&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-dodecenylsuccinicacid anhydride&amp;nbsp;</td><td>Serva</td><td>20755</td><td></td></tr><tr><td>methylnadic anhydride</td><td>Serva</td><td>29452</td><td></td></tr><tr><td>glycid ether 100</td><td>Serva</td><td>21045</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>553</td><td></td></tr><tr><td>standard flat embedding mold</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>diamond knife</td><td>Diatome Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>copper grids&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>double sided carbon tape&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>scanning EM Zeiss Supra55</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultramicrotome Leica EM UC7</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>atlas external scan generator&amp;nbsp;</td><td>Fibics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale scanning transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain

Großflächige 2D-Elektronenmikroskopie (EM) oder nanotomy ist das Gewebe weite Anwendung nanoskaliger Auflösung Elektronenmikroskopie. Andere und wir bisher angewandten großen Maßstab EM auf die menschliche Haut Pankreasinseln, Gewebekultur und ganze Zebrabärblingembryonen 1-7. Hier beschreiben wir ein universell anwendbares Verfahren für das Tissue-Skala Scanning EM für unvoreingenommene Erkennung von Unter zellulären und molekularen Eigenschaften. Nanotomy wurde angewendet, um die gesunde und eine neurodegenerative cerebra- zu untersuchen. Unsere Methode basiert auf standardisierten EM Probenvorbereitung Protokolle: Fixierung mit Glutaraldehyd und Osmium, gefolgt von Epoxy-Harz Einbettung, Ultradünnschnitt und Montage von ultra-dünnen Schnitte auf ein Lochgitter, gefolgt von Post-Färbung mit Uranylacetat und Blei. Großflächige 2D-EM Mosaikbilder werden mit einem Scannen erfassten EM an einen externen großen Bereich Scan-Generator mit Raster-Transmissions-EM verbunden (STEM). Groß angelegte EM-Bilder sind in der Regel ~ 5-50 G Pixel in Größe und am besten mit diesen zoombaren HTML-Dateien, die in einem beliebigen Web-Browser, ähnlich wie Online-geographischen HTML Karten geöffnet werden kann. Dieses Verfahren kann auf (human) Gewebe, Querschnitte von ganzen Tieren angewendet werden , sowie Gewebekultur 1-5. Hier Zebrabärbling Gehirne wurden in einer nicht-invasiven Ablation neuronalen Modell analysiert. Wir visualisieren innerhalb eines einzigen Datensatzes Gewebe, zellulärer und subzellulärer Veränderungen, die in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Neuronen und Mikroglia quantifiziert werden können, die Makrophagen des Gehirns. Zusätzlich nanotomy die Korrelation von EM mit Lichtmikroskopie (CLEM) 8 auf dem gleichen Gewebe erleichtert, da große Oberflächenbereiche zuvor Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, können anschließend in großen Bereich EM unterzogen werden, was in der Nano Anatomie (nanotomy) von Gewebe. Insgesamt ermöglicht nanotomy unvoreingenommene Erkennung von Features auf EM-Ebene in einem Gewebe weiten quantifizierbare Weise.

Groß angelegte EM-Datensatz von Koronalschnitte des Kopfes von 1-Wochen alten Zebrabärblingembryonen zeigt viele Gewebe und zelluläre Funktionen in einem einzigen großen Stufenbild (www.nanotomy.org). Nanotomy Kontrolle Gehirnschnitte zeigt typische ultrastrukturelle Merkmale von Nervengewebe des rostralen forebrain einschließlich Geruchsfaserbündel, neuronale Kerne und neuronalen Unterfächer einschließlich Synapsen (2A, www.nanotomy.org). Zelltypen im Kopf, die unterschieden werden können, gehören Chondrozyten mit großen Vakuolen im Unterkiefer, osmiophilen Myelin der Riechnervenzellen, Endothelzellen eines kleinen Schiffes, Strukturen umfassen die meninx (die Zebrabärbling Pendant der Meningen, die membranartige umhüllende Schicht Säugerhirn). Subzellulären Strukturen umfassen die Glycocalyx der Epidermis, verschiedene Kern Morphologien und Foci in verschiedenen cel<html> l Typen und Organellen einschließlich Golgi-Apparat, endoplasmatischen Retikulum (ER), Mitochondrien und synaptischen Vesikeln und postsynaptischen Dichten. Unerwarteter die Kerne von Zellen, die die Ventrikel auskleiden sind sehr elektronendichten Vergleich zu anderen Zellen mehr seitlich im Gehirn verteilt. Zusätzlich zeigen diese Kerne ventrikulären dunkle Foci , die in anderen Zellen im Gehirn nicht vorhanden sind und unterschiedlich erscheinen in Größe und Struktur von dem Heterochromatin, die in Kernen von phagozytischen Mikroglia (Abbildung 2) gefunden wird. Zellen, die die Ventrikel bei der Entwicklung von Zebrafisch-Futter sind meist radialen Gliazellen und neuronale Vorläuferzellen, die eine veränderte Chromatin Zustand als mehr differenzierte Zellen zurückgelegt werden muss. Als Stammzellen in Gewebe im Allgemeinen recht selten sind, nanotomy zur Gewebekennzeichnung für Stammzellmarker mit Gewebe Skala korrelieren EM daher verwendet werden könnten ultrastrukturelle Merkmale von Stammzellen zu identifizieren. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; Groß EM (www.nanotomy.org) eines koronalen Abschnitt in einer Zebrabärbling Larve neuronalen Ablation zeigt, dass viele spezifische Gewebe unterziehen, und zellulären und molekularen Eigenschaften nicht gefunden in Kontrolltieren. Cellular Features phagozytischen Vakuolen Mikroglia und die Größe der Zellen umfassen, wahrscheinlich darstellt sterbenden Zellen (2B, www.nanotomy.org). EM haben frühere Studien Mikroglia in Vertebraten 18,19 identifiziert. Kennzeichnende Merkmale der Mikroglia länglichen Kerne umfassen , Klumpen von fleckige Chromatin neben der Kernhülle, prominente Golgi-Apparat, frei Polyribosome, granulare endoplasmatischen Retikulum (ER) mit langen, schmalen Zisternen, relativ dunkel / dichten Zytoplasma und zahlreiche Angebote wie phagosomes, Lipidtröpfchen und Lysosomen. Alle diese Kennzeichen, auf Mikroglia in Säugetiergewebe zugeschrieben wird , wurden auch in diesen Zellen in Zebrabärbling Gehirne (2B, www.nanotomy.org) gefunden. &lt;p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow von Groß Tissue Elektronenmikroskopie auf Zebrabärblinge Gehirne. (A) 7 Tage alten Zebrafisch - Larve. (B) Zebrabärbling larvalen Köpfe nebeneinander in Epoxidharz eingebettet. (C) Glasmesser für Halb -Thin sectioning und Orientieren der Probe. (D) Representative Semidünn Toluidinblau-Färbung Schnitt zeigt zwei Side-by-Side - eingebettet Zebrabärblingembryonen. (E) Diamantmesser ultradünnen (70 nm) Abschnitte zu schneiden. (F) bearbeitete Bild in (D) von ganzen Zebrabärbling Larven Gehirn Abschnitt auf einem Lochraster Positionierung anzuzeigen. (G) Mikroskopiesystem für große 2D - EM in dieser Studie verwendet. (H) Ablauf der Bildverarbeitung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a>eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53635/53635fig2.jpg" /> . Abbildung 2: Nanotomy . Ergebnisse: Von Makromolekül Gewebe (A) Nanotomy der Gehirne von 7 Tagen Kontrolle nach der Befruchtung und (B) behandelt (neuronale Ablation; Abbildung 1), Besonderheiten bei der neuronalen zeigt abgetragenen degenerative Hirn (B) Diese phagozytischen Mikroglia, dunkle Zellen umfassen läuft Zelltod und schwammigen Aussehen neuronaler Gewebe ((A) und (B)). Die oberen Felder (angepasst von 5): 10fach vergrößerte Ansicht Region angegeben in mittleren Panels. Mittelplatten: 10fach vergrößerte Ansicht Region in unteren Platten angegeben. (A, Mitte) Hohe Vergrößerung Ansicht von neuropil zeigt Synapse in (A, unteres Bild), synaptische Vesikel (SVs) undpostsynaptischen Dichte (PD). (B, Mitteltafel) Hohe Vergrößerung Ansicht von amoeboid Mikroglia oder möglicherweise ein Makrophagen (Mitteltafel, M) zeigt typische amöboide Mikroglia - Funktionen (unten) mit prominenten Golgi - Apparat (G), Einschlüsse einschließlich lysosomale Vakuolen (L). Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m (oben), 5 &amp; mgr; m (Mitte) und 0,5 &amp; mgr; m (unten). Diese Zahl wurde von 5 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53635/53635fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen</a> , oder besuchen Sie die vollständigen Daten online (nanotomy.org).

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Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

Großflächige Raster-Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Nanotomy) gesunder und verletzter cerebra-

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

11.0K Aufrufe.  UMC Groningen. Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury. 

Serie: Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologie

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Neurowissenschaften

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury model was developed in the adult optic tectum of zebrafish and medaka and comparative histological and molecular analyses were performed to elucidate the molecular mechanisms regulating the high regenerative capacity of this tissue across these fish species. Here a stab wound injury model is presented for the adult optic tectum using a needle and histological analyses for proliferation and differentiation of the neural stem cells (NSCs). A needle was manually inserted into the central region of the optic tectum, and then the fish were intracardially perfused, and their brains were dissected. These tissues were then cryosectioned and evaluated using immunostaining against the appropriate NSC proliferation and differentiation markers. This tectum injury model provides robust and reproducible results in both zebrafish and medaka, allowing for comparing NSC responses after injury. This method is available for small teleosts, including zebrafish, medaka, and African killifish, and enables us to compare their regenerative capacity and investigate unique molecular mechanisms.

A mechanical brain injury model in the adult zebrafish is described to investigate the molecular mechanisms regulating their high regenerative capacity. The method explains to create a stab wound injury in the optic tectum of multiple species of small fish to evaluate the regenerative responses using fluorescent immunostaining.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Im lebenden Organismus Ganzhirn-Bildgebung von Zebrafischlarven

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

Autor im Rampenlicht: In vivo Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

Im lebenden Organismus Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

Großflächige Raster-Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Nanotomy) gesunder und verletzter cerebra-

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Im lebenden Organismus Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie

Im lebenden Organismus Ganzhirnbildgebung von Zebrafischlarven mittels dreidimensionaler Fluoreszenzmikroskopie