Die Stichwundenverletzung ist eine mechanische Verletzungsmethode, die eine unspezifische Zellablation induziert. Diese Methode erleichtert die Beurteilung der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach Hirnverletzungen. Nadelvermittelte Stichwundenverletzungen sind eine einfache, effizient implementierte Methode, um eine Hirnverletzung zu induzieren.
Diese Methode kann mit einem Standardsatz von Werkzeugen auf viele experimentelle Proben angewendet werden. Die Regenerationsfähigkeit von Zebrafischen wurde anhand des Stichwundenmodells veranschaulicht. Neue Erkenntnisse über molekulare Mechanismen, die die neuronale Regeneration regulieren, tragen zur regenerativen Therapie im zentralen Nervensystem bei.
Beginnen Sie damit, einen betäubten erwachsenen Zebrafisch oder Medaka auf eine Styroporschale zu legen. Befestigen Sie den Fisch aufrecht zwischen zwei 30-Gauge-Nadeln, die senkrecht in das Styropor eingeführt werden. Halten Sie den Fischkörper fest, um zu verhindern, dass sich der Fischkopf bewegt, und führen Sie dann vertikal eine 30-Gauge-Nadel durch den Schädel in den medialen Bereich einer der optischen Tectumkugeln ein.
Als nächstes überführen Sie die verletzten Fische in ein Aquarium mit frischem Fischanlagenwasser. Sobald sich die Fische vollständig von der Anästhesie erholt haben, stellen Sie den Tank in das Zuchtsystem. Legen Sie Papiertücher auf die Styroporschale, um den betäubten Fisch zu platzieren.
Halten Sie dann den Fischkörper an Ort und Stelle, indem Sie zwei 30-Gauge-Nadeln auf beiden Seiten der Afterflosse vertikal einführen. Sobald der Fisch platziert ist, machen Sie einen ventralen Einschnitt vom Anus zum Herzen. Halten Sie das Herz sichtbar, indem Sie auf jeder Seite zwei 30-Gauge-Nadeln einführen.
Verwenden Sie dann die Spitze der Pinzette, um die Silberepithelschicht zu entfernen. Führen Sie die 30-Gauge-Nadel in den Ventrikel ein, halten Sie die Fase oben und machen Sie mit der Pinzette einen Einschnitt in den Vorhof. Als nächstes drücken Sie PBS in den Vorhof, indem Sie auf die Spritze drücken, um das Blut aus dem Vorhof zu spülen.
Wenn das Blut abgelassen wird und die Kiemen weiß werden, stoppen Sie die PBS-Perfusion. Entfernen Sie später die Nadeln, mit denen der Fischkörper befestigt ist, und befestigen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten. Nachdem Sie das Rückenmark durchtrennt und den Schädel aus dem optischen Tectum und Telencephalon entfernt haben, schneiden Sie die Sehnerven durch und sezieren Sie das Gehirn.
Als nächstes wird das Gehirn in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter 4% Paraformaldehyd in PBS überführt, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu fixieren. Nachdem Sie die fixierten Gehirne dreimal fünf Minuten lang in PBS gewaschen haben, werden die Gehirne in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Saccharose von 30 Volumenprozent in PBS als Kryoprotektivum überführt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Bereiten Sie die Einbettmasse vor, indem Sie 30% Saccharose mit 30 Millilitern optimaler Schnitttemperatur (OCT) kombinieren, und lagern Sie die Verbindung bei vier Grad Celsius.
Um den Kryomold einmal abzukühlen, inkubieren Sie einen Aluminiumblock über Nacht bei minus 80 Grad Celsius und legen Sie den vorgekühlten Block in eine Styroporbox mit Deckel, um eine Erwärmung zu verhindern. Für koronale Schnitte betten Sie das präparierte Gehirn in einen Kryomold ein, indem Sie die Orientierung mit einer Pinzette unter dem Mikroskop anpassen. Als nächstes legen Sie den Kryomold auf den vorgekühlten Aluminiumblock in der Styroporbox und lassen Sie die OCT-Verbindung gefrieren und weiß werden.
Wenn die Verbindung gefriert, tragen Sie einen kleinen Kreis OCT-Verbindung auf eine Probenscheibe auf, bevor Sie den Kryoblock auf die Probenscheibe montieren. Durch Einsetzen der Probenscheibe in den Kryostaten frieren Sie die OCT-Verbindung ein. Legen Sie dann die Probenscheibe auf den Probenkopf im Kryostat.
Nachdem Sie die Ausrichtung des Kryoblocks festgelegt haben, schneiden Sie das OAT ab, um zusätzliche Bereiche zu entfernen. Schneiden Sie 14 Mikrometer dicke Serienschnitte mit einem Kryostaten durch das gesamte optische Tectum und lagern Sie die Objektträger bei minus 25 Grad Celsius. Die radiale Gliazellproliferation (RGC) im Hirngewebe von Zebrafischen wurde untersucht.
Die meisten RGCs waren in der kontralateralen unverletzten Hemisphäre proliferierend Zellantigen-negativ. Zwei Tage nach der Verletzung wurde eine RGC-Proliferation auf der verletzten Seite des Medaka-Tectums induziert. Nach der Hirnverletzung wurden die Zelllinie und die RGC-Differenzierung mit Bromdesoxyuridin- oder BrdU-Markierung bewertet.
Die repräsentative Analyse zeigt neugeborene Neuronen sieben Tage nach der Verletzung bei den verletzten Zebrafischen und Medaka. Einer der entscheidenden Schritte bei Stichwunden ist das manuelle Einführen der Nadel. Eine konsistente Verletzung ist notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Fluoreszenzfarbstoffe sind als Wundmarker wirksam. Das Ausmaß der Fluoreszenzfarbstoffdiffusion gibt den Ort und die Tiefe der Stichwunde an. Diese Technik ist potenziell an andere kleine Fischarten angepasst, und die Anpassung an Medaka ermöglicht Vergleiche der Regenerationsfähigkeit.
