We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.

Zebrafische wurden in der Fischanlage des Instituts für Toxikologie und Genetik (ITG) am Karlsruher Institut für Technologie (KIT) gehalten. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den deutschen Tierschutzstandards durchgeführt und wurden von der Regierung von Baden-Württemberg, Regierungspräsidium Karlsruhe, Deutschland (Aktenzeichen 35-9185.81/G-272/12 &quot;Adulte Neurogenese&quot;) zugelassen. 1. Generieren eine Stichwunde in der Telen <ol><li> Anästhesie <ol><li> Um eine Stammlösung von Tricaine (3-Amino benzoesäureethylester, auch als Ethyl-3-Aminobenzoesäure) vorzubereiten verwenden 400 mg Tricaine Pulver und löst ihn in 97,9 ml Wasser und 2,1 ml 1 M Tris / HCl-Puffer (pH 9). PH-Wert auf 7. Machen 5 ml Aliquots und speichern sie bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Bringen Sie eine entsprechende Anzahl von 0,5-1 Jahre alten Zebrafisch aus ihren Panzern in Kunststoffmäusekäfige. Hinweis: Der Schädel eines erwachsenen Zebrafisch bei etwa 12Monate alt ist noch relativ weich und kann leicht mit einer Nadel perforiert werden (siehe Abschnitt 1.2.3 und Abbildung 1A). </li><li> Um die erwachsenen Zebrafisch zu betäuben, zu kombinieren Tricaine 5 ml (Stammlösung) in einem Kunststoffübergang Käfig mit ~ 100 ml Wasser sauber Aquarium (Endkonzentration Tricaine 0,02% (w / v) Tricaine). </li><li> Inkubieren Sie die Fische in den Anästhetika, bis sie sich nicht mehr bewegen (45-60 s). </li></ol></li><li> Telen Injury <ol><li> Platz betäubt einzelnen Zebrafisch in einen Schlitz in einem Block von Tricaine getränkten Schaumstoff. </li><li> Unter einem Binokular mit Licht von oben halten den Fisch vorsichtig mit einer Hand und orientieren sie in einer Weise, die den Zugriff auf den Kopf von oben ermöglicht. </li><li> Mit der anderen Hand drücken eine 30 G-Spritze (Insulinspritze mit integrierter Nadel) senkrecht durch den Schädel in den medialen Bereich einer telencephalic Hemisphäre (Fig. 1A-1B). Die Hemisphären des Telen einwieder durch den Schädel sichtbar. Stellen Sie sicher, dass die eingebrachte Läsion ist nicht tiefer als 2 mm (Abbildung 1C). Hinweis: Es wird dringend empfohlen, um die Läsion immer in die gleiche Hemisphäre einzuführen, um die Identifikation der Ort der Läsion, wenn das Gehirn sezieren aus dem Schädel zu erleichtern. </li><li> Nach dem Einbringen der telencephalic Verletzungen, legen Sie den Fisch in Fischwasser. Halten Sie bis zu 10 Fische in einem 2 L Mäusekäfig mit Fisch Wasser für die Wiederherstellung gefüllt und schließen Sie die Maus Käfig zu einer Wasserflusssystem. Anmerkung: Die Überlebensrate ist in der Regel ~ 97%, wenn Fisch gesund sind und keine weiteren Versuche wurden mit dem Fisch vor geführt. Zugabe von Antibiotika zum Fisch Wasser ist nicht erforderlich. Nach der Wiederherstellung, Fisch normalerweise verhalten: sie schwimmen, Futtermittel und Kumpel. </li></ol></li></ol> 2. Analyse der Wirkung von telencephalic Injury <ol><li> Gehirn-Dissection und Fixation <ol><li> Re-betäuben die wiederhergestellte Fisch zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Läsion (typically, 1, 3, 5, und 14 Tage nach Läsion (DPL)) mit 0,02% (w / v) Tricaine wie oben beschrieben und sie einschläfern, indem sie in Eiswasser für 5 min. </li><li> Legen Sie den Fisch auf einem Papiertuch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) eingeweicht und trennen den Kopf vom Körper, indem hinter die Kiemen mit einer scharfen Schere. </li><li> Halten Sie die Köpfe in 1x PBS für 5 Minuten, um die Blutung zu ermöglichen. Anmerkung: Diese entwässert Blut aus dem Gewebe, das die weiteren Schritte in dem Protokoll stören kann. </li><li> Beheben die Köpfe über Nacht bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS oder 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Zweimal waschen feste Köpfe mit 1x PBS in einer Petrischale. </li><li> Gehirn sezieren vorsichtig in 1x PBS unter einem Binokular 23. Die Läsion ist in der Regel unter dem Binokular sichtbar. Brains ohne sichtbare Läsion muss verworfen werden. </li><li> Übertragen Gehirn in 2 ml Reaktionsgefäße mit 1,5 ml 100% Methanol gefüllt (MeOH) und 5x vor Inkubation invertieren die Rohrebei -20 ° C für mindestens 16 Stunden. Hinweis: Das Gehirn kann mehrere Monate in MeOH bei -20 ° C aufbewahrt, bis sie für die Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung benötigt. </li></ol></li><li> Gewebepräparation für die Immunhistochemie <ol><li> Rehydrate die Gehirne durch einen absteigenden Methanol-Serie in 2-ml-Plastikröhrchen (sequenziell 75% MeOH (1x PBS, 0,1% Tween-20 = PTW);. 50% MeOH, 25% MeOH inkubieren die Gehirne (15 Gehirne / 2 ml Reaktionsgefäße ) für 5 Minuten in jeder Lösung. </li><li> Waschen Sie die Gehirne in PTW für 5 min. Wiederholen 4x mit frischen PTW. </li></ol></li><li> Die Einbettung der Gehirne für Sectioning <ol><li> Zur Einbettung, übertragen Sie die Gehirne von 2 ml Reaktionsgefäß in PTW in die Hohlräume eines Polyethylen-Formtassenablage mit einer Transferpipette (5 mm Durchmesser). </li><li> Bereiten Sie 2% igen (DNA grade) in 1x PBS in einem Erlenmeyerkolben. Wärme in der Mikrowelle bei 600 W bis die Agarose vollständig gelöst ist. Bereiten Sie 50 ml für 10 Gehirne. Lassen thE Agarose abkühlen für 3 min bei Raumtemperatur vor Gebrauch. Halten der Agarose auf einem vorgewärmten Wärmeblock (60 ° C), während die Einbettung der Köpfe, um die Verfestigung zu verhindern. </li><li> Entfernen des 1x PBS aus der Form, die ein Gehirn unter Verwendung einer Pasteur-Pipette (1 mm Durchmesser). Achten Sie darauf, um das Gehirn zu schädigen. </li><li> Gießen Agarose in die Form und füllen Sie es vollständig. Dann mit einem Dissektion Nadel, um das Gehirn in der Agarose wirbeln zu waschen den PTW macht es einfacher, das Gehirn zu verankern. </li><li> Orient das Gehirn in der Form Bauchseite nach unten, Rückenseite und legen Sie sie gerade. </li><li> Lassen Sie die Agarose abkühlen. Für schnellere Abkühlung, legen Sie die Form auf dem Eis. Wiederholen Sie die Schritte. </li><li> Wiederholen 2.3.3-2.3.6 für alle Gehirne. </li></ol></li><li> Trimmen der Agarose-Block <ol><li> Mit einer Dissektion Nadel, Pop aus der Agarose-Block. </li><li> Mit einer scharfen Rasierklinge, schneiden Sie die Agarose am hinteren Ende des Gehirns. Stellen Sie sicher, dass diese Ebene parallel zu der te istlencephalon. </li><li> Schneiden die Agarose am vorderen Ende des Gehirns. Dann drehen Sie den Block, so dass er auf der hinteren Ebene. </li><li> Entfernen Sie den Überschuss der Agarose durch Schneiden parallel zu Rücken des Gehirns und ventralen Seiten. Dann drehen Sie das Gehirn zurück, so dass es auf seiner Bauchseite liegt. </li><li> Schneiden des Blocks an einer abgeschnittenen Dreiecks, in dem das Telencephalon ist am kleineren Ebene (Fig. 2). </li></ol></li><li> Vorbereiten des Vibratom zum Schneiden <ol><li> Vorbereitung der Vibratom nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie eine neue Rasierklinge und ersetzen Sie es nach 10 Gehirne. </li><li> Auffüllen des Puffer Bad mit 1x PBS auf ein Niveau, das gerade den Boden der Schaufel erreicht. </li><li> Setzen Sie einen kleinen Punkt Sekundenkleber auf der Oberseite des Probenteller des Vibratom. </li><li> Legen Sie das Flugzeug, das hinter dem Gehirn auf der Sekundenkleber befindet. Der Klebstoff wird so schnell härten, wie es in Kontakt mit dem in 1x PBS istdie Vibratom Puffer-Bad. </li><li> Legen Sie die Objektplatte mit der Probe in die Pufferwanne mit dem Manipulator des Mikrotoms. </li><li> Verwenden des Manipulators um die Objektplatte in die gewünschte Position zu drehen. Richten Sie den Block in der Puffer Bad in einer Weise, die das Telen knapp unter der Oberfläche lokalisiert, mit dem dorsalen Teil des Gehirns, mit Blick auf die Klinge. Ziehen Sie dann die scrw mit einem 3-mm-Inbusschlüssel und entfernen Sie den Manipulator. Hinweis: Die Klemmschraube oder eines der Klemmeinrichtungen nicht über die Lücke in der Probenscheibe befinden; in diesen Positionen die Spannobjektplatte ist nicht möglich. </li></ol></li><li> Schneiden des Gehirns <ol><li> Bereiten Sie eine 24-Well-Platte, um die Abschnitte zu sammeln. Pro Gehirn zu zerschneiden, zu füllen und einen mit 1 ml Blockierungspuffer (0,1% (v / v) 10% Tween-20, 0,2% (w / v) Rinderserumalbumin (BSA), 1% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO) in PBS). </li><li> Zu Beginn mit 50 &amp;mgr; m Dicke, 1 mm / sec Geschwindigkeit und Frequenz 70 Hzmit einem Schwing Mikrotom. </li><li> Verwenden Sie ein Synthetikpinsel (1 mm), holen die dünnen Scheiben aus Agarose, wie sie kommen aus der Klinge und sammeln sie in der 24-Well-Platte. </li></ol></li><li> Immunhistochemie auf Vibratom Abschnitte <ol><li> Blockieren nicht-spezifischer Bindungsstellen für 1 h bei Raumtemperatur in Blockierungspuffer (0,1% (v / v), 10% Tween 20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO in PBS). </li><li> Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 250 ul Antikörper in Blocking-Puffer über Nacht bei 4 ° C verdünnt Alternativ den primären Antikörper inkubiert für 2 h bei RT. Dann waschen 3x für 10 min in PTW. Hinweis: Für die PCNA-Färbung verwenden eine 1:400 Verdünnung (Maus-Anti-PCNA Details siehe Tabelle der Werkstoffe.). Mehrere primäre Antikörper gleichzeitig inkubiert werden. </li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte in sekundären Antikörpers für 2 h bei RT waschen dann 3x für 10 min in PTW. Hinweis: 1:1000 Verdünnung in PTW, für Details siehe Tabelle der Materialien. Mehrere sekundäre Antikörper gleichzeitig inkubiert werden. </li><li&gt; Optional: Die besten Ergebnisse werden beobachtet, wenn Abschnitte sind in PTW Nacht bei 4 ° C, um das Auswaschen von nicht-spezifisch gebundene Sekundärantikörper ermöglichen gehalten. In diesem Fall ersetzen Sie die PTW wieder einmal vor der Montage. </li></ol></li><li> Erwachsenen Gehirn-RNA in situ Hybridisierung (alternativ Immunhistochemie) <ol><li> Gehirn-Dissection und Fixation (gleiche Verfahren wie für die Immunhistochemie): <ol><li> Die Hybridisierung der Sonde. </li><li> Rehydrate Gehirne in 2 ml Reaktionsgefäße für die Immunhistochemie beschrieben. </li><li> Gehirne in Proteinase K (. ProtK; 10 ug / ml Endkonzentration) inkubiert in PTW für 30 min. Nach der Inkubationszeit entfernen ProtK / PTW und fixieren die Gehirne wieder für 20 min im BT-Fix (4% PFA, 4% Saccharose, 0,12 mM CaCl 2, 77 mM Na 2 HPO 4, 23 mM NaH 2 PO 4). </li><li> 5x waschen Gehirne für 5 min in PTW (0,1% (v / v) Tween-20 in PBS). </li><li> PTW entfernen und spülen Sie die Gehirne in 500 ulHYB-Puffer (50% (V / V) entionisiertes Formamid, 5 × SSC, 500 ug / ml Hefe-tRNA, 50 ug / ml Heparin, 0,1% Tween-20, 9 mM Citronensäure). Warten Sie, bis Gehirn sinken auf den Boden des Röhrchens dann den Überstand verwerfen und fügen Sie 500 ul von sauberen HYB-Puffer und Inkubation bei 65-70 ° C für 3-4 Stunden. </li><li> Verdünnt das RNA-Sonde bis 1:200 oder 1:400 (je nach Probe) in 400 &amp;mgr; l Endvolumen von HYB-Puffer. Erhitzen Sie das verdünnte RNA-Sonde bei 70 ° C für 5 min. </li><li> Überstand entfernen aus dem Gehirn und fügen Sie die RNA-Sonde, Inkubation bei 65-70 ° C (O / N). Sollten alle Waschpufferlösungen vorgewärmt und bei 70 ° C gehalten werden </li></ol></li><li> Labeling <ol><li> 30 min waschen die Gehirne bei 65-70 ° C (bei allen 4 Waschschritte) mit 500 &amp;mgr; l Waschpuffer 1 (50% Formamid, 1 × SSC, 0,05% Tween 20) zweimal. Puffer 1 ersetzen durch Puffer 2 (2x SSC, 0,1% Tween 20), und die Proben für 15 min. Entfernen Puffer 2 und waschen Gehirne in Puffer 3 (0,2 x SSC, 0,1% Tween 20) for 30 Minuten, zweimal wiederholen Sie diesen Schritt zwei. Puffer 3 ersetzen durch Puffer 4 (0,1 x SSC, 0,05% Tween 20 in PTW), Inkubation für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und waschen für 5 min in 500 ul PTW bei RT. </li><li> Embed Gehirn in 2% Agarose (in 1x PBS) und schneiden Vibratom Abschnitte (50-100 um) als für die Immunhistochemie beschrieben. </li><li> Wasch 1x 5 min in 500 &amp;mgr; l Blockierungspuffer (1 × PBS, 0,1% Tween-20, 0,2% (w / v) BSA, 1% (v / v) DMSO). </li><li> Überstand entfernen und fügen 500 ul Blockierungspuffer für 2 h bei RT. </li><li> Überstand entfernen und 300 ul Anti-Dig AP-gekoppelten Antikörper verdünnt 1:4000 in Blockierungspuffer. </li><li> Inkubation o / n bei 4 ° C </li></ol></li><li> NBT / BCIP Färbung <ol><li> Für 15 min mit Puffer bei RT PTW 5x waschen. </li><li> Spülen Sie 1x in Färbepuffer. Zweimal 5 min Färbung Puffer (100 mM Tris / HCl pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) gewaschen. </li><li> Überstand entfernen und Fleck mit 500 μl Färbelösung (3,5 &amp;mgr; l 4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) pro 1 ml Färbepuffer). </li><li> Stoppen Färbung durch Spülen 3x mit PTW 5x. </li></ol></li></ol></li><li> Montage der § § <ol><li> Montieren Sie die Abschnitte auf Objektträger mit einem wasserlöslichen, nicht-fluoreszierenden Montagemedium (siehe Materialien Tabelle). </li><li> Folien bleiben im Kühlschrank bei 4 ° C Hinweis: Die Färbung ist für mehrere Wochen oder sogar Monate stabil. </li><li> Analysieren Sie die Folien unter einer Verbindung oder konfokalen Mikroskop. </li></ol></li></ol>

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J., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+fate+analysis+in+zebrafish+using+olig2+BAC+transgenics.">Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics.</a> Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).</li><li>Armant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide,+whole+mount+in+situ+analysis+of+transcriptional+regulators+in+zebrafish+embryos.">Genome-wide, whole mount in situ analysis of transcriptional regulators in zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 380, 351-362 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben hier eine Methode, um eine telencephalic Verletzungen, indem eine Nadel durch den Schädel des erwachsenen Zebrafisch zu induzieren, und die zellulären und molekularen Reaktion auf diese Verletzung durch Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung zu analysieren. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber anderen existierenden Ansätzen ist seine Einfachheit, Geschwindigkeit und Wirtschaftlichkeit. Daher kann diese Technik, die Produktion von vielen verletzten Gehirn in kurzer Zeit ermöglicht, leicht mit einem großen Maßstab in-situ-Hybridisierung Bildschirm, um Gene, die mit einer Rolle in der Regeneration und Neurogenese zu identifizieren kombiniert werden. Das Alter des erwachsenen Zebrafisch an dem die Schädigung durchgeführt wird, von entscheidender Bedeutung. Wenn der Fisch älter als 1,5 Jahre, der Schädel zu hart und es ist möglich, daß der Schädel nach unten gedrückt oder gebrochen anstatt sauber perforiert. Im Gegensatz dazu ist bei jüngeren Fisch (jünger als 4 Monate), gibt es noch eine Menge von Neurogenese im Gange, die zu gegebener lead, um falsch-positive Ergebnisse in Bezug auf reaktive Neurogenese. Ein weiterer entscheidender Schritt in diesem Ansatz ist es, die Effizienz der Stichwunde Akkreditierung und auszuschließen, dass die beiden Halbkugeln verwundet. Dies kann durch Färbung der Schnitte mit Anti-PCNA-Antikörper überwacht werden. In einem korrekt eingeführt Läsion sollte deutlich sein PCNA in nur einer der Halbkugeln hochreguliert. Es ist wichtig zu beachten, dass die induzierte mechanische Verletzung zahlreiche Nebenwirkungen wie unspezifische Zell Ablation, erhöhten Zelltod aufgrund von sekundärer Degeneration, Entzündung und Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke, und Beschädigung der ventrikulären Zone und so haben eine mögliche Folge Strömung der Zerebrospinalflüssigkeit in das Hirnparenchym. Allerdings scheinen die verletzten Fische aus der Verletzung leiden sehr wenig. Innerhalb von 2 min sind sie frei schwimmen und wieder normalen Fressverhalten innerhalb von etwa 4 Stunden wieder hergestellt. Nach 3 Wochen ist der injury ist morphologisch nicht mehr sichtbar. In unseren Händen, aus mehreren hundert Operationen haben wir nicht einen einzigen Fisch zu verlieren, trotz der Tatsache, dass wir eine 100% Verletzungsrate als durch Histologie bei 5 Tage nach der Läsion beurteilt. In den letzten Jahren andere Techniken wie transgene Ansätze haben im Zebrafisch entwickelt, um Gewebe-oder Zelltyp-spezifische Ablation 2 zu erzeugen. Obwohl diese Techniken sind sehr elegant und minimal invasive sie auf die Erzeugung von komplexen DNA-Konstrukte und die Einrichtung mehrere stabile transgene Zebrafisch-Linien, die sehr mühsam und zeitaufwendig sein kann, basiert. Daher einfache mechanische Ansätze wie die in diesem Protokoll beschriebenen Test vor ein wichtiges Werkzeug, um erwachsenen Gehirn Neurogenese und Regeneration zu studieren.

Säugetiere haben eine sehr begrenzte Fähigkeit, neue Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen, und adulte Neurogenese im Gehirn ist vor allem auf zwei Bereiche an der telencephalic Subventrikularzone (SVZ) der lateralen Ventrikel gelegen eingeschränkt, und die Subgranularzone (SGZ) des Gyrus Gyrus im Hippocampus ein. Säugetiere können auch nicht für Schäden des Gehirns durch neurodegenerative Erkrankungen, Schlaganfall oder Verletzungen zu reparieren, effizient. Verloren Neuronen nicht ersetzt und statt Proliferation von verschiedenen Arten von Gliazellen, einschließlich Astrozyten, Mikroglia und Oligodendrozyten, beobachtet. Als Folge dieser proliferativen Prozess namens reaktive Gliose ist die verletzten Gehirngewebe durch die Bildung einer glialen Narbe, die neuronale und axonale Regeneration 2-4 hemmt abgedichtet. Im Gegensatz zu Säugetieren, Knochenfischen wie dem Zebrafisch reichlich bilden neue Nervenzellen im adulten Stadien und haben eine hohe regenerative und proliferative Potenzial, Läsionen des Zentralnervensystems 2,5-7 reparieren. Der Zebrafisch erwachsene Gehirn enthält 16 verschiedene neuronale Stammzellnischen, die eine große Anzahl von neuen Nervenzellen während der gesamten Lebensdauer 8-11 generieren. Neuronen in diesen spezifischen Proliferationszonen des erwachsenen Zebrafischgehirn geboren migrieren, um ihre Zielgebiete, wo sie reifen und in die bestehenden neuronalen Netzwerken 8,10,12-15 integrieren. Unter den in erwachsenen Zebrafisch identifiziert Vorläuferzonen ist die telencephalic ventrikulären Zone eine der am besten untersuchten neuronalen Stammzellnischen. Die Zellen in dieser Vorläufer Nische kann in drei verschiedene Arten in Bezug auf ihre Morphologie, Teilungsrate und die Expression von verschiedenen Gliazellen oder neuronalen Marker klassifiziert werden. Typ I und Typ II-Zellen sind radiale Gliazellen, wie Zellen, die lange Prozesse haben. Sie drücken Stammzellen Marker einschließlich GFAP, Nestin und S100β. Typ-I-Zellen nicht vermehren, während Typ II-Zellen proliferate langsam, wie durch die Expression des Proliferationsmarker wie proliferierenden Zellkernantigen (PCNA) und den Einbau von Desoxythymidin Analoga nachgewiesen. Die Typ-III-Zellen sind schnell teilenden Zellen, die sich verpflichtet haben, neuralen Vorläuferzellen zu werden und Express neuronalen Marker-Gene, wie PSA-NCAM 5,16. Obwohl die Regenerationsfähigkeit von Knochenfischen gut dokumentiert sind, sind nur wenige Veröffentlichungen ausführlich beschrieben und untersucht die zellulären und molekularen Mechanismen der neuronalen Regeneration in der erwachsenen Telen in Reaktion auf eine Verletzung beteiligt 15,17-22. Um die Mechanismen im Zebrafisch erwachsenen Zentralnervensystem die Regeneration und Reparatur gebracht entschlüsseln und die Gemeinsamkeiten und die Unterschiede zwischen konstitutiven und regenerative Neurogenese zu verstehen, entwickelten wir eine Zebrafisch-Modell der Erwachsenen telencephalic Verletzung. Hier werden wir visuell zu beschreiben, wie man eine Verletzung in einem der telencephalic hemisph erzeugeneRest mit Hilfe einer Spritze und Nadel, während die unverletzten kontralateralen Seite als interne Kontrolle. Wir werden auch zeigen, wie Änderungen bei der Verletzung bei der Zellproliferation und die Genexpression durch Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierungstests überwachen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x DPBS (-/-)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14200-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 G syringe (Omnican 40)</td>
			<td>B.Braun Melsungen</td>
			<td align="right">916162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene molding cup tray&#160;</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>17177C-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PeqGOLD Universal Agarose&#160;</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 2835919108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aqua Poly/Mount</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18606-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td align="right">9127.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection needle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KX93.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td align="right">335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite 414</td>
			<td>Sch&#246;ffler und W&#246;rner</td>
			<td><a href="http://62.157.117.162/BP2NAV500/ItemDetail_NAV.aspx?ItemID=06%201362%200020">06 1362 0020</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides</td>
			<td>Labonord</td>
			<td align="right">5305103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slips 24 x 60 mm</td>
			<td style="width:163px;">Labonord</td>
			<td align="right">5305060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri dishes 94 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td align="right">632180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcons 15 ml</td>
			<td style="width:163px;">Greiner bio-one</td>
			<td align="right">188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td align="right">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-S100 (1:500)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z031101-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-PCNA (1:400)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M087901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-GFP (1&#160;:1000)</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Dig AP-coupled antibody&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">1383221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right">1383213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td align="right" style="width:119px;">1092766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene molding cup tray&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">17177C-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope Sp5 DM6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope Nikon SMZ 645</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates&#160;</td>
			<td>Falcon catalog&#160;</td>
			<td align="right">353226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Student Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Danio rerio Tg(olig2:EGFP)</td>
			<td align="right">24</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2)</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration

Erwachsene Zebrafisch haben eine erstaunliche Fähigkeit, ihre zentralen Nervensystems nach Verletzungen zu regenerieren. Um die zelluläre Antwort und die molekularen Mechanismen im Zebrafisch erwachsenen Zentralnervensystem (ZNS), Regeneration und Reparatur zu erforschen, entwickelten wir eine Zebrafisch-Modell der Erwachsenen telencephalic Verletzung. In diesem Ansatz haben wir eine Verletzung manuell durch Drücken eines Insulin-Spritzennadel in die erwachsenen Zebrafisch Telen generieren. An verschiedenen Tagen nach der Verletzung werden die Fische getötet, ihre Gehirne werden herausgeschnitten und durch Immunhistochemie und / oder in-situ-Hybridisierung (ISH) mit entsprechenden Markierungen, um die Zellproliferation, Gliogenese und Neurogenese zu beobachten gefärbt. Die unverletzten kontralateralen Hemisphäre dient als interne Kontrolle. Diese Methode kombiniert zum Beispiel mit RNA-Sequenzierung kann tief Bildschirm für neue Gene, die mit einer Rolle in Zebrafisch-Neurogenese Telen Erwachsenen, Regeneration und Reparatur zu helfen.

Unter Verwendung des in diesem Artikel beschriebenen Arbeitsablauf wurde eine Läsion in der rechten Hemisphäre eines erwachsenen Zebrafisch Telencephalon (Fig. 1A-1B) eingeführt. Eine korrekte Verwundung führt zu einer Läsion Kanal von Rücken erstreckt sich durch die ganze Pallium des Telen (3C) ventralen. Die Läsion sollte einer der Halbkugeln beschränkt werden und sollte nicht das mediale Herzkammer zu überqueren. Die Läsion Kanal ist mit Hellfeld-Mikroskopie (Abbildung 3C) sichtbar und wird nach ca. 35 Tage 15 geheilt werden. Es wurde zuvor gezeigt, dass nach der Verwundung eine Hochregulierung von proliferierenden Zellkernantigen (PCNA, Fig. 3A) und S100β (3B) bei 3 bis 7 DPL 15 ist durch Immunhistochemie nachgewiesen werden. Die Färbung von PCNA und S100β Überschneidungen, was die Proliferation von radialen Gliazellen. FFisch 24: angemeldete Marke, um Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) sichtbar zu machen, eine Stichwunde Assay wurde auf der Tg (EGFP Olig2) durchgeführt. Nach Färbung mit einem anti-GFP-Antikörper, ist die Anreicherung von OPCs in der Nähe der Läsion Kanal nachweisbar (Fig. 3D). Diese Anreicherung ist vergänglich, und OPC-Cluster werden nicht mehr bei 35 dpl 15 beobachtet. Wenn die Läsion nicht richtig eingeführt, wird die Läsion Kanal nicht sichtbar sein, und die Hochregulierung von PCNA und S100β oder Ansammlung von OPCs nicht nachweisbar sein. PCNA ist der empfindlichste Marker für Hirnverletzung. Um die Effizienz der Stichwunde Akkreditierung und auszuschließen, dass die beiden Halbkugeln verwundet werden, wird dringend empfohlen, immer färben die Abschnitte mit einem Anti-PCNA-Antikörper. In einem korrekt eingeführt Läsion sollte deutlich sein PCNA hochreguliert (bis zu 4-fach 15) nur in einer der Halbkugeln. Obwohl in den meisten Fällen ist esausreichend, um als interne Kontrolle, um Veränderungen in der Genexpression überwachen verwenden nur die unverletzten kontralateralen Seite, ist es sehr empfehlenswert, die Genexpression in der Steuer Hemisphäre mit dem Ausdruck in telencephalic Hemisphären des Wildtyp-Gehirne zu vergleichen. Auf diese Weise können jegliche systemische Wirkungen der Läsion auf die Genexpression, die beide Hemisphären beeinflussen würde detektiert werden. Die Stichwunde Assay in Kombination mit einem systematischen Ausdruck Bildschirm Transkriptionsregulatoren (TRS) (25 und Schmidt et al., Unveröffentlicht) kann auch verwendet werden, um Gene TR mit einer möglichen Rolle bei der Neurogenese und Regeneration (Fig. 4A-4C) zu identifizieren. Dieser Ansatz hat eine Reihe von Faktoren, die in der Telen exprimiert werden und deren Expression spezifisch in Reaktion auf eine Verletzung (4A-C) hochreguliert identifiziert. <imgalt = &quot;Abbildung 1&quot; fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51753/51753fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung des erwachsenen Zebrafisch telencephalic stab Verwundung. A) Insulin-Spritzennadel durch den Schädel eines erwachsenen Zebrafisch eingeschoben, um eine telencephalic Verletzungen erzeugen. Die weiße gestrichelte Linie die Grenze zwischen den beiden Hemisphären telencephalic und das grüne Kreuz zeigt die Position der Stichwunde. B) Rückenansicht eines erwachsenen Zebrafisch Gehirn. Die Hauptgehirnbereiche sind angegeben. Das grüne Kreuz zeigt die Position der induzierten Verletzung. C) Die Spitze der Nadel, die auf die Verletzung herbei telencephalic dient, misst 2 mm. Riechkolben (ob), Telen (tel) und Tectum opticum (ot). <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig2highres.jpg" width="500" /> 2. SChematic Darstellung eines erwachsenen Zebrafischgehirn in einem ausgeschnittenen Agarose-Block kurz vor Vibratoms Schneiden. Anterior ist oben. Riechkolben (ob), Telen (tel), Tectum opticum (ot), Kleinhirn (cb) und Mark (m). Maßstabsbalken: 500 um. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Regenerative Reaktionen auf Verletzungen Wunde stechen. AD) Adult Zebrafisch-Gehirns bei 5 Tage nach der Läsion (DPL). AB) Die proliferative Marker PCNA (A) und die radiale Gliazellen Marker S100β (B) sind in der ventrikulären Zone (Pfeile) auf Stich Verwundung hochreguliert. (C) Die Läsion Kanal ist unter Hellfeldbeleuchtung (Pfeile) sichtbar. Die ventrikuläre Zone wird durch die grüne Linie dargestellt. (D) Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (Olig2: EGFP +) sammeln sich an der Stelle der Läsion (Pfeile). Maßstabsbalken: 200 um. In allen Panels, ist die rechte Hemisphäre die lädierten Hemisphäre. Dorsal ist oben. Die gestrichelte Linie in A bis D bezeichnet die Grenze zwischen dem Pallium und der subpallium. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" width="600" /> 4. Ein Beispiel von Genen als Reaktion hochreguliert, um Verletzungen zu stechen. Beachte die starke Hochregulierung (Pfeile) eomesa (A, B) und sox4a (C)-mRNA-Expression in der rechten Hemisphäre telencephalic (gestochen Hemisphäre) als überwachte durch in situ-Hybridisierung bei 5 DPL. Die linke Hemisphäre ist unverletzt und dient als Kontrolle. (B) zeigt eine stärkere Vergrößerung des dorsalen telencephalic Region A. Rücken oben ist. Maßstabsbalken: 200 um für A und C und 55 um für B. Diegestrichelten Linie in A und C gibt den Abstand zwischen dem Pallium und der subpallium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51753/51753fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table><tbody><tr><td colspan="2"> ABKÜRZUNGEN </td></tr><tr><td> AP </td><td> Alkalische Phosphatase </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> 5-Brom-4-Chlor-3&#39;-indolyphosphate </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Rinderserumalbumin </td></tr><tr><td> CNS </td><td> Zentrales Nervensystem </td></tr><tr><td> Dig </td><td> Digoxygenin </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Dimethylsulfoxid </td></tr><tr><td> dpl </td><td> Tage nach der Läsion </td></tr><tr><td> eomesa </td><td> Eomesodermin Homolog ein </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Saures Gliafaserprotein </td></tr><tr><td> hr </td><td> Stunde </td></tr><tr><td> HYBPuffer </td><td> Hybridisierungspuffer </td></tr><tr><td> ISH </td><td> in-situ-Hybridisierung </td></tr><tr><td> MeOH </td><td> Methanol </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Nitro-Blau-Tetrazolium </td></tr><tr><td> OPCs </td><td> Oligodendrozyten-Vorläuferzellen </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td></tr><tr><td> PCNA </td><td> Proliferierende cell nuclear antigen </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Para </td></tr><tr><td> ProtK </td><td> Proteinase K </td></tr><tr><td> PSA-NCAM </td><td> Polysialyliert neuronales Zelladhäsionsmolekül </td></tr><tr><td> PTW </td><td> PBS, 0,1% Tween-20 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> Ribonukleinsäure </td></tr><tr><td> RT </td><td> Zimmertemperatur </td></tr><tr><td> SGZ </td><td> Subgranularzone </td></tr><tr><td> sox4a </td><td> SRY-Box mit Gen 4a</td></tr><tr><td> SSC </td><td> Saline-Natriumcitrat </td></tr><tr><td> SVZ </td><td> Subventrikularzone </td></tr><tr><td> TRs </td><td> Transkriptionsregulatoren </td></tr></tbody></table>

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Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

stab-wound-injury-zebrafish-adult-telencephalon-method-to-investigate

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

The Nervous System and Nervous Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

15.2K Aufrufe.  Karlsruhe Institute of Technology. To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Serie: Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

A Novel Light Damage Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafish

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, photoreceptor degeneration triggers M&#252;ller glial cells to re-enter the cell cycle and produce transient-amplifying progenitors. These progenitors continue to proliferate as they migrate to the damaged area, where they ultimately give rise to new photoreceptors. Currently, there are two widely-used LIRD paradigms, each of which results in varying degrees of photoreceptor loss and corresponding differences in the regeneration response. As more genetic and pharmacological tools are available to test the role of individual genes of interest during regeneration, there is a need to develop a robust LIRD paradigm. Here we describe a LIRD protocol that results in widespread and consistent loss of both rod and cone photoreceptors in which we have combined the use of two previously established LIRD techniques. Furthermore, this protocol can be extended for use in pigmented animals, which eliminates the need to maintain transgenic lines of interest on the albino background for LIRD studies.

Multiple light damage protocols have been described to damage photoreceptors and consequently induce a retinal regeneration response in adult zebrafish. This protocol describes an improved method that can be used in pigmented animals and that damages the vast majority of rod and cone photoreceptors across the entire retina.

A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

Light-induced retinal degeneration (LIRD) is commonly used in both rodents and zebrafish to damage rod and cone photoreceptors. In adult zebrafish, ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzung in Verursacht<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Dorsalwurzelganglion Injection und dorsale Wurzel Quetschverletzungen als Modell für Sensory Axonregeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

Modeling Amyloid-&amp;#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.