This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

Das Protokoll für den Erhalt verworfen menschlichem Gewebe von chirurgischen Patienten und die Einrichtung von Primärkulturen wurde von der University of Texas Medical Branch and University of New Mexico Institutional Review Boards genehmigt. Die allgemeinen Anforderungen an die Beschaffung menschlicher Gewebeproben ist unten beschrieben. Beachten Sie, dass seit dem Marktfaktoren können von gefrorenem Gewebe, Biobanken und kommerziellen Anbietern isoliert werden auch praktikable Möglichkeiten. 1. Besorgen Menschliches Gewebe <ol><li> Ein Protokoll zum menschlichen Dickdarmgewebe in die Ethikkommission für die Zulassung zu erhalten. </li><li> Stellen Sie die Zusammenarbeit mit allgemeine Chirurgen und / oder kolorektalen Chirurgen, um menschliches Gewebe für die Forschung zu erhalten. Die Zusammenarbeit mit der Pathologie-Abteilung ist ebenfalls obligatorisch, da sie wird die Bestimmung der Gewebe, die nicht für die Diagnose erforderlich ist, und kann für die Forschung bezeichnet werden. </li><li> Dabei muss der Pathologe die Gewebe aus der Neubildung bereitzustellen und dann Grossly normale Schleimhaut von mindestens 5 cm von dem Tumor. Ab sofort legen Sie die Proben in eiskaltem Waschmedien und auf Eis. Der Pathologe die Menge des Gewebes, die sicher für die Forschung gegeben werden kann, zu bestimmen. Die für die MF Isolierung benötigt minimale Gewebe ist 1,5 mm 2. </li><li> Verwenden Sie die erhaltenen Gewebe entweder sofort, um die Primärkulturen oder gefrier Ort und bei -80 ° C für die zukünftige Trennung zu etablieren. <ol><li> Wenn das Einfrieren für spätere Trennung, schneiden das Gewebe in etwa 1-2 mm 2 Stück, legen Sie in eine Tieftemperatur-Schlauch mit 1 ml Gefriermedium (siehe unten), und bei -80 ° C. Hinweis: Unter Verwendung dieses Protokolls hat erfolgreiche Isolierung von Marktfaktoren aus Gewebe seit über 4 Jahren eingefroren wurde beobachtet. </li></ol></li></ol> 2. Bereiten Reagenzien <ol><li> Für Kollagenase Lösung: Bereiten Sie 100 U / ml Collagenase I, II und IV in ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) mit Ca 2+ / Mg 2+ (siehe Materialien Tabelle </strong&gt;). ACHTUNG: Kollagenase aktive Einheit Konzentration und Reinheit kann von Hersteller zu Hersteller, was den Wirkungsgrad des Gewebes die Verdauung und / oder Erhaltung des Epitops auf der Schleimhautzelloberfläche behindern, kann variiert. Um diese mögliche Fallstricke zu vermeiden, verwenden Kollagenase mit höchstem Reinheitsgrad (≥95%) und bereiten die Stammlösung auf der Basis der aktiven Einheiten Konzentration. </li><li> Bereiten Sie auf Wasserbasis DNase Stammlösung bei 10 mg / ml (3,55 UA / mg). </li><li> Bereiten Wash Medien: (MEM: 89 ml, Antibiotikum-Antimykotikum, 100x: 1 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 10 ml) </li><li> Bereiten Fibroblasten-Wachstumsmedium: MEM: 500 ml Flasche; L-Glutamin (200 mM): 5 ml; MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100x Lösung: 5 ml; Ciprofloxacin HCl (10 mg / ml): 570 &amp; mgr; l; Antibiotikum-Antimykotikum, 100x-Lösung: 10 ml; Natriumpyruvat (100 mM): 5 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 50 ml </li><li> Bereiten Freeze-Medien: Fibroblasten-Wachstumsmedium (Reagenz 2.4) mit dem Zusatz von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), dann filtern-sterilize mit einem 0,22 um-Filter. </li></ol> 3. Enzymatisch Digest Menschliches Gewebe <ol><li> Wenn das Gewebe wurde in gefrier Medien, Ort Kryoröhrchen in warmen (~ 37 ° C) Wasser eingefroren, bis Gewebe und Medien wird aufgetaut. </li><li> Für 4-5 von 2 mm 2 Gewebestücke, Wäsche Gewebe zweimal mit 10 ml HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+. </li><li> Sobald Gewebe durch die Schwerkraft angesiedelt, vorsichtig den Überstand verwerfen, ohne Spinnen Probe. </li><li> 10 ml Kollagenase-Lösung der Probe und gibt das Gewebe-Lösungsgemisch in einen sterilen, DNase / RNase-freies Röhrchen mit eingebauten Rotoren zur Proben Dissoziation. Verwenden Kollagenase an die extrazelluläre Matrix, die die basale Aspekt Epithelzellen umgibt und bildet den nicht-zellulären Fraktion der mukosalen Lamina propria dissoziieren. </li><li> Dicht zu schließen Rohr und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des Dissociator (zB gentleMACS). Wenn das Labor nicht über die Zugang zu ter erwähnte Anlage, die Dauer jedes Verdauungsschritt, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, zu erhöhen. </li><li> Führen Sie das Programm h_tumor_01, enthalten eine voreingestellte Profil mit der Maschine (Gesamtlaufzeit von 36 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 268 Schuss pro Lauf). </li><li> Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator. </li><li> Inkubieren Probe für 45 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler bei 140 Umdrehungen pro Minute. Anmerkung: Für verschiedene Mengen von Gewebeproben, die Zeit kann der Verdauung proportional reduziert oder erhöht werden kann (dh, größere Mengen von Gewebe können zusätzliche Zeit erfordern). </li><li> Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator. </li><li> Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_02 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 235 Schuss pro Lauf). </li><li> Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator. </li><li> In 50 ul DNase-Stammlösung. Verwenden DNAse zu distanzieren / entfernen abgestorbene Zellen und DNA-Fraktion von Zelltrümmern, die Verklumpung Zelle führt. </li><li> Inkubieren Probe für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler mit 60 UpM. </li><li> Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator erneut. </li><li> Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_03 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 168 Schuss pro Lauf). Hinweis: Wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut, Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C, Überstand verwerfen, resuspendieren in 2 ml Zelldissoziationslösung und Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension durch sterile 70 um Zellsieb. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C. Überstand wird abgesaugt komplett. </li><li> Wash Zellpellet zweimal mit 25 ml HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+ und den Überstand verwerfen. </li><li> Vor dem letzten warh, zählen Zellzahl unter Verwendung eines automatisierten Zellzählung System zur Verfügung im Labor oder manuell mit Zählkammer. Für MF Primärkultur Generation gehen zum Schritt 3.19.1, für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie gehen für Schritt 3.19.2. <ol><li> Für die Isolierung und das Wachstum der reinen MF Kultur (Abbildung 1), den Überstand verwerfen von den letzten Zentrifugation resuspendieren Zellpellet in der entsprechenden Menge an Fibroblasten-Isolationsmedien benötigt, um den 4 x 10 6 Zellen Saatgut in 3 ml des Mediums pro Vertiefung in 6 gut, Zellkultur-behandelten Platten. Fahren Sie mit Schritt 3.20. </li><li> Für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie, legen Sie bis zu 2 x 10 6 in 2 ml Fibroblasten Isolationsmedien in 24-Well, Low-Bindungsplatte und Inkubation O / N bei 37 ° C mit 5% CO 2. Dies ist auf die Zelloberfläche Epitope, die durch die enzymatische Verfahren betroffen sein können, wiederherzustellen. Dann sammeln Zellsuspension und zählen gewonnenen Zellen und fahrenfür die Immunfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse 8. </li></ol></li><li> Wachsen Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Ändern Medien alle 2 - 3 Tage, bis die Bildung von ~ 80% konfluent MF Monoschicht (1D-E). </li><li> Passage-Zellen in T25-Kolben mit 6-Well-Platte in einem Verhältnis von 1: 1 und das Wachstum für ~ 10 bis 100% Konfluenz - 14 Tagen in Fibroblastenwachstumsmedium bis 80 zu erzielen. </li><li> Erweitern Kultur durch Passagieren Zellen von T25 bis T75 Zellen in einem Verhältnis 1: 2. Sobald Zellen Konfluenz erreichen, verwenden Sie eine Flasche für die Analyse von isolierten MF Reinheit unter Verwendung von Durchflusszytometrie, wie zuvor 5 beschrieben. Einfrieren oder einen anderen Durchgang T75-Kolben von MF Kultur bei Verhältnis 1: 3. Hinweis: Wenn mittels Durchflusszytometrie analysiert, wird erwartet, dass Darmschleimhäute stromal MF mesenchymalen Ursprungs bei Wachstum in Kultur werden folgenden Phänotyp: EpCAM-, CD31-, CD45-, Vimentin +, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Macrophage+Migration+Inhibitory+Factor+Exposure+Induces+Mesenchymal+Epithelial+Transition+and+Promotes+Gastric+and+Colon+Cancers.">Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers.</a> PLoS ONE. 9, e98656 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Während dieses Protokoll wurde für das Forschungsanwendung nur dann entwickelt, unter Berücksichtigung der wachsenden Bedeutung der kritischen Stromazellen als potentielle Krebsprognostische Biomarker und therapeutisches Ziel, die Fähigkeit, &quot;funktional&quot; Gewebeproben für eine spätere Verwendung gefrier bietet einen signifikanten Vorteil. Dies stellt einen einzigartigen Vorteil für die Erstellung von klinischen Biobanken, die dazu dient, die Entwicklung der personalisierten Medizin 10, 11 vora...

Myofibroblasten / Fibroblasten (MFS) stellen eine reiche Population von Zellen in der gastrointestinalen (GI) Schleimhaut. Diese Stromazellen gerade unterhalb von Epithel und bilden ein miteinander verbundenes Netzwerk innerhalb Schleimhaut Lamina propria im Darm. MFs sind nicht nur für die Ablagerung der extrazellulären Matrix verantwortlich, sondern durch parakrine Regulation kann Elektrolyttransport, Rückgabe und Barrierefunktion der benachbarten Epithel 1, 2 beeinflussen. Weiterhin haben MFs gezeigt, dass eine zentrale Rolle bei der Entzündung und Gewebe spielen Umbau 3, 4. Myofibroblasten sind ein kritischer Teil der Tumor-Mikroumgebung, wo sie auch als Krebs assoziierten Fibroblasten bekannt, und dazu beitragen, die das Tumorzellwachstum und dienen als Nische für Krebsstammzellen 3. Schwellen Daten legt nahe, dass Marktfaktoren können auch als lokale Antigen-präsentierende Zellen zu dienen. Zusätzlich MFs Funktion als wichtige Regulatoren der angeborenen und adaptiven Immunantwort, producing eine Vielzahl von Cytokinen und Wachstumsfaktoren. 5 Bei gesunden Menschen werden MFs Zellen vermutlich aus mesenchymalen Stammzellen zu differenzieren und Express auf ihrer Zelloberfläche, die mesenchymalen Marker CD90 3, 5. Diese Zellen sind auch positiv für Vimentin, aber negativ für Epithelzellen und hämatopoetischen Zellmarker EpCAM und CD45 , beziehungsweise. Myofibroblasten werden vorgeschlagen, um eine aktivierte Form von Fibroblasten und kann aus nicht-aktivierten Fibroblasten durch die Expression von α-SMA 5 unterscheiden. Im Laufe des letzten Jahrzehnts mehrere Ansätze zur Isolierung von Myofibroblasten aus menschlichen Darmschleimhaut wurden veröffentlicht, meist auf der ursprünglich von Mahida et al. 5-8 beschrieben berechnet. Während einzelne Studien berichten Isolierungsverfahren aus verschiedenen Darmschleimhaut, kein universelles Protokoll für die Isolierung von Marktfaktoren aus mehreren Bereichen des GI-Trakts (dh Magen, kleine und large Darmschleimhaut) ist erschienen. Die hierin enthaltenen Protokoll wurde getestet und für alle drei Gewebetyp oben erwähnt erfolgreich eingesetzt. . Darüber hinaus wurden Verfahren zur Isolierung von Marktfaktoren aus gefrorenen GI-Schleimhaut nicht berichtet worden. Wir stellen hier ein optimiertes Verfahren, die auf enzymatische Verdauung basiert, und gleichzeitig ermöglicht die Isolierung menschlicher Darmschleimhaut MFs für Kultur und Durchflusszytometrie-Analyse in frisch gespalten, einzelne Zelle, Schleimhaut Zubereitungen. Diese Technik zuverlässig liefert Primärkulturen mit einem MF-Phänotyp. Darüber hinaus können die gleichen Methoden verwendet, um die MFS an der gefrorenen Proben von Magen und Dünndarm-Gewebe zu isolieren, als auch werden. Isolierung von Myofibroblasten aus frischem Gewebe GI zuvor beschrieben wurde; jedoch die Verwendung von gefrorenen Proben stellt viele Vorteile. Das heißt, die Forscher würden von einer beliebigen Anzahl von Mitarbeitern auf der ganzen Welt, die die Capabi müssen in der Lage, sammeln und speichern Gewebenkeit auf den eingefrorenen Gewebeproben zu versenden. Darüber hinaus können die Forscher die Sammlung von gebrauchten Gewebe aus dem Operationssaal und / oder Endoskopie-Suite und sofortige Bearbeitung des Gewebes für die Isolierung, um Konflikte mit ihren aktuellen Experimente Plan zu finden. Auch aufgrund der Unvorhersehbarkeit der Chirurgie, Gewebeentnahme kann sehr spät in den Tag kommen, was die Zeit für die Verarbeitung Gewebe links begrenzen. Einfrieren Gewebe für die spätere Verarbeitung werden diese Herausforderungen zu verbessern. Schließlich sind diese Verfahren wurden erfolgreich bei der Isolierung von Kolon, Magen und Dünndarm Myofibroblasten bei Krankheitszuständen, wie beispielsweise Dickdarmkrebs und entzündlichen Darmerkrankungen eingesetzt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">MEM, 1X</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT-10-010-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ciprofloxacin HCl</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">61-277-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">L-Glutamine, 100x</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DL-Dithiothreitol solution (DTT)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:111px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DNAse</td>
			<td style="width:111px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum, Type I</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum, Type II</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Accumax cell dissociation solution</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">gentleMACS C Tubes</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">gentleMACS Dissociator</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell Strainer (70&#181;m)</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PE Mouse Anti-Human Vimentin</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">562337</td>
			<td>Clone RV202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">FITC Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F3777</td>
			<td>Clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">APC Mouse Anti-Human CD90</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">559869</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens

Fibroblasten / Myofibroblasten (MFS) wurden immer mehr an Aufmerksamkeit für ihre Rolle in der Pathogenese und ihre Beiträge sowohl für die Wundheilung und die Förderung der Tumor-Mikroumgebung. Zwar gibt es derzeit viele Techniken zur Isolierung von Marktfaktoren von gastrointestinalen (GI) Gewebe, dieses Protokoll ein neues Element der Isolierung dieser Stromazellen aus gefrorenem Gewebe. Einfrieren GI Gewebeproben nicht erlaubt nur dem Forscher Proben aus weltweit Mitarbeiter, Biobanken und kommerziellen Anbietern zu erwerben, es erlaubt auch die verzögerte Bearbeitung von frischen Proben. Die beschriebenen Protokoll konsequent liefern charakteristische spindelförmige Zellen mit dem MF-Phänotyp, der die Marker CD90, α-SMA und Vimentin auszudrücken. Da diese Zellen aus Patientenproben abgeleitet ist, verleiht die Verwendung von primären Zellen auch den Vorteil der eng nachahmt MFs an Krankheitszuständen, nämlich Krebs und entzündlichen Darmerkrankungen. Diese Technik hat been im Magen, Dünndarm und Dickdarm-MF Primärkulturerzeugung validiert. Primär MF Kulturen können in einer Vielzahl von Experimenten, über eine Anzahl von Durchgangs verwendet werden, und ihre Reinheit sowohl durch Immunzytochemie beurteilt und Durchflusszytometrie-Analyse.

Mit diesen enzymatischen Verdau Protokoll Hintergrund haben wir in der Lage gewesen, zu isolieren und zu wachsen MF Bevölkerung gut CD90 + Schleimhaut Stromazellen aus GI chirurgischen Proben und Biopsien (Abbildung 1). 5 nach dem Aussäen mononuklearen Zellsuspensionen in 6-Well-Platten (1A-B) - Sichtbare MF Kolonie Proliferation konnte am Tag 2 beobachtet werden. Die MF Primärkulturen zu erreichen ~ 50-70% Konfluenz für Tag 7 bis 11 <stro...

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Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

isolation-cd-90-fibroblastmyofibroblasts-from-human-frozen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production. 

Serie: Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...