Name: establishment of genome-edited human pluripotent stem cell lines: from targeting to isolation
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
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Diese Arbeit wurde von einem Brain Research Foundation Seed Grant (BRFSG-2014-02), um Helen Bateup unterstützt. Dirk Hockemeyer ist ein New Scholar in Altern der Ellison Medical Foundation und wird von der Glenn-Stiftung sowie der The Shurl und Kay Curci Stiftung. DH wird auch von NIH Zuschusses 1R01CA196884-01 unterstützt.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Verfahren wurden überprüft und von der UC Berkeley Stammzellforschung Oversight Committee genehmigt. 1. Bereiten Sie Stammzellen für die Bearbeitung <ol><li> Wachsen und Kultur menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) auf einer Platte mit 6 Vertiefungen, die 2,4 × 10 6 Zellen / Platte von Mitomycin C-inaktivierten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Zubringer auf Gelatine 32 gewachsen. Pflegen hPSCs in 3 ml humanen embryonalen Stammzellmedien pro Vertiefung (hESC Medien) und wachsen in eine 37 ° C-Inkubator mit 3% O 2/5% CO 2. Anmerkung: Für den Erfolg dieses Protokoll ist es nicht notwendig, hPSCs in einer sauerstoffarmen Inkubator aufrecht zu erhalten; aber es ist wichtig zu beachten, dass hPSCs vermehren sich schneller in einer hohen O 2 Umwelt, so Zeiten und Zellzahlen entsprechend angepasst werden. Es sollte auch darauf hingewiesen, dass hPSCs in niedrigen Sauerstoff gehalten haben niedrigere Rate der spontanen Differenzierung 33 werden. <ol><li> To machen 500 ml hESC Medien kombinieren, 380 ml DMEM / F12, 75 ml fötalem Rinderserum (FBS), 25 ml KnockOut Serum Ersatz (KSR). Hinzufügen Glutamin (1 mM Endkonzentration), 5 ml 100x Nicht-essentielle Aminosäuren, 100 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin (P / S), basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) (4 ng / ml Endkonzentration) und 2- Mercaptoethanol (5,5 &amp; mgr; M Endkonzentration) bestimmt. </li></ol></li><li> Verändern Medien durch Entfernen gesamte Volumen der Medien (3 ml) unter Verwendung einer Glaspipette und Vakuum. Ersetzen Sie mit 3 ml warmem hESC Medien mit einer serologischen Pipette. Wiederholen Sie die Medien verändern jeden Tag bis hPSCs sind ca. 50% konfluent (Tag -1). </li><li> Einen Tag vor Targeting (Tag -1), ändern hESC Medien, Entfernen der alten Medien und Zugabe von warmen hESC Medien mit 10 &amp; mgr; Y-27632 ergänzt. </li><li> Auch am Tag -1, bereiten 1.59 6-Well oder 10-cm-Platten von resistenten MEF Nährzellen von DR4-Mäusen (2,4 · 10 6 Zellen / Platte) 34. Hinweis: In der Regel sind 6-Well-Platten adhaften über 10 cm-Platten, da sie Platz für mehr Medien. 6-Well-Platten auch sicherstellen, dass die verschiedenen Klone aus verschiedenen Vertiefungen sind unabhängig. Wird jedoch eine 10-cm-Platte einfacher Kommissionierung erlauben, abhängig von der für diesen Prozess zur Verfügung Mikroskop. </li></ol> 2. Bearbeiten von pluripotenten Stammzellen <ol><li> Vorbereitung Transfektionslösungen durch Pipettieren von je 5 ug ZFN 1 und 2 TALEN 1 und 2 bzw. 15 ug des CRISPR / Cas9 px330 kodierenden Plasmid (Figur 1) in ein 1,5 ml Röhrchen. Pipette 30 ug des Reparatur Plasmid in diesem Rohr als auch. Schließlich Pipette 1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Röhre, um die Lautstärke bis zu 300 &amp; mgr; l zu bringen. Anmerkung: Bereiten Plasmiden als Midiprep (jeder Bausatz ist) mit einer Konzentration von mindestens 300 ng / &amp; mgr; l, um das Gesamtvolumen der Transfektionslösung unter 300 &amp; mgr; l zu halten. Es ist nicht notwendig, Phenol / Chloroform-Extraktion durchzuführen, um das Plasmid zu linearisieren, oder eine endoto verwendenxin freien Plasmid Prep Kit. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus hPSCs Verwendung einer Glaspipette und Vakuum. Pipette 2 ml warmem 1x PBS in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen. </li><li> Entfernen Sie die PBS sofort mit einer Glaspipette und Vakuum. 0,5 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung direkt auf Zellen in jeder Vertiefung. Legen in den Inkubator (37 ° C / 5% CO 2/3% O 2) für ca. 10 min. oder bis Feeder-Schicht beginnt, heben Sie die Platte. </li><li> 2 ml warmem esWash Medium (470 ml DMEM / F12, 25 ml FBS, 100 Einheiten / ml P / S) in jede Vertiefung, um das Trypsin Reaktion zu stoppen. </li><li> Sicherzustellen, dass die Feeder-Zellen aus wie ein Blatt zu kommen. Pipettieren Sie die Inhalte jeder Vertiefung in einem einzigen 50 ml konischen Röhrchen, die Kombination aller Brunnen. Man reibt Zellen unter Verwendung einer 10 ml serologische Pipette. Es ist nicht notwendig, brechen die Feeder-Schicht; hPSCs wird weg von der Feeder-Schicht durch leichtes Verreiben kommen. Es sollte etwa 15 ml der Zellsuspension werden. </li><li> 25 ml esWash Medien, um das Rohr, um die volu bringenme bis zu 40 ml insgesamt. Erlauben große Brocken Zuführung am Boden des Röhrchens für 1-2 Minuten absetzen. Entfernen Sie den Überstand (~ 38 ml) aus dem Rohr mit einer serologischen Pipette und Einzahlung auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Spin down für 5 Minuten bei 190 x g. Den Überstand aus dem Röhrchen unter Verwendung einer Glaspipette und Vakuum. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht stören. Resuspendieren der Zellen in 500 ul 1x PBS. Kombinieren Sie mit früheren vorbereitet Plasmidtransfektion Lösung. Zähle die Zellen in diesem Schritt. Verwenden Sie 5-10 Million Zellen pro Elektroporation. </li><li> Pipettieren Sie die gesamte 800 ul Suspension in eine 4 mm Elektroporationsküvette, setzen auf Eis für 3-5 min. Elektroporieren Zellen unter Verwendung des Exponential-Programm auf der Elektroporation System mit den folgenden Parametern: 250 V, 500 uF, ∞ Beständigkeit und 4 mm Küvette Größe. Nach der Elektroporation platzieren Küvette wieder auf Eis für 3 min. Hinweis: Beachten Sie die Zeitkonstante der Elektroporation auf der Elektroporation System. Die Zeitkonstantevariiert mit der Anzahl von Zellen und DNA-Reinheit. Erfolgreiche Transfektionen haben in der Regel eine Zeit zwischen 10 bis 14 ms konstant, wenn Sie die genannten Bedingungen und dem Gene Pulser II. Unter Elektroporation Effizienz kann bei Zeitkonstanten variiert von diesen Werten. </li><li> Resuspendieren elektroporierten Zellen in 18 ml warmem hESC Medien, ergänzt mit 10 &amp; mgr; M Y-27632. Platte 3 ml dieser Einzelzellsuspension in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen mit DR4-Feeder-Zellen. Zurück zum Inkubator (37 ° C / 5% CO 2/3% O 2). </li></ol> 3. Auswahl der Positive Kolonien <ol><li> Tag 2, entfernen Sie alle Medien unter Verwendung einer Glaspipette und Vakuum. Ersetzen Sie mit 3 ml warmem hESC Medien mit 10 &amp; mgr; Y-27632 ergänzt. Tag 3, entfernen Sie alle Medien unter Verwendung einer Glaspipette und Vakuum. Ersetzen Sie mit 3 ml warmem hESC Medien ohne einschließlich Y-27632. Tag 4, entfernen Sie alle Medien unter Verwendung einer Glaspipette und Vakuum. Ersetzen Sie mit 3 ml warmem hESC Medien mit Antibiotika für selecti ergänztam. Zurück zum Inkubator (37 ° C / 5% CO 2/3% O 2). Hinweis: Der Typ des Antibiotikums verwendet wird, hängt die Resistenzkassette hängt im Reparaturschablone enthalten. Beim Arbeiten mit WIBR # 3 hPSCs (NIH Register 0079), 0,5 &amp; mgr; g / ml Puromycin, 70 &amp; mgr; g / ml G418 (Geneticin) und 35 ug / ml Hygromycin wurden erfolgreich verwendet. Die Konzentrationen für die Auswahl sollte empirisch durch die Gründung der minimalen Konzentration des Antibiotikums notwendig, um Wildtyp-Zellen innerhalb von etwa einer Woche zu töten bestimmt werden. </li><li> Tage 5-12, ändern Medien täglich, den Austausch alter Medien jedes Mal mit warmem hESC Medien mit Antibiotika ergänzt. Hinweis: Erwarten Sie eine große Menge an Zelltod. Einzelne Kolonien werden offensichtlich um Tag 8-10. Regelmäßige hESC Medien ohne Antibiotika kann nach 12-14 Tagen kontinuierlicher Selektion verwendet werden. Wenn die Zelldichte hoch ist oder Zelltod langsam ist, sollte Ansäuerung des Mediums vermieden werden und es kann notwendig sein, um die Medien zu erhöhen Volume (bis zu 4-5 ml) während der ersten paar Tage der Selektion. </li></ol> 4. Heben ausgewählten Kolonien (Tag 12-14) <ol><li> Beachten Kolonien am Tag 12-14. Beachten Sie die Kolonien, die bereit sind, auf einem Dissektionsmikroskop holen und sicherzustellen, dass sie Zellen, die beginnen, zu differenzieren nicht enthalten sind. Die ungefähre Größe sollte 800-1.200 um betragen. Wenn Kolonien erreichen diese Größe vor der 12. Tag, ist es empfehlenswert, dass sie dann abgeholt werden. Hinweis: Für jede Ziel Experiment holen so notwendig wie viele Kolonien, um sicherzustellen, dass der gewünschte Genotyp isoliert. Als ein Beispiel hat AAVS1 Bearbeiten mit dem AAV-CAGGS-EGFP Reparaturschablone konsistent und stabilen Integration gezeigt und erfordert nur 12-24 Kolonien ausgewählt, um etwa 5-10 heterozygot gezielte Klone erhalten. Andere Targeting Experimente können mehr Kolonien verlangen abgeholt werden (Tabelle 1). Die Häufigkeit der korrekten Ausrichtung Ereignisse hängt von Faktoren wie der Effizienz des SSN einen DSB, die Größe des Einsatzes und die Auswahlstrategie einzuführen. Im Fall der Gen-Trap-Ansatz zur AAVS1 Locus hier präsentiert wird, der Selektionsmarker nur exprimiert, wenn sie richtig an der Zielstelle integriert, wodurch die Anzahl der Kolonien erforderlich ist, um eine korrekt gezielte Klon erhalten. </li><li> Einen Tag vor Kommissionierung, bereiten 12-Well-Platten von MEFs (2,4 x 10 6 Zellen / Platte, wird man auch verwendet werden, für jede Kolonie abgeholt). </li><li> Am Tag der Kommissionierung, entfernen Sie alle Medien aus den 12 und MEF-Platten unter Verwendung einer Glaspipette und Vakuum und Ersetzen mit 1 ml hESC Medien. Auch am Tag der Kommissionierung, ändern hESC Medien über die 6-Well-Platten, die gehen, abgeholt werden. </li><li> Ziehen Glaspipetten für die mechanische Dissoziation von einzelnen Kolonien von der Feeder-Schicht. Senken Sie die Pipetten über eine in-Kapuze Bunsenbrenner und an der Expansionspunkt erweicht, bis Glas ist formbar. Schnell zu entfernen, von der Flamme, und ziehen Sie die Pipette auseinander Schaffung einer Winkelpunkt. Breche diePunkt etwa 2 cm von dem gebogenen Achse, so dass ein schmaler Kanal. Polieren des Endes des Kanals durch Aussetzen Flamme für 1-2 sec. Hinweis: Optional abholen Kolonien eine p20 Pipettenspitze, jedoch kann dies die Klonalität der Kultur zu reduzieren, wie die stumpfe Spitze kann größere Mengen von Zellen aus jeder Kolonie in die Medien zu vertreiben, potenziell verunreinigende nachfolgenden Beute. </li><li> Montieren Aufnahmevorrichtung, indem sie einen p1000 Filterpipettenspitze und Befestigen eines Saugball um das schmale Ende. Legen Sie die herausgezogen Glaspipette in das breite Ende. </li><li> Legen Sie eine 6-Well-Platte von hPSCs auf der Bühne eines Dissektionsmikroskop in einer Gewebekultur Haube montiert abgeholt werden. Komprimieren Sie die Glühbirne der Abzugseinrichtung und vorsichtig herauszuschneiden und schneiden Sie eine Einzelkolonie in 10-20 gleich große Stücke, dabei nicht in Stücke in der Medienmitteilung. Nehmen Sie herausgeschnitten HPSC Stücke der Kolonie in die Pipette durch Lösen der Lampe. Versuchen Sie, so wenig Medien wie möglich während der Übertragung. </li><li> Transfer die Einzelkolonie auf eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-MEF Platte, komprimiert die Glühbirne wieder direkt in den Brunnen, die Freigabe der nun gebrochen Kolonie. Beschriften Sie jedes gut auf eindeutige Identifikation von Einzelzell-abgeleiteten Klonen zu erlauben. Wiederholen Sie dies für so viele Kolonien wie erforderlich, die Änderung der Glaspipette jeder Zeit. Hinweis: Die Auswahl Kolonien kann einige Zeit dauern, um zu lernen. Es wird empfohlen, den Experimentator Praxis an einigen Kontrollzellen, bevor Sie versuchen, um gezielte Kolonien zu isolieren. </li><li> Rückkehr 12 Well-Platten in den Inkubator (37 ° C / 3% O 2/5% CO 2), sanftes Schütteln der Platte zunächst um eine Ansammlung von Zellen, die in der Mitte jeder Vertiefung zu vermeiden. </li><li> Am nächsten Tag und jeden weiteren Tag, nehmen Sie volle Volumen von Medien unter Verwendung einer Glaspipette und Vakuum und Ersetzen mit 1,5 ml warmem hESC Medien, bis Zellen sind etwa 50% konfluent (dies dauert in der Regel 10-12 Tage). </li><li> Nach 10-12 Tage, nehmen 1-2 Kolonien aus jeder Vertiefung und Transfer zum neuen 12-Well-Platten neu MEFholenden Schritte 4,1 bis 4,8, um ein Replikat Platte zu erzeugen. </li><li> Extrahieren DNA (siehe unten) von den verbleibenden Kolonien in jeder Vertiefung der ursprünglichen MEF Platten. <ol><li> Entfernen Sie das Medium aus allen Vertiefungen mit einer Glaspipette und Vakuum. Pipette 1 ml 1x PBS auf jede Vertiefung, um Zellen zu waschen. Entfernen PBS mit Glaspipette und Vakuum. Pipette 250 ul Zelllysepuffer (Endkonzentrationen in H 2 O: 10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 200 mM NaCl, 0,08 mg / ml Proteinase-K) auf jede Vertiefung. Platz im Inkubator (37 ° C / 3% O 2/5% CO 2) O / N. </li><li> Am nächsten Tag, Pipetten Inhalt der Vertiefungen in einzelne 1,5 ml Gefäße. Pipette 250 ul Isopropylalkohol in jedes Rohr, um die DNA auszufällen. Schütteln Sie Rohr kräftig. Ein weißer Niederschlag sichtbar sein soll. </li><li> Spin jedes Rohr nach unten für 3 min bei 13.000 rpm in einer Tischzentrifuge. Nach dem Spin-Down, Überstand verwerfen durch Dekantieren in flüssige Abfälle. Ein kleiner DNA-Pellet sollte zum Boden stecken bleibtdas Rohr. Pipette 250 ul 70% Ethanol in jedes Rohr, um das DNA-Pellet zu waschen. Kräftig schütteln. Spin jedes Rohr nach unten für 3 min bei 13.000 rpm in einer Tischzentrifuge. </li><li> Nach Stillstand kommen, zu verwerfen Überstand durch Dekantieren in flüssige Abfälle. Ein kleiner DNA-Pellet sollte klebte an der Unterseite des Rohres verbleiben. Pipette, um den Rest des Überstandes, so gibt es keine Flüssigkeit in dem Rohr belassen. Lassen Rohr offen auf Benchtop 5-10 min trocknen. Nach dem Trocknen resuspendieren DNA in 250 ul TE Puffer. Bei 37 ° C für 6 Stunden, damit DNA zu lösen. </li></ol></li><li> Genotyp jede Probe unter Verwendung eines vorab optimierten PCR oder Southern-Blot-Strategie. Hinweis:.. Für AAVS1 Targeting mit dem AAV-CAGGS-EGFP-Reparatur-Vorlage kann der Southern-Blot-Strategie in Hockemeyer finden et al 2009 können 4 Eine umfassende Southern-Blot-Protokoll im Süden gefunden werden 2006 35 Für Multiplex-PCR Genotypisierung. Das gleiche Experiment, Primer und Bedingungen könnenin der Tabelle 2 36 gefunden. </li><li> Entsorgen Brunnen, die nicht richtig ausgerichtet sind und weiter verändernden hESC Medien zielgerichtet Zellen jeden Tag. Frieren Sie sich die Zellen, wenn sie etwa 50% konfluent sind, siehe unten für das Einfrieren Protokoll. <ol><li> Einen Tag vor dem Einfrieren, ändern hESC Medien, Entfernen der alten Medien und Zugabe von warmen hESC Medien mit 10 &amp; mgr; Y-27632 ergänzt. </li><li> Am Tag der Gefrierpunkt vorzubereiten jede 0,5 ml Lösung A und Lösung B pro Vertiefung einer 12-Well-Platte, die sich in zwei 15 ml konischen Röhrchen eingefroren wird. Ort-Lösungen auf Eis. Lösung A: 50% hESC Medien und 50% FBS; Lösung B: 80% FBS und 20% Dimethylsulfoxid (DMSO). </li><li> Distanzieren HPSC Kolonien in einzelne Zellen vor dem Einfrieren. Führen Sie die Schritte 2,2 bis 2,8, dies zu tun, Skalierung Volumen entsprechend. Komplett resuspendieren Zellpellet in 0,5 ml Lösung A. </li><li> 0,5 ml Lösung B zu Zellsuspension, Pipette nach oben und unten Zellsuspension homogen zu machen. Take das Gesamtvolumen der Zellsuspension (~ 1 ml) und Einlage in eine 2 ml Kryoröhrchen. Schraubverschluss fest zu. </li><li> Platz Kryoröhrchen in einem -80 ° C Gefrierschrank O / N. Der Tag nach dem Einfrieren, entfernen gefrorenen Zellen von -80 ° C Gefrierschrank und sofort in flüssigem Stickstoff Tank für langfristige Lagerung zu geben. </li></ol></li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die zur Isolierung homogene Populationen von Gen-bearbeitet menschlichen pluripotenten Stammzellen hier vorgestellte Methode ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Erzeugung von isogenen HPSC Linien, die nur an der geplanten Ortskurve abweichen. Diese Zellen sind ein ideales System für die Erforschung der Mechanismen des menschlichen zellulären Differenzierung und Entwicklung als auch für das Verständnis der Pathophysiologie von monogenen Erkrankungen, in einer kontrollierten genetischen Umgebung. Wie hier gezeigt, ist es möglich, drei unabhängige SSN Designstrategien (ZFNs, Talens, und CRISPR / Cas9) verwenden, um gezielte Integration an der AAVS1 Locus zu erreichen. Jede dieser Methoden hat seine eigenen Vorteile und Nachteile. Ein potentieller Vorteil der ZFNs und zu einem gewissen Grad ist TALENS ihre Designflexibilität, die iterative Technik, um die DNA-Bindungsdomänen von Einzel Nukleasen 42 verbessern kann. Diese Nuklease-Optimierung konnte die Spezifität der ZFNs und Talens hinaus, was ist erreichbar mit dem CRI erhöhenSPR / Cas9 Systems. Solche Selektivität kann wichtig für klinische Anwendungen, die einen hohen Grad an Zielspezifität. Der Hauptvorteil des CRISPR / Cas9 Systems ist seine Benutzerfreundlichkeit. Obwohl TALEN und ZFN Baukästen wurden der Öffentlichkeit zur Verfügung (dh durch Addgene 21) gemacht, sind CRISPR / Cas9 basierten Sozialversicherungsnummern deutlich einfacher zu konstruieren, als die einzige notwendige Anpassung ist eine 20-Basenpaar-Oligonukleotid (bei ​​Verwendung des px330 Plasmid Design-14). Diese Einfachheit erweist für Forschungslabors suchen, um Genom Editieren in ihren Studien sind vorteilhaft. Es gibt alternative Transfektionstechniken, einschließlich Nukleofektion 43, um Gen-bearbeitet HPSC Linien zu schaffen; jedoch Elektroporation hat sich gezeigt, konsistente und kostengünstige 4,5,25 sein. Nukleofektion kann verwendet werden, um direkt zu transfizieren Cas9-Führungs RNA Ribonukleoproteinkomplexe in den Zellkern, die Erhöhung der Effizienz SSN eind Treue 44. Wachsenden hPSCs auf MEFs ist ein robustes und kostengünstiges Verfahren zur hPSCs in einem pluripotenten Zustand ohne übermäßige Differenzierung aufrecht zu erhalten. Darüber hinaus erlaubt es die einfache Trennung von genetisch identischen Kolonien. Alternativ ist es möglich, ohne Kultur hPSCs MEFs jedoch diesen Kulturbedingungen können teurer als feeder basierend Kulturen. Darüber hinaus ist das ganze Verfahren skalierbar, so dass für die Isolierung von sehr seltenen Bearbeitungs Ereignisse oder die Erzeugung von vielen verschiedenen Zelllinien in parallele Bearbeitung Experimenten. Das hier beschriebene Protokoll ist robust; jedoch gibt es mehrere wichtige Schritte, die den Wirkungsgrad, mit dem korrekt bearbeitet Klone erhalten werden beeinflussen. Die kritischste Komponente für diese Methode ist mit hoher Qualität MEFs und arzneimittelresistente DR4 MEFs. Das Überleben der einzelnen hPSCs ist dürftig, und von geringer Qualität MEFs wird die Isolierung von undifferenzierten HPSC Linien zu behindern. Zweitens ist auch die Verwendung von Y-27632Schlüssel zur Einzelzellüberleben, ohne einen Selektionsdruck für Zellen mit einer abnormen Karyotyp 45 zu ermöglichen. Drittens, Kommissionierung gut verteilte Kolonien sichergestellt, genetische Homogenität der Zelllinien. Schließlich ist es wichtig, Glaspipetten vorzubereiten, so dass die Öffnung klein genug, um die Kolonie in viele kleinere Stücke brechen ist, sicherzustellen, dass mehrere Kolonien in der neuen gut zu wachsen. Dies ermöglicht die Kommissionierung von gut verteilte Subklone für eine Replik Platte in Kultur haben, so dass die Originalplatte isolierte Kolonien für die Genotypisierung. Eine anspruchsvolle Rolle in diesem Protokoll ist das manuelle Ziehen der Glaspipetten; Dies sollte im Vorfeld geübt werden. Es sei darauf hingewiesen, dass es mehrere Techniken des Klons Kommissionierung, die nicht einer Glaspipette erfordern werden. Experimentatoren sind aufgefordert, die eine, die für sie am besten funktioniert. Gibt es Einschränkungen bei diesem Protokoll, das von einfachen Modifikationen überwunden werden können. Ein Experiment, um o bestimmtnly stören den Locus von Interesse, ohne Reparatur oder eine, deren Reparatur Vorlage keinen Selektionskassette enthält, muss ein anderes Verfahren zum Anreichern von Zellen, die bearbeitet wurden, zu verwenden. Man beachte, dass die Zahl der Kolonien, die aufgenommen werden müssen, um einen positiven Klon zu finden stark erhöht in Abwesenheit der Selektion. Eine Strategie, um die Effizienz zu verbessern, ist Cotransfektion eines nicht-integrierenden Plasmid, das für ein fluoreszierendes Protein exprimiert. Nachdem man die Zellen für zwei Tage erholen können Zielzellen auf positive Fluoreszenz durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung sortiert und wieder ausplattiert 29. Dieses Verfahren bereichert für Zellen, die mit den Plasmiden durch Elektroporation transfiziert wurden, und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer gleichzeitigen Bearbeitung Ereignis in der Zelle, wodurch. Die hier beschriebenen Methoden kann erweitert werden, um mehrere Führungs RNAs verwenden, um gleichzeitig mehrere Ziel loci 14,46,47. Viele Protokolle wurden eingerichtet, um hPSCs unterscheidenin bestimmte Zelltypen, wodurch verschiedene genetische Manipulationen in Zelltypen von Interesse 30. Insgesamt haben wir das Potenzial für die effiziente Bearbeitung im Genom hPSCs unabhängig von SSN Wahl demonstriert. Wir schlagen vor, dass diese Technik angepasst, um isogene HPSC Linien jeder genomischen Locus, die Gen-bearbeitet haben zu schaffen.

Genome Editing-Technologien entwickeln sich rasant in die Standardwerkzeuge für Molekular- und Zellbiologie 1. Gentechnik menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) ist von besonderem Interesse, da hPSCs stellen eine selbst erneuernden Quelle genetisch intaktes primären menschlichen Zellen. hPSCs kann in verschiedene Zelltypen für Krankheitsmodelle oder als Quelle für den Transplantationstherapien 2,3 unterscheiden. Hier dargestellt ist ein Protokoll, das drei verschiedene Arten von ortsspezifischen Nukleasen (SSNs) in Verbindung mit endogenen DNS-Reparaturmechanismen zur gezielten Integration eines Reporterkonstrukt im AAVS1 Locus verwendet. Nach Transfektion von Sozialversicherungsnummern in hPSCs zeigen wir, wie man isogene Zellpopulationen zu isolieren beherbergen den Reporter. Die Möglichkeit, Genome zu manipulieren, spezifisch pluripotente Stammzellgenome ist mit SSNs kein neues Phänomen, wie die Nützlichkeit der Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptions betätigendesoder artigen Effektormolekülen Nukleasen (Talens) für die Gen-Editing wurde vor einigen Jahren 4-10 demonstriert. Doch mit dem Aufkommen von S. pyogenes CRISPR / Cas9 Technologie 11-13, Gen-Editing hat allgemein zugänglich 14 geworden. Alle SSNs Einführung einer doppelsträngigen DNA Bruch (DSB) am angegebenen Zielort 1,4,5,11, die durch endogene zelluläre Mechanismen entweder unter Verwendung nicht-homologen Ende (NHEJ) oder Homologie gerichteten Reparatur (HDR) 15 repariert wird. NHEJ ist fehleranfällig und kann Frameshift-Mutationen, was zum Verlust der Genfunktion einzuführen, während HDR ermöglicht neuartige Elemente, die durch die Co-Transfektion eines Reparatur Schablone mit der SSN eingeführt werden. Während die zugrunde liegenden Prinzipien der DNA-Reparatur, die Gen-Bearbeitung zu erleichtern sind gedacht, um weitgehend die gleichen für jede SSN gewährleisten, sind gewisse Unterschiede zwischen den Plattformen zu beachten. De-novo-Design ZFNs ermöglicht Flexibilität und Nuklease Optimierungs 16 jedoch die Verwendung von öffentlichvorhandenen Montage Bibliotheken und Screening-Tools, um einzelne ZFNs entwerfen kann zeitaufwendig sein. Sobald die gewünschte Stelle für ZFN-vermittelte Targeting bestimmt ist, kann ZFN Paare mit der Online-Werkzeug ZiFit 17 ausgebildet sein. Nach dem Design, können ZFNs modular über mehrere Runden von Plasmid-Klonen 18 zusammengebaut werden. Alternativ gibt es viele im Handel erhältliche, vorvalidierter ZFNs 19. TALE Nukleasen können mit Online-Tools und öffentlich zugängliche Bauteile 17,20 gestaltet werden. Beispielsweise kann TALENS schnell von Blöcken von fünf GESCHICHTE wiederholt zusammengebaut werden, durch FLASH-Baugruppe 21 oder unter Verwendung von PCR basierte hierarchische Golden Gate-Anordnung 22. Einfache SSN Design und Geschwindigkeit des Aufbaus mit CRISPR / Cas9 haben Genom hergestellt Bearbeitung einer breiten Masse zugänglich Werkzeug. Der Kurzführer RNA-vermittelte Targeting CRISPR / erlaubt Cas9 auch zum Multiplexen von Führungs RNAs zu mehreren Loci mit einem einzigen Konstrukt 14 zielen. Das Designder Cas9 zur Gen Bearbeitung erfordert nur die Identifikation eines protospacer benachbarten Motiv (PAM, ein NGG Trinukleotid von S. pyrogenes Cas9) proximal zu dem Zielort. Durch Einfügen eines Oligonukleotids, der dem 20 Basenpaare 5 &#39;von der PAM in den px330 Plasmid 14 kann das Konstrukt in einen Klonierungsschritt gebaut werden. Zusätzlich zu S. pyogenes Cas9, Cas9 von N. meningitidis (NmCas9), die eine 5&#39;-NNNNGATT-3 &#39;(PAM) erkennt wurde gezeigt, dass für eine effiziente Gen-Bearbeitung in hPSCs 23 ermöglichen. Zusätzlich zu den Unterschieden in einfache SSN Ausführung weist jede Plattform spezifischen Eigenschaften. Zum Beispiel ZFNs und Talens nutzen die FokI Nucleasedomäne, die eine vier Nukleotid-5&#39;-Überhang 24 erzeugt, während Cas9 wird gedacht, um vor allem zu erzeugen blunt ended DSBs. ZFNs, Talens, und Cas9 unterscheiden sich in ihrer Proteinstabilitäten, on-off-Rate auf Ziel-DNA, und die Art der DNA-Scannen, von denen c alleOuld theoretisch in kleine Unterschiede in der Bearbeitung Ergebnis 1 führen. Während weitere Studien erforderlich, um die Folgen dieser Unterschiede verstehen werden, beschreiben wir hier ein Protokoll, das sehr robust in allen drei Plattformen ist und kann verwendet werden, um leicht zu generieren gentechnisch veränderten hPSCs. Unabhängig von SSN Wahl, ist die Elektroporation ein robustes Verfahren, um Sozialversicherungsnummern und Homologie Reparatur Vorlagen in hPSCs 25 transfizieren. Die Anzahl der überlebenden Kolonien nach der Selektion auf Antibiotika-Resistenz hängt von ortsspezifischen Parameter und der Bearbeitungsstrategie (zB Größe transgener Einsatz und die Art der Auswahl). Das hier beschriebene Protokoll führt in der Regel etwa 150 bis 400 Einzelzell-abgeleiteten Kolonien. Gen-Schnitt an der AAVS1 Locus unter Verwendung dieses Protokolls wurde früher verwendet, um die Wirksamkeit der SSNs 4,5 demonstrieren. Die AAV-CAGGS-EGFP-Reparatur-Vorlage verwendet eine Gen-Trap-strategie zu Puromycin Resistenz gegen in einem Ort gezielt. Kurz gesagt, enthält das Reparaturschablone eine Spleißakzeptorstelle stromaufwärts des promotor Puromycin-Resistenz-Kassette. Auf korrekte Integration in den ersten Intron des Gens PPP1R12C am AAVS1 Locus wird die Resistenzkassette aus der bearbeiteten Gen Promoter ausgedrückt. Die Robustheit dieses spezifischen AAVS1 Assay ermöglicht es uns, die Effizienz jedes SSN Plattform zu vergleichen. Gene Editing mit Sozialversicherungsnummern ist mächtig angesichts der Möglichkeit, zu stören und / oder zu verändern theoretisch jedes Gen. Anwendung dieser Strategie hPSCs bietet Vielseitigkeit hPSCs können anschließend in einer Vielzahl von menschlichen Zelltypen, wie Neuronen 26 differenziert, Hepatozyten 27 und Kardiomyozyten 28. Außerdem ist die Verwendung von Patienten stamm pluripotenten Stammzellen ermöglicht die Reparatur oder der Einführung von bekannten Krankheit verursachenden Mutationen in einem Patienten-spezifischen genetischen Hintergrund 29 </sup&gt; Und bietet eine Plattform, um Krankheitsmechanismen und Test Therapeutika unter Verwendung von patienteneigenen Zellen 30 zu untersuchen. Zusammenfassend ist Gen-Bearbeitung in hPSCs ein effizienter und vielseitiger Ansatz zur Untersuchung der biologischen Grundlagen der menschlichen Entwicklung und Krankheit 31.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (HI)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor - basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel gene pulser II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times; Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, plugged</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml Cryotubes</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of genome-edited human pluripotent stem cell lines: from targeting to isolation

Genom-Bearbeitung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) bietet eine genetisch gesteuert und klinisch relevante Plattform, um die menschliche Entwicklung zu verstehen und zu untersuchen, die Pathophysiologie der Erkrankung. Durch die Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen (Sozialversicherungsnummern) für die Genom Bearbeitung, wird die schnelle Ableitung neuer HPSC Linien beherbergen spezifische genetische Veränderungen in einem ansonsten isogenen Einstellung möglich. Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs), Transkriptionsaktivator artigen Effektormolekülen Nukleasen (Talens) und Clustered regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) / Cas9 sind die am häufigsten verwendeten Sozialversicherungsnummern. Alle diese Nukleasen funktionieren durch Einführen eines doppelsträngigen DNA-Bruch bei einem bestimmten Ort und damit eine präzise Bearbeitung Gens fördern bei einer genomischen Locus. SSN-meditierte Genombearbeitung nutzt zwei der endogenen DNA-Reparaturmechanismen der Zelle, nicht-homologen Ende (NHEJ) und Homologie gerichtet Reparatur (HDR), um entweder einzuführen Einfügen / Löschen Mutationen oder alter das Genom mit einer homologen Reparatur-Vorlage an der Stelle des Doppelstrangbruch. Elektroporation von hPSCs ist ein effizientes Mittel zur Transfektion Sozialversicherungsnummern und Reparatur-Vorlagen, die Transgene beinhalten, wie beispielsweise fluoreszierende Reporter und Antibiotikaresistenz-Kassetten. Nach der Elektroporation, ist es möglich, nur die hPSCs dass die Reparaturkonstrukt durch Selektion auf Antibiotika-Resistenz einge isolieren. Mechanisches Trennen HPSC Kolonien und Bestätigung angemessene Integration am Zielort durch Genotypisierung ermöglicht die Isolierung des korrekt ausgerichtet und genetisch homogenen Zelllinien. Die Gültigkeit dieses Protokolls ist hier durch Verwendung aller drei SSN-Plattformen zu integrieren EGFP und einem Puromycin-Resistenz-Konstrukts in der AAVS1 Safe-Harbor-Locus in der menschlichen pluripotenten Stammzellen nachgewiesen.

Hier zeigen wir ein Protokoll mit drei verschiedenen SSN-Plattformen, um gentechnisch HPSC Linien schaffen kompatibel. Wir gezielte WIBR # 3 humanen embryonalen Stammzellen am AAVS1 Locus mit früher veröffentlichten ZFNs 4, 5 und Talens CRISPR / Cas9s 37 mit Hilfe eines Reparatur-Vorlage, die eine EGFP Reporter und ein Puromycin-Resistenz-Kassette 4 führt. Wir kultiviert unseren hPSCs auf MEFs für eine Zellkultur-Workflow ermöglicht den Erhalt und Ausbau der undifferenzierten hPSCs (Abbildung 2), das ist auch kostengünstig und skalierbar. Wenn Zellen länger als notwendig geworden besteht ein Risiko erhöhter Differenzierung, die Verringerung der Anzahl von pluripotenten Zellen, die transfiziert sind und folglich die Anzahl der korrekt ausgerichtet HPSC Kolonien erhalten. Wir electroporated 5,0 x 10 6 Zellen pro SSN Plattform und plattiert die Zellen aus jeder Ausrichtung auf einer einzelnen Platte mit 6 Vertiefungen von DR4 MEFs. Nach Auswahl der gewünschten Folge jede Plattform in EGFP-positiven Kolonien (Figur 3) und eine Kombination von ungezielte, homozygot gezielte und heterozygot gezielte Klone (4A, B; Tabelle 3). Unter den hier vorgestellten Bedingungen, so finden wir, daß die AAVS1 TALENS ergaben den EGFP-positiven Klone. Die Reparaturschablone für dieses Experiment verwendet wird, besteht aus einer Spleißakzeptorstelle stromaufwärts von der EGFP Reporter und Puromycin-Resistenz-Kassette. Mit diesen &quot;gene-trap&quot; -Strategie (Abbildung 1), sollte das Konstrukt in das erste Intron des AAVS1 Locus einzufügen, mit dem endogenen Promotor die Expression des Puromycin-Resistenz-Kassette zu fahren. Der Mangel an einem Promotor, der die Expression des Puromycin-Resistenzgen im Reparatur Vorlage sollte die Expression in die verhindern<html> Falle der zufälligen Integration. Daher erwarten wir, dass alle Puromycin-resistenten Klone würde am AAVS1 Website ausgerichtet werden. Es sei darauf hingewiesen, dass eine Untergruppe von Klonen führen aberrant Integrationen im AAVS1 Locus, durch Southern-Blot unter Verwendung einer internen Sonde nachweisbar sind, aber nicht durch die meisten PCR-Strategien (1; 4C) 4. Diese Integrationsereignisse sind wahrscheinlich das Ergebnis von heterologen Targeting-Ereignisse, die zu mehreren Integrationen des Donorplasmids 4. Wir wählten 24 Kolonien von jeder SSN Experiment und festgestellt, dass alle Plattformen hatte sehr hohe Wirkungsgrade Targeting und zeigte nur geringe Unterschiede. Wie durch PCR verhört, ergab CRISPR / Cas9 die meisten korrekt ausgerichtet, während die Klone TALEN Plattform hatte die meisten homozygot gezielte Klone (Tabelle 3). /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Abbildung 1. Schematische des Gens bearbeitet AAVS1 Locus mit dem AAV-CAGGS-EGFP-Reparatur-Vorlage. Geändert von Hockemeyer et al., 2009 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" /> Abbildung 2. Kolonien von WIBR # 3-Zellen. Repräsentative Hellfeldbilder von Kolonien von WIBR # 3 humanen embryonalen Stammzellen vor Targeting. Beachten Sie die fehlende Differenzierung und die klare Trennung von der Feeder-Schicht in einer idealen Kolonie (links) im Vergleich zu einer nicht-idealen (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a><img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" /> Abbildung 3. EGFP-positive WIBR # 3-Zellen. Repräsentative Bilder der WIBR # 3-Zellen mit einem EGFP-exprimierenden Reparatur Vorlage am AAVS1 Locus ausgerichtet. Bilder repräsentativer Kolonien mit ZFNs editiert, Talens und CRISPR / Cas9 angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" /> Abbildung 4. Genotypisierung Strategien korrekte Ausrichtung zu bestätigen. (A) Repräsentative PCR Genotypisierung Ergebnisse zeigen ungezielte, heterozygote und homozygote gezielte Klone über die drei SSN-Plattformen. WT CTL = Wildtyp-Kontrolle. (B) Repretreter Southern-Blot-Ergebnisse, die eine heterozygote gezielte Klon und eine homozygote mit einem 3 &#39;externe Sonde nachgewiesen gezielte Klon. Fragmentgrößen: WT-6,5 kb, Bearbeitet-6,9 kb. (C) Repräsentative Southern-Blot-Ergebnisse, die einen richtig bearbeitet Klon und eine heterozygote Klon mit einer nicht-zufälligen Doppel Integration. Fragmentgrößen:. Richtig bearbeitet-6,9 kb, anomale zusätzliche Integration-5 kb <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Studie </td><td> Gene Gezielte </td><td> Plattform </td><td> Reparatur Vorlagentyp </td><td> Anzahl Klone gepickt </td><td> Targeting-Effizienz </td></tr><tr><td> Sexton et al., 2014 </td><td> TPP1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td&gt; <td> nicht gemeldet </td><td> nicht gemeldet </td></tr><tr><td> Sexton et al., 2014 </td><td> TERT </td><td> ZFN </td><td> Hygromycin </td><td> nicht gemeldet </td><td> nicht gemeldet </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> POU5F1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 31 </td><td> 39,0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> PITX3 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 74 </td><td> 14,9% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2011, </td><td> POU5F1 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 68 </td><td> 91,0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2011, </td><td> PITX3 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 96 </td><td> 13,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> VASA </td><td> Cas9 </td><td> Reporter-Geneticin </td><td> 139 </td><td> 94,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al. &lt;/ em&gt; 2015 </td><td> CRH </td><td> Cas9 </td><td> Reporter-Geneticin </td><td> 30 </td><td> 9.30% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> HCRT </td><td> Cas9 </td><td> Reporter-Geneticin </td><td> 154 </td><td> 92,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> HMX2 </td><td> Cas9 </td><td> Reporter-Geneticin </td><td> 11 </td><td> 45,0% </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Nterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> nicht gemeldet </td><td> 30,0% </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Cterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> nicht gemeldet </td><td> 14,0% </td></tr><tr><td> Soldner et al., 2011, </td><td> SNCA </td><td> ZFN </td><td> Puro </td><td> 96 </td><td> 1,0% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Beschreibung von anderen Genen gezielte Verwendung dieser Methode mit correchenden Zielwirkungsgrade von bisher veröffentlichten Studien entnommen. 4,5,38-41 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ort </td><td> Sequenz </td><td> Hinweise </td></tr><tr><td> AAVS1-F-Primer </td><td> CTCTAACGCTGCCGTCTCTC </td><td> PCR-Bedingungen: T m = 57 ° C, 35 Zyklen </td></tr><tr><td> AAVS1-WT-R Primer </td><td> GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG </td><td> WT-Band: 1273 bp </td></tr><tr><td> AAVS1-Targeted-R Primer </td><td> CGTCACCGCATGTTAGAAGA </td><td> Gezielte Band: 992 bp </td></tr><tr><td> T2-Cas9-Führer </td><td> GGGCCACTAGGGACAGGAT </td><td> Mali et al., 2013 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-Rechts </td><td> TAGGGACAGGAT </td><td> Von Hockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-Linker </td><td> TGGGGTGTCACC </td><td> Von Hockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-Rechts </td><td> TCCTAACCACTGTCTTT </td><td> Aus Hockemeyer et al., 2011, </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-Linker </td><td> CCCCTCCACCCCACAGT </td><td> Aus Hockemeyer et al., 2011, </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Liste der Primer und SSN Targeting-Sequenzen. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Targeting-Konstrukt </td><td> Anzahl von EGFP + Kolonien </td><td> Gezielte abgeholt Klone (PCR überprüft) </td><td> Zurück Berichtet Correct Targeting Effizienz (durch Southern-Blot) </td></tr><tr><td> ZFN </td><td> 150 </td><td> 86,9% (73,9% het / 13,0% homo) </td><td> 56% (50% het / 6% homo) </td></tr><tr><td> TALEN </td><td> 412 </td><td> 91,3% (47,8% het / 39,1% homo) </td><td> 47% (37,5% het / 9,3% homo) </td></tr><tr><td> CRISPR-Cas9 </td><td> 235 </td><td> 95,7% (69,5% het / 26,3% homo) </td><td> nicht gemeldet </td></tr></tbody></table> Tabelle 3 Vergleichszahlen EGFP-positive und ziel TALEN, ZFN und CRISPR / Cas9 menschlichen Stammzellenkolonien. PCR verifiziert Integrationen am AAVS1 Locus für dieses Experiment sind Southern-Blot verifiziert korrekte Einzel Integrationen in früheren Experimenten 4,5 verglichen.

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Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K Aufrufe.  University of California, Berkeley. Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance. 

Serie: Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Genetik

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Biologie

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is still time consuming. Comparative studies that use recombinant lines with transgenes integrated into safe harbor loci could benefit from approaches that use site-specific targeted recombinases, like Cre or FLPe, which are more rapid and less prone to off-target effects. Such methods have been described, although they do not significantly outperform gene targeting in most aspects. Using Zinc-finger nucleases, we previously created a master cell line in the AAVS1 locus of hPSCs&#160;that contains a GFP-Hygromycin-tk expressing cassette, flanked by heterotypic FRT sequences. Here, we describe the procedures to perform FLPe recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) using this line. The master cell line is transfected with a RMCE donor vector, which contains a promoterless Puromycin resistance, and with FLPe recombinase. Application of both a positive (Puromycin) and negative (FIAU) selection program leads to the selection of RMCE without random integrations. RMCE generates fully characterized pluripotent polyclonal transgenic lines in 15 d&#160;with 100% efficiency. Despite the recently described limitations of the AAVS1 locus, the ease of the system paves the way for hPSC transgenesis in isogenic settings, is necessary for comparative studies, and enables semi-high-throughput genetic screens for gain/loss of function analysis that would otherwise be highly time consuming.

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Here we report a rapid and efficient gene editing method based on RMCE in the AAVS1 locus of human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) that improves upon previously described systems. Using this technique, isogenic lines can be rapidly and reliably generated for proper comparative studies, facilitating transgenesis-mediated research with hPSCs.

Eine schnelle und effiziente Erzeugung von rekombinanten humanen pluripotenten Stammzellen durch Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch in der<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Medizin

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Ableitung und Charakterisierung eines Transgens freie Menschen induzierten pluripotenten Stammzelllinie und Umwandlung in Definierte Clinical-Grade Bedingungen

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical application of this technique, particularly in pluripotent stem cells, presents certain challenges, such as being time- and labor-intensive and having low editing efficiency. Here, we describe the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in a human embryonic stem cell (hESC) line stably expressing sgRNAs for the L2HGDH gene, using a highly efficient and stable lentiviral-mediated gene delivery system. The sgRNAs targeting exon 1 of the L2HGDH gene were chemically synthesized and cloned into the lentiCRISPR v2-puro vector, which combines the constitutive expression of sgRNAs with Cas9 in a highly efficient single-vector system to achieve higher lentiviral titers for hESC infection and stable selection using puromycin. Puromycin-selected cells were further expanded, and single-cell clones were obtained using the limited dilution method. The single clones were expanded, and several homozygous knockout clones for the L2HGDH gene were obtained, as confirmed by a 100% reduction in L2HGDH expression using Western blot analysis. Furthermore, using MSBSP-PCR, the CRISPR mutation site was mapped upstream of the PAM recognition sequence of Cas9 in the selected homozygous clones. Sanger sequencing was performed to analyze the exact insertions/deletions, and functional characterization of the clones was conducted. This method produced a significantly higher percentage of homozygous deletions compared to previously reported non-viral gene delivery methods. Although this report focuses on the L2HGDH gene, this robust and cost-effective approach can be used to create homozygous knockouts for other genes in pluripotent stem cells for gene function studies.

<meta charset="utf8"></head><body>CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

The presented method describes the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in the human embryonic stem cell (hESC) line H9, which stably expresses sgRNAs targeting the L2HGDH gene using a highly efficient lentiviral-mediated gene delivery system.

CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...