Name: isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens
Uploaded: 2016-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
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This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

Das Protokoll für den Erhalt verworfen menschlichem Gewebe von chirurgischen Patienten und die Einrichtung von Primärkulturen wurde von der University of Texas Medical Branch and University of New Mexico Institutional Review Boards genehmigt. Die allgemeinen Anforderungen an die Beschaffung menschlicher Gewebeproben ist unten beschrieben. Beachten Sie, dass seit dem Marktfaktoren können von gefrorenem Gewebe, Biobanken und kommerziellen Anbietern isoliert werden auch praktikable Möglichkeiten. 1. Besorgen Menschliches Gewebe <ol><li> Ein Protokoll zum menschlichen Dickdarmgewebe in die Ethikkommission für die Zulassung zu erhalten. </li><li> Stellen Sie die Zusammenarbeit mit allgemeine Chirurgen und / oder kolorektalen Chirurgen, um menschliches Gewebe für die Forschung zu erhalten. Die Zusammenarbeit mit der Pathologie-Abteilung ist ebenfalls obligatorisch, da sie wird die Bestimmung der Gewebe, die nicht für die Diagnose erforderlich ist, und kann für die Forschung bezeichnet werden. </li><li> Dabei muss der Pathologe die Gewebe aus der Neubildung bereitzustellen und dann Grossly normale Schleimhaut von mindestens 5 cm von dem Tumor. Ab sofort legen Sie die Proben in eiskaltem Waschmedien und auf Eis. Der Pathologe die Menge des Gewebes, die sicher für die Forschung gegeben werden kann, zu bestimmen. Die für die MF Isolierung benötigt minimale Gewebe ist 1,5 mm 2. </li><li> Verwenden Sie die erhaltenen Gewebe entweder sofort, um die Primärkulturen oder gefrier Ort und bei -80 ° C für die zukünftige Trennung zu etablieren. <ol><li> Wenn das Einfrieren für spätere Trennung, schneiden das Gewebe in etwa 1-2 mm 2 Stück, legen Sie in eine Tieftemperatur-Schlauch mit 1 ml Gefriermedium (siehe unten), und bei -80 ° C. Hinweis: Unter Verwendung dieses Protokolls hat erfolgreiche Isolierung von Marktfaktoren aus Gewebe seit über 4 Jahren eingefroren wurde beobachtet. </li></ol></li></ol> 2. Bereiten Reagenzien <ol><li> Für Kollagenase Lösung: Bereiten Sie 100 U / ml Collagenase I, II und IV in ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) mit Ca 2+ / Mg 2+ (siehe Materialien Tabelle </strong&gt;). ACHTUNG: Kollagenase aktive Einheit Konzentration und Reinheit kann von Hersteller zu Hersteller, was den Wirkungsgrad des Gewebes die Verdauung und / oder Erhaltung des Epitops auf der Schleimhautzelloberfläche behindern, kann variiert. Um diese mögliche Fallstricke zu vermeiden, verwenden Kollagenase mit höchstem Reinheitsgrad (≥95%) und bereiten die Stammlösung auf der Basis der aktiven Einheiten Konzentration. </li><li> Bereiten Sie auf Wasserbasis DNase Stammlösung bei 10 mg / ml (3,55 UA / mg). </li><li> Bereiten Wash Medien: (MEM: 89 ml, Antibiotikum-Antimykotikum, 100x: 1 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 10 ml) </li><li> Bereiten Fibroblasten-Wachstumsmedium: MEM: 500 ml Flasche; L-Glutamin (200 mM): 5 ml; MEM nicht-essentiellen Aminosäuren, 100x Lösung: 5 ml; Ciprofloxacin HCl (10 mg / ml): 570 &amp; mgr; l; Antibiotikum-Antimykotikum, 100x-Lösung: 10 ml; Natriumpyruvat (100 mM): 5 ml; hitzeinaktiviertem FCS: 50 ml </li><li> Bereiten Freeze-Medien: Fibroblasten-Wachstumsmedium (Reagenz 2.4) mit dem Zusatz von 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), dann filtern-sterilize mit einem 0,22 um-Filter. </li></ol> 3. Enzymatisch Digest Menschliches Gewebe <ol><li> Wenn das Gewebe wurde in gefrier Medien, Ort Kryoröhrchen in warmen (~ 37 ° C) Wasser eingefroren, bis Gewebe und Medien wird aufgetaut. </li><li> Für 4-5 von 2 mm 2 Gewebestücke, Wäsche Gewebe zweimal mit 10 ml HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+. </li><li> Sobald Gewebe durch die Schwerkraft angesiedelt, vorsichtig den Überstand verwerfen, ohne Spinnen Probe. </li><li> 10 ml Kollagenase-Lösung der Probe und gibt das Gewebe-Lösungsgemisch in einen sterilen, DNase / RNase-freies Röhrchen mit eingebauten Rotoren zur Proben Dissoziation. Verwenden Kollagenase an die extrazelluläre Matrix, die die basale Aspekt Epithelzellen umgibt und bildet den nicht-zellulären Fraktion der mukosalen Lamina propria dissoziieren. </li><li> Dicht zu schließen Rohr und befestigen Sie den Kopf auf die Hülse des Dissociator (zB gentleMACS). Wenn das Labor nicht über die Zugang zu ter erwähnte Anlage, die Dauer jedes Verdauungsschritt, um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, zu erhöhen. </li><li> Führen Sie das Programm h_tumor_01, enthalten eine voreingestellte Profil mit der Maschine (Gesamtlaufzeit von 36 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 268 Schuss pro Lauf). </li><li> Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator. </li><li> Inkubieren Probe für 45 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler bei 140 Umdrehungen pro Minute. Anmerkung: Für verschiedene Mengen von Gewebeproben, die Zeit kann der Verdauung proportional reduziert oder erhöht werden kann (dh, größere Mengen von Gewebe können zusätzliche Zeit erfordern). </li><li> Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator. </li><li> Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_02 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 235 Schuss pro Lauf). </li><li> Nach Beendigung des Programms, nehmen Sie Rohr aus dem Dissociator. </li><li> In 50 ul DNase-Stammlösung. Verwenden DNAse zu distanzieren / entfernen abgestorbene Zellen und DNA-Fraktion von Zelltrümmern, die Verklumpung Zelle führt. </li><li> Inkubieren Probe für 30 min bei 37 ° C unter ständiger Rotation auf einem Schüttler mit 60 UpM. </li><li> Befestigen Rohr Oberseite nach unten auf die Hülse des Dissociator erneut. </li><li> Wählen Sie und führen Sie das Programm h_tumor_03 (Gesamtlaufzeit von 37 sec, mit intermittierender Impulse im Bereich von 1.000 - 4.000 min mit 168 Schuss pro Lauf). Hinweis: Wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut, Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C, Überstand verwerfen, resuspendieren in 2 ml Zelldissoziationslösung und Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension durch sterile 70 um Zellsieb. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei 250 × g für 10 min bei 20 ° C. Überstand wird abgesaugt komplett. </li><li> Wash Zellpellet zweimal mit 25 ml HBSS ohne Ca 2+ / Mg 2+ und den Überstand verwerfen. </li><li> Vor dem letzten warh, zählen Zellzahl unter Verwendung eines automatisierten Zellzählung System zur Verfügung im Labor oder manuell mit Zählkammer. Für MF Primärkultur Generation gehen zum Schritt 3.19.1, für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie gehen für Schritt 3.19.2. <ol><li> Für die Isolierung und das Wachstum der reinen MF Kultur (Abbildung 1), den Überstand verwerfen von den letzten Zentrifugation resuspendieren Zellpellet in der entsprechenden Menge an Fibroblasten-Isolationsmedien benötigt, um den 4 x 10 6 Zellen Saatgut in 3 ml des Mediums pro Vertiefung in 6 gut, Zellkultur-behandelten Platten. Fahren Sie mit Schritt 3.20. </li><li> Für die Analyse und Sortierung von Marktfaktoren mittels Durchflusszytometrie, legen Sie bis zu 2 x 10 6 in 2 ml Fibroblasten Isolationsmedien in 24-Well, Low-Bindungsplatte und Inkubation O / N bei 37 ° C mit 5% CO 2. Dies ist auf die Zelloberfläche Epitope, die durch die enzymatische Verfahren betroffen sein können, wiederherzustellen. Dann sammeln Zellsuspension und zählen gewonnenen Zellen und fahrenfür die Immunfärbung und Durchflusszytometrie-Analyse 8. </li></ol></li><li> Wachsen Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. Ändern Medien alle 2 - 3 Tage, bis die Bildung von ~ 80% konfluent MF Monoschicht (1D-E). </li><li> Passage-Zellen in T25-Kolben mit 6-Well-Platte in einem Verhältnis von 1: 1 und das Wachstum für ~ 10 bis 100% Konfluenz - 14 Tagen in Fibroblastenwachstumsmedium bis 80 zu erzielen. </li><li> Erweitern Kultur durch Passagieren Zellen von T25 bis T75 Zellen in einem Verhältnis 1: 2. Sobald Zellen Konfluenz erreichen, verwenden Sie eine Flasche für die Analyse von isolierten MF Reinheit unter Verwendung von Durchflusszytometrie, wie zuvor 5 beschrieben. Einfrieren oder einen anderen Durchgang T75-Kolben von MF Kultur bei Verhältnis 1: 3. Hinweis: Wenn mittels Durchflusszytometrie analysiert, wird erwartet, dass Darmschleimhäute stromal MF mesenchymalen Ursprungs bei Wachstum in Kultur werden folgenden Phänotyp: EpCAM-, CD31-, CD45-, Vimentin +, α-SMA +, CD90 +. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Während dieses Protokoll wurde für das Forschungsanwendung nur dann entwickelt, unter Berücksichtigung der wachsenden Bedeutung der kritischen Stromazellen als potentielle Krebsprognostische Biomarker und therapeutisches Ziel, die Fähigkeit, &quot;funktional&quot; Gewebeproben für eine spätere Verwendung gefrier bietet einen signifikanten Vorteil. Dies stellt einen einzigartigen Vorteil für die Erstellung von klinischen Biobanken, die dazu dient, die Entwicklung der personalisierten Medizin 10, 11 vora...

Myofibroblasten / Fibroblasten (MFS) stellen eine reiche Population von Zellen in der gastrointestinalen (GI) Schleimhaut. Diese Stromazellen gerade unterhalb von Epithel und bilden ein miteinander verbundenes Netzwerk innerhalb Schleimhaut Lamina propria im Darm. MFs sind nicht nur für die Ablagerung der extrazellulären Matrix verantwortlich, sondern durch parakrine Regulation kann Elektrolyttransport, Rückgabe und Barrierefunktion der benachbarten Epithel 1, 2 beeinflussen. Weiterhin haben MFs gezeigt, dass eine zentrale Rolle bei der Entzündung und Gewebe spielen Umbau 3, 4. Myofibroblasten sind ein kritischer Teil der Tumor-Mikroumgebung, wo sie auch als Krebs assoziierten Fibroblasten bekannt, und dazu beitragen, die das Tumorzellwachstum und dienen als Nische für Krebsstammzellen 3. Schwellen Daten legt nahe, dass Marktfaktoren können auch als lokale Antigen-präsentierende Zellen zu dienen. Zusätzlich MFs Funktion als wichtige Regulatoren der angeborenen und adaptiven Immunantwort, producing eine Vielzahl von Cytokinen und Wachstumsfaktoren. 5 Bei gesunden Menschen werden MFs Zellen vermutlich aus mesenchymalen Stammzellen zu differenzieren und Express auf ihrer Zelloberfläche, die mesenchymalen Marker CD90 3, 5. Diese Zellen sind auch positiv für Vimentin, aber negativ für Epithelzellen und hämatopoetischen Zellmarker EpCAM und CD45 , beziehungsweise. Myofibroblasten werden vorgeschlagen, um eine aktivierte Form von Fibroblasten und kann aus nicht-aktivierten Fibroblasten durch die Expression von α-SMA 5 unterscheiden. Im Laufe des letzten Jahrzehnts mehrere Ansätze zur Isolierung von Myofibroblasten aus menschlichen Darmschleimhaut wurden veröffentlicht, meist auf der ursprünglich von Mahida et al. 5-8 beschrieben berechnet. Während einzelne Studien berichten Isolierungsverfahren aus verschiedenen Darmschleimhaut, kein universelles Protokoll für die Isolierung von Marktfaktoren aus mehreren Bereichen des GI-Trakts (dh Magen, kleine und large Darmschleimhaut) ist erschienen. Die hierin enthaltenen Protokoll wurde getestet und für alle drei Gewebetyp oben erwähnt erfolgreich eingesetzt. . Darüber hinaus wurden Verfahren zur Isolierung von Marktfaktoren aus gefrorenen GI-Schleimhaut nicht berichtet worden. Wir stellen hier ein optimiertes Verfahren, die auf enzymatische Verdauung basiert, und gleichzeitig ermöglicht die Isolierung menschlicher Darmschleimhaut MFs für Kultur und Durchflusszytometrie-Analyse in frisch gespalten, einzelne Zelle, Schleimhaut Zubereitungen. Diese Technik zuverlässig liefert Primärkulturen mit einem MF-Phänotyp. Darüber hinaus können die gleichen Methoden verwendet, um die MFS an der gefrorenen Proben von Magen und Dünndarm-Gewebe zu isolieren, als auch werden. Isolierung von Myofibroblasten aus frischem Gewebe GI zuvor beschrieben wurde; jedoch die Verwendung von gefrorenen Proben stellt viele Vorteile. Das heißt, die Forscher würden von einer beliebigen Anzahl von Mitarbeitern auf der ganzen Welt, die die Capabi müssen in der Lage, sammeln und speichern Gewebenkeit auf den eingefrorenen Gewebeproben zu versenden. Darüber hinaus können die Forscher die Sammlung von gebrauchten Gewebe aus dem Operationssaal und / oder Endoskopie-Suite und sofortige Bearbeitung des Gewebes für die Isolierung, um Konflikte mit ihren aktuellen Experimente Plan zu finden. Auch aufgrund der Unvorhersehbarkeit der Chirurgie, Gewebeentnahme kann sehr spät in den Tag kommen, was die Zeit für die Verarbeitung Gewebe links begrenzen. Einfrieren Gewebe für die spätere Verarbeitung werden diese Herausforderungen zu verbessern. Schließlich sind diese Verfahren wurden erfolgreich bei der Isolierung von Kolon, Magen und Dünndarm Myofibroblasten bei Krankheitszuständen, wie beispielsweise Dickdarmkrebs und entzündlichen Darmerkrankungen eingesetzt.

<table><tbody><tr><td>MEM, 1x</td><td>Corning</td><td>MT-10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin HCl</td><td>Corning</td><td>61-277-RF</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acids</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol solution (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from&amp;nbsp;Clostridium histolyticum, Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from&amp;nbsp;Clostridium histolyticum, Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1764</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Accumax cell dissociation solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (70 &amp;micro;m)</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human Vimentin</td><td>BD Biosciences</td><td>562337</td><td>Clone RV202</td></tr><tr><td>FITC Monoclonal Anti-Actin, &amp;alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3777</td><td>Clone 1A4</td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td>Clone 5E10</td></tr></tbody></table>

isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens

Fibroblasten / Myofibroblasten (MFS) wurden immer mehr an Aufmerksamkeit für ihre Rolle in der Pathogenese und ihre Beiträge sowohl für die Wundheilung und die Förderung der Tumor-Mikroumgebung. Zwar gibt es derzeit viele Techniken zur Isolierung von Marktfaktoren von gastrointestinalen (GI) Gewebe, dieses Protokoll ein neues Element der Isolierung dieser Stromazellen aus gefrorenem Gewebe. Einfrieren GI Gewebeproben nicht erlaubt nur dem Forscher Proben aus weltweit Mitarbeiter, Biobanken und kommerziellen Anbietern zu erwerben, es erlaubt auch die verzögerte Bearbeitung von frischen Proben. Die beschriebenen Protokoll konsequent liefern charakteristische spindelförmige Zellen mit dem MF-Phänotyp, der die Marker CD90, α-SMA und Vimentin auszudrücken. Da diese Zellen aus Patientenproben abgeleitet ist, verleiht die Verwendung von primären Zellen auch den Vorteil der eng nachahmt MFs an Krankheitszuständen, nämlich Krebs und entzündlichen Darmerkrankungen. Diese Technik hat been im Magen, Dünndarm und Dickdarm-MF Primärkulturerzeugung validiert. Primär MF Kulturen können in einer Vielzahl von Experimenten, über eine Anzahl von Durchgangs verwendet werden, und ihre Reinheit sowohl durch Immunzytochemie beurteilt und Durchflusszytometrie-Analyse.

Mit diesen enzymatischen Verdau Protokoll Hintergrund haben wir in der Lage gewesen, zu isolieren und zu wachsen MF Bevölkerung gut CD90 + Schleimhaut Stromazellen aus GI chirurgischen Proben und Biopsien (Abbildung 1). 5 nach dem Aussäen mononuklearen Zellsuspensionen in 6-Well-Platten (1A-B) - Sichtbare MF Kolonie Proliferation konnte am Tag 2 beobachtet werden. Die MF Primärkulturen zu erreichen ~ 50-70% Konfluenz für Tag 7 bis 11 <stro...

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Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production. 

Serie: Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolierung und Charakterisierung von Quantitative Immunzytochemische Primäre myogenen Zellen und Fibroblasten aus menschlichen Skelettmuskel

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Isolierung von papillären und retikulären Fibroblasten aus der menschlichen Haut durch Fluoreszone-aktivierte Zellsortierung

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

Genetik

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Medizin

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Biotechnik

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Biologie

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of primary fibroblasts derived from keloid tissue are the basis for further studies of the biological function and molecular mechanisms of keloids, as well as new therapeutic strategies for treating them. The traditional method of obtaining primary fibroblasts has limitations, such as poor cellular state, mixing with other types of cells, and susceptibility to contamination. This paper describes an optimized and easily reproducible protocol that could reduce the occurrence of possible issues when obtaining fibroblasts. In this protocol, fibroblasts can be observed 5 days after isolation and reach nearly 80% confluency after 10 days of culture. Then, the fibroblasts are passaged and verified using PDGFR&#945; and vimentin antibodies for immunofluorescence assays and CD90 antibodies for flow cytometry. In conclusion, fibroblasts from keloid tissue can be easily acquired through this protocol, which can provide an abundant and stable source of cells in the laboratory for keloid research.

This study describes an optimized protocol for establishing primary fibroblasts from keloid tissues that can effectively and steadily provide pure and viable fibroblasts.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...