This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.

Tier Arbeit wurde von der Ethikkommission der Veterinäramt Fribourg, Schweiz genehmigt. Das Protokoll folgt den Richtlinien für die Tierpflege und Experimentieren an unserer Hochschule. 1. Herstellung eines Set-up für die Inkubation von isolierten Arterien <ol><li> Konstrukt ein Organbad System , das auf 37 ° C erhitzt werden kann und belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2 aus einem Kohlenstoffgastank. </li><li> Bereiten so viel Krebs-Ringer - Bicarbonat - Puffer , wie mit der Konzentration der folgenden Zusammensetzung benötigt: (118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM NaHCO 3, 0,026 mM EDTA und 11,1 mM D-glucose). </li><li> Halten Sie die Lager - Puffer auf Eis und belüften den Puffer mit 95% O 2 und 5% CO 2. </li><li> Schalten Sie das Organbad System, stellen Sie die Temperatur bei 37 ° C, 5 ml der ready-to-use-Puffer zu jeder Kammerund halten Sie den Puffer mit 95% O 2 und 5% CO 2 Belüften. </li><li> Waschen Sie die Kammern einmal mit Krebs-Ringer-Puffer für 30 min. </li><li> 5 ml Krebs-Ringer-Puffer in jeder Kammer und die Abdeckung die Kammer Verdampfung zu vermeiden. </li></ol> 2. Isolierung von Maus-Aorten <ol><li> Injizieren Pentobarbital, die in 0,9% NaCl intraperitoneal in einer Konzentration von 150 mg / kg, gelöst wird, um die Mäuse zu opfern. </li><li> Legen Sie die Maus supinely auf einem OP-Brett. </li><li> Besprühen das Fell des Brustbereich mit 70% Ethanol für die Zwecke der Hygienisierung und Feuchtigkeit. </li><li> Offenen Brusthöhle um die Rippe durch Schneiden des Herzens und der Lunge, zu belichten und die Lungen zu entfernen. </li><li> Entfernen Sie die Blut in den Brustraum leicht mit einem Papiertuch. </li><li> Fassen Sie das Herz vorsichtig mit einer Zange und entfernen Sie die thorakalen Aorta durch die perivaskulären Fettgewebe zwischen der Aorta und der Wirbelsäule mit einer chirurgischen Schere schneiden. </li><li> Tauchen Sie sofort die whole Gewebe in eiskaltem (4 ° C) Krebs-Ringer-Puffer. </li><li> Entfernen Sie das Herz und Aortenbogen unter einem Präpariermikroskop und halten den thorakalen Aorta-Segment im Puffer. </li><li> Präparieren Sie die Aorta frei von anhaftenden perivaskulären Gewebe unter dem Mikroskop mit einer chirurgischen Schere und Pinzette. </li><li> Fassen Sie die Stirnkante der Aorta mit einer Zange, und spülen das Blut in das Gefäßlumen entfernt durch sanftes Spülen Krebs-Ringer-Puffer mit einem 26 G × 1 / 2&quot; Spritze. </li><li> Schneiden Sie die gereinigten Aorten-Ringe in 3 mm lange Segmente. Hinweis: Achten Sie bei diesem Schritt nicht Endothelschicht zu beschädigen. </li></ol> 3. DHE und DAF-2DA Anfärben <ol><li> Übertragen die gereinigten Aorten - Segmente mit einer Pinzette in das Organbad Kammern gefüllt mit Krebs-Ringer - Puffer bei 37 ° C belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2. Hinweis: Berühren Sie nur die adventitiellen Seite der Aorten-Ringe mit einer Pinzette und sie klemmen nicht blood Gefäße. </li><li> Äquilibrieren die Arterien im Organbad Kammer für 30 min. </li><li> Hinzufügen Acetylcholin (ACh) in das Organbad auf die Endkonzentration 1 uM, und inkubiere die Arterien für 10 min. </li><li> Bereiten Sie 1 ml DHE / DAF-2DA-Lösung (5 &amp; mgr; M jedes Farbstoffs, von 1000 × Lager verdünnt) mit vorgewärmten Krebs-Ringer-Puffer in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wickeln Sie das Reaktionsgefäß mit einer Aluminiumfolie gegen Licht zu vermeiden. </li><li> Nach der Stimulation übertragen die Aortenringen von Organbad zur DHE / DAF-2DA Lösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 37 ° C belüftet mit 95% O 2 und 5% CO 2 und der Aortenringen für 30 min inkubieren. Hinweis: Von diesem Schritt halten die Aorten immer in Dunkelheit. </li><li> Übertragen Sie die Aorten-Ringe auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit Krebs-Ringer-Puffer zum Waschen und wiederholen Sie die Wäsche dreimal innerhalb von 1 min. </li><li> Übertragen Sie die Aorten-Ringe auf 4% Paraformaldehydlösung zur Fixierung für 30Minute </li><li> Vorbereitung 1 ml 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Lösung (300 nM, von 1000 × Vorrat verdünnt) mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) -Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Gegenfärbung der Aorten 3 min. </li><li> Übertragen Sie die Aorten auf neue Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS-Puffer zum Waschen für 1 min. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal. Hinweis: Achten Sie darauf, nicht die Aorten-Ringe zu klemmen oder die endotheliale Schicht beschädigt werden. </li></ol> 4. En Face Montage <ol><li> Fügen Sie einen Tropfen Medium auf den Schlitten der Montage. </li><li> Schneiden Sie die Aorten - Ringe in Längsrichtung mit mikro Schere unter dem Mikroskop, machen die zusammengerollten Aorten flach und montieren es en face auf dem Eindeckmedium mit dem Endothel auf dem Glasträger nach unten zeigt . Sie nicht die Aorten hin und her bewegen. </li><li> Decken Sie die Folie mit Deckglas und versiegeln Sie die Folie mit Nagellack. </li><li> Nach dem Trocknen an der Luft unter Lichtschutz, verwenden Sie die Folien für dire Abbildenctly innerhalb von Stunden oder lagern Sie sie bei -20 ° C für den nächsten paar Tage. </li></ol> 5. Konfokalmikroskopische Imaging <ol><li> Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop die Fluoreszenzsignale zu erkennen. Schalten Sie die Maschine und optimieren die Abbildungseinstellungen wie Vergrößerung, Scangeschwindigkeit, Auflösung, Z-Stack. <ol><li> Für dieses Protokoll verwenden, um eine 200 Hz Scangeschwindigkeit, Auflösung von 1.024 × 1.024 Pixeln und Z-Schrittgröße von 0,25 um. Excite Fluoreszenz von DAF-2DA mit 488 nm Argonlaser und erfassen bei 515 nm, während erregen Fluoreszenz von DHE bei 514 nm und erfassen bei 605 nm Emission. </li></ol></li><li> Verwenden 10x Vergrößerungen auf die Probe zu konzentrieren, bis das DAPI-Signal mit ultravioletten Strahlen klar ist, und stellen Sie dann das Ziel zu 40X Vergrößerung. </li><li> Definieren Sie den Bereich der endothelialen Schicht durch Einstellen der Z-Position auf dem Bedienfeld. Die Signale von DAPI-gefärbten Kerne sind oval oder rund Punkten in der Endothelschicht. </li><li> Scannen von oben(Endothelschicht auf der Lumen Grenze) der Probe durch die gesamte Dicke der endothelialen Signal und Aufzeichnen von Bildern. Wählen mindestens 3 verschiedene Felder für jede Probe abtastet. </li></ol> 6. Analyse der Bilder <ol><li> Verwenden Sie Software, um die Daten zu öffnen, durch konfokale Mikroskop gescannt. Wählen Sie drei aufeinander folgende Bilder pro Feld für die Analyse und Bewertung von mindestens 3 verschiedenen Feldern pro Probe. Exportieren Sie die ausgewählten Bilder und speichern Sie sie als JPEG-Dateien. </li><li> Quantifizieren Sie die Bilder von DAF-2DA, DHE und DAPI Färbung mit Bildverarbeitungs-Software. Für das Bild von DAPI-Färbung, wählen Sie &quot;Plugins&quot; → &quot;Analysieren&quot; → &quot;Zellzähler&quot; die Anzahl der DAPI positiven Kern zu zählen. <ol><li> Für die Bilder von DAF-2DA und DHE-Färbung, wählen Sie &quot;Analysieren&quot; → &quot;Maßnahme&quot; die Intensität der Signale zu analysieren, und nehmen Sie die &quot;mittlere&quot; Wert als die relative Signalintensität. Vorhanden dann die Ergebnisse als Verhältnis von DAF-2DA zuDAPI positiven Kerne oder das Verhältnis von DHE zu DAPI. Für jede Probe nehmen Sie den Mittelwert von jedem Bild und Feld. </li></ol></li><li> Teilen Sie das Ergebnis jeder Probe durch den Mittelwert der Kontrollgruppe die Falte Änderung zu erhalten. Die statistische Analyse wurde mit ungepaarten Student t-Test oder ANOVA mit Dunnett oder Bonferroni post-Test durchgeführt. Geben Daten als Mittelwert ± SEM. Betrachten wir Unterschiede in der Mittelwerte als signifikant bei p &lt;0,05 14. </li></ol>

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D., Forstermann, U., Murad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+sensitive+bioassay+method+for+detection+of+EDRF+with+RFL-6+rat+lung+fibroblasts.">A simple and sensitive bioassay method for detection of EDRF with RFL-6 rat lung fibroblasts.</a> Am. J. Physiol. 261 (2), 598-603 (1991).</li><li>Guo, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+of+C-type+natriuretic+peptide+on+spontaneous+contraction+in+gastric+antral+circular+smooth+muscle+of+rat.">Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of rat.</a> Acta Pharmacol Sin. 24 (10), 1021-1026 (2003).</li><li>Palmer, R. M., Ashton, D. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+signalling:+the+molecular+interface+connecting+metabolic+stress,+aging+and+cardiovascular+diseases.">mTOR signalling: the molecular interface connecting metabolic stress, aging and cardiovascular diseases.</a> Obes Rev. 13 (Suppl 2), 58-68 (2012).</li><li>Yepuri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+crosstalk+between+arginase-II+and+S6K1+in+vascular+endothelial+inflammation+and+aging.">Positive crosstalk between arginase-II and S6K1 in vascular endothelial inflammation and aging.</a> Aging Cell. 11 (6), 1005-1016 (2012).</li><li>Matsuno, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nox1+is+involved+in+angiotensin+II-mediated+hypertension:+a+study+in+Nox1-deficient+mice.">Nox1 is involved in angiotensin II-mediated hypertension: a study in Nox1-deficient mice.</a> Circulation. 112 (17), 2677-2685 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Der Nachweis von NO oder O 2 .- mit Fluoreszenzfarbstoffen wurde in vielen Studien in kultivierten Endothelzellen und auch in Gewebe Kryoabschnitte 23 häufig verwendet. Hier erweiterten wir diese Methode , um intakte lebende Blutgefäße, dh en Gesichtserkennung von NO und O 2 .- Ebenen in der Endothelschicht mit DAF-2DA und DHE verbunden, die wirksam ist, relativ einfach und intuitiv. Im Vergleich mit dem Verfahren in vaskulären Kryoschnitte zei...

Die vaskulären Endothelzellen halten Gefäß funktionelle und strukturelle Integrität von vasoaktiven Faktoren 1 freigibt . Unter diesen Faktoren Endothelium derived Stickstoffmonoxid (NO) , hergestellt aus L-Arginin durch endotheliale NO-Synthase (eNOS) ist das wichtigste und am besten charakterisierte Faktor in kardiovaskulären Physiologie 2. NO verursacht Entspannung der glatten Muskulatur und hemmt die Zellproliferation hemmt die Thrombozytenaggregation und entzündliche Zelladhäsion und Infiltration in den subendothelialen Raum, also Gefäßerkrankung Entwicklung 3 zum Schutz vor. Unter vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen, einschließlich der alternden Gesellschaft, Hypertonie, Diabetes, Hyperlipidämie, usw., verringert dadurch die endotheliale Dysfunktion durch NO Bioverfügbarkeit und erhöhte O 2 .- Produktion vorhanden ist , und fördert die Pathogenese der Atherosklerose 2. Studien aus den letzten Jahren zeigen, dass Entkopplung von eNOS ist einwichtiger Mechanismus für die endotheliale Dysfunktion, in dem das eNOS - Enzym erzeugt O 2 .- anstelle von NO, unter den verschiedenen zuvor erwähnten Bedingungen 1,4. Daher Analyse der Endothelfunktion, insbesondere endotheliale NO - Produktion und 2 O .- Generation ist von zentraler Bedeutung für die experimentelle Forschung auf Herz - Kreislauf- Erkrankungen und Komplikationen. Es gibt zahlreiche methodische Ansätze, die NO-Produktion zu analysieren und zu messen in biologischen Proben entwickelt wurden. Aufgrund der extrem labile Art von NO zu NO , das leicht oxidiert wird 2 - und NO 3 - mit einer Halbwertszeit von 3 bis 6 sec, ist es schwierig , NO direkt zu messen. Daher Bestimmung der NO 2 - / NO 3 - in den Flüssigkeitsproben wurde als ein Index von NO aus Zellen oder Geweben freigesetzt 5 verwendet. Obwohl das Verfahren relativ einfach ist, ist das Verfahren jedoch easily durch hohe Hintergrund des stabilen NO betroffen 2 - / NO 3 - in der Lösung enthalten ist . Da NO löslichen Guanylatcyclase stimuliert zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) 6, die zellulären cGMP - Spiegels zu erzeugen , hat sich auch die NO - Freisetzung zu schätzen 7 bestimmt ist. Auch dies ist eine indirekte Schätzung und nicht spezifisch sein kann, da auch die Aktivierung cGMP - Spiegel durch von cyclase partikulären Guanylat verbessern könnten einige Endothel-abgeleitete Faktoren, wie C-Typ natriuretischen Peptid (CNP) 8. NO wird aus L-Arginin mit der Erzeugung von L-Citrullin als einem Nebenprodukt 9 Messung von L-Citrullin Produktion produziert daher auch als indirekte Verfahren verwendet wird , die NO - Produktion zu schätzen. Die Hauptnachteile dieses Verfahrens sind , dass es radioaktiv ist und es nicht bioaktiven NO Ebenen messen, da NO rasch freigesetzt durch O 2 .- inaktiviert werden könnten; Darüber hinaus kann L-Citrullin recycelt werden, um L-Arginin 10. Andere chemische Methoden wie Chemolumineszenznachweise 11, Elektronenspinresonanz - 12, oder elektro Porphyrin - NO - Sensor 13 werden von mehreren Forschern verwendet. Diese Methoden sind in der Regel nicht einfach in Betrieb, Erkennung Verfahren und erfordern spezielle Ausrüstung. Es ist auch zu erwähnen, dass viele Studien Organbad Experimente mit isolierten Blutgefäße mit oder ohne Endothelium anwenden Endothelfunktion zu bewerten und indirekt Endothelium derived NO vermittelten vaskulären Relaxationen messen. Dieses Verfahren ist jedoch, obwohl sie meist in der Nähe der physiologischen Situation ist, aber streng zu sagen, nicht messen keine Funktion, er bewertet, eher Endothel-vermittelte vasomotorischen Reaktionen im Allgemeinen, die Nettoeffekte der eNOS Funktion widerspiegeln, die Produktion von anderen Endothel-derived relaxing Faktoren und Endothel-abgeleiteten Auftraggeber Faktoren, die Produktion von O 2 .-, und auch die Reaktionen von glatten Muskelzellenzu diesen Faktoren. Eine spezifische Analyse der eNOS - Funktion oder die NO - Produktion ist in der Regel 3 erforderlich. Viele Forschungsgruppen einschließlich der unsrigen haben in den letzten Jahren die Fluoreszenzfarbstoff - Methode verwendet , um die intrazelluläre Produktion von NO 14-19 erkennen. Bei diesem Verfahren wurde die zellpermeabel Fluoreszenzindikator Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) verwendet , um freie NO und NOS - Funktion in lebenden Zellen und Geweben in vitro oder ex vivo zu messen. Das Prinzip ist, dass in den lebenden Zellen, DAF-2DA wird durch intrazelluläre Esterase zu nicht fluoreszierenden 4,5-Diaminofluorescein (DAF-2) deacetyliert die dann umgewandelt DAF-2 Triazol fluoreszierend (DAF-2T), indem Sie mit NO reagieren . Die Fluoreszenz von DAF-2T können unter einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenz konfokalen Mikroskop 14 beobachtet werden. Die intrazelluläre Fluoreszenzintensität spiegelt daher die intrazelluläre NO-Produktion in den Zellen oder das Endothel eines in intakten Blut vessel. In Kombination mit einem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff wie Dihydroethidium (DHE), kann man gleichzeitig intrazellulären NO und O 2 .- Erzeugung in den Zellen oder in Blutgefäßen 14 beurteilen. In ähnlicher Weise ist auch eine DHE zellpermeablen Verbindung , die durch 2 O oxidiert wird .- innerhalb der Zellen, und das Oxidationsprodukt dann interkaliert mit Nukleinsäuren durch Fluoreszenz - Mikroskop oder Fluoreszenz konfokalen Mikroskop eine leuchtend rote Farbe nachweisbar quantitativ zu emittieren. DHE ist ein sehr spezifischer Farbstoff zum Nachweis von O 2 .- aus biologischen Proben, wie sie im wesentlichen Superoxidradikalen erkennt, zurückgehalten wird und durch die Zellen, und sogar leichte Fixierung 20 tolerieren kann. Einer der Vorteile dieses Fluoreszenzfarbstoffes Verfahrens ist , dass es erkennt und visualisiert NO und / oder O 2 .- en face direkt auf der intakten Endothelschicht eines lebenden Blutgefßes. In diesem Papier,Wir beschreiben diese Methode Fluoreszenzfarbstoff NO und O 2 zu erkennen .- , die wir für en Gesichtserkennung von NO und O 2 angepasst .- in intakten Aorten von einer Adipositas - Maus - Modell von hohem Fettgehalt-Diät (HFD) Fütterung induziert. Wir zeigen , dass diese Methode erfolgreich konnte und zuverlässig messen NO und O 2 .- Ebenen und eNOS (dys) -Funktion in der Endothelschicht frisch isolierten intakten Maus Aorten in Fettleibigkeit zu bewerten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D 1168</td>
			<td>dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>251505</td>
			<td>dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D 1306</td>
			<td>dissolve with water to 300 &#181;mol/L as 1000X stock,stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Vector labor. (reactolab)</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P3636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Myograph System&#160;</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 610M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DM6000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>National Institute of Health(NIH)</td>
			<td>Image J&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors&#160;</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>SDC-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical scissors&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15000-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>JF-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G&#215;1/2&#698; syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip round diam15mm</td>
			<td>vwr</td>
			<td>631-1579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 1 mL</td>
			<td>vwr</td>
			<td>RFL-1200c&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tips 200 uL</td>
			<td>vwr&#160;</td>
			<td>613.0659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A-6625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face detection of nitric oxide and superoxide in endothelial layer of intact arteries

Endothelium-derived Stickstoffmonoxid (NO) aus endothelialen NO-Synthase (eNOS) ist einer der wichtigsten vasoprotektiven Moleküle in kardiovaskulären Physiologie. Dysfunktionalen eNOS wie Entkopplung von eNOS führt in NO Bioverfügbarkeit und Erhöhung Superoxidanion (O 2 .-) Produktion und fördert wiederum kardiovaskulären Erkrankungen zu verringern. Daher sind entsprechende Messung von NO und O 2 .- Ebenen in den Endothelzellen entscheidende für die Erforschung von Herz - Kreislauf- Erkrankungen und Komplikationen. Aufgrund der extrem labile Natur von NO und O 2 .-, ist es schwierig zu messen , NO und O 2 .- direkt in ein Blutgefäß. Es wurden zahlreiche Verfahren NO zu messen entwickelt und O 2 .- Produktion. Es ist jedoch entweder insensitive oder unspezifisch, oder technisch anspruchsvoll und erfordert eine spezielle Ausrüstung. Hier beschreiben wir eine Anpassungdes Fluoreszenzfarbstoffs Verfahren für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären NO und O 2 .- Die zellpermeabel Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) mit jeweils in intakten Aorten von einer Adipositas - Mausmodell induziert von hohem Fettgehalt-Diät Fütterung. Wir zeigen , könnten intrazellulären NO verringert und eine verbesserte O 2 .- Ebenen in den frisch isolierten intakten Aorten von Maus Fettleibigkeit zur Kontroll lean Maus verglichen. Wir zeigen , dass diese Methode ist eine einfache Technik für die direkte Erfassung und Visualisierung von NO und O 2 .- in den intakten Blutgefäßen und kann in weiten Bereichen für die Untersuchung der endothelialen (dys) Funktion unter (Physio) pathologischen Bedingungen angewendet werden.

Adipositas ist ein wichtiger Risikofaktor für ischämische koronare Herzkrankheit und ist assoziiert mit einer verminderten NO - Bioverfügbarkeit Endothelzellen, ein Markenzeichen von atherosklerotischen Gefäßerkrankung 21. eNOS-Entkopplung wurde gezeigt , einen wichtigen Mechanismus der endothelialen Dysfunktion bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Zuständen zu sein , einschließlich der Alterungs 22, Atherosklerose und Adipositas 14. ...

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En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

In diesem Artikel beschreiben wir eine angepasste relativ einfache Methode der Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid - Anion mit (O 2 .- ) jeweils in frisch intakten Aorten von einer Adipositas-Maus-Modell isoliert.

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

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Research

JoVE Journal

Biology

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

9.5K Aufrufe.  University of Fribourg.  In diesem Artikel beschreiben wir eine angepasste relativ einfache Methode der Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid - Anion mit (O 2 .- ) jeweils in frisch intakten Aorten von einer Adipositas-Maus-Modell isoliert. 

Serie: En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Forschung

Biologie

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

Die Montage und Anwendung der &quot;Shear Ringe &#39;: A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into nitrite and nitrate by interactions with various oxy-heme proteins and other still not well known pathways. The reverse process, reduction of nitrite and nitrate into NO had been discovered in mammals in the last decade and it is gaining attention as one of the possible pathways to either prevent or ease a whole range of cardiovascular, metabolic and muscular disorders that are thought to be associated with decreased levels of NO. It is therefore important to estimate the amount of NO and its metabolites in different body compartments &#8212; blood, body fluids and the various tissues. Blood, due to its easy accessibility, is the preferred compartment used for estimation of NO metabolites. Due to its short lifetime (few milliseconds) and low sub-nanomolar concentration, direct reliable measurements of blood NO in vivo present great technical difficulties. Thus NO availability is usually estimated based on the amount of its oxidation products, nitrite and nitrate. These two metabolites are always measured separately. There are several well established methods to determine their concentrations in biological fluids and tissues. Here we present a protocol for chemiluminescence method (CL), based on spectrophotometrical detection of NO after nitrite or nitrate reduction by tri-iodide or vanadium(III) chloride solutions, respectively. The sensitivity for nitrite and nitrate detection is in low nanomolar range, which sets CL as the most sensitive method currently available to determine changes in NO metabolic pathways. We explain in detail how to prepare samples from biological fluids and tissues in order to preserve original amounts of nitrite and nitrate present at the time of collection and how to determine their respective amounts in samples. Limitations of the CL technique are also explained.

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the three-dimensional tissue morphology is from such sections. In addition, the sections of tissues examined may not contain the region within the tissue that is necessary for the purpose of the ongoing study. This latter limitation hinders histopathological studies of blood vessels since vascular lesions develop in a focalized manner. This requires a method that enables us to survey a wide area of the blood vessel wall, from its surface to deeper regions. A whole mount en face preparation of blood vessels fulfills this requirement. In this article, we will demonstrate how to make en face preparations of the mouse aorta and carotid artery and to immunofluorescently stain them for confocal microscopy and other types of fluorescence-based imaging.

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

A procedure for making en face preparations of the mouse carotid artery and aorta is described. Such preparations, when immunofluorescently stained with specific antibodies, enable us to study localization of proteins and identification of cell types within the entire vascular wall by confocal microscopy.

En Face Vorbereitung der Maus Blutgefäße

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...