Die Autoren danken Patricia Baldacci, Vanessa lagal und Sabine Thiberge für das kritische Lesen, Irina Dobrescu und Sabine Thiberge um Hilfe in Bildern und Pauline Formaglio für den Unterricht in - vivo - Bildgebung von Sporozoiten - Motilität in der Mäusehaut nehmen. Wir möchten auch Marek Szatanik und das Zentrum für Produktion und Infektion von Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) für Mückenzucht zu danken. Diese Studie wurde von der AXA Research Fund und Mittel aus dem Laboratoire d&#39;Excellence &quot;Integrative Biologie der Emerging Infectious Diseases&quot; unterstützt (Förder-Nr. ANR-10-LABX-62-IBEID).

<html> und durchgeführt in Übereinstimmung mit den geltenden Richtlinien und Vorschriften:; Alle Verfahren wurden vom Ausschuss des Pasteur-Institut und von der lokalen Ethikkommission für Tierversuche (2012-0015 Vertragsnummer Ethikkommission IDF-Paris 1, Paris, Frankreich) genehmigt. 1. Materialien und Reagenzien <ol><li> Verwenden weiblichen Anopheles - Mücken stephensi (Sda500 Stamm) , die auf infizierten Mäusen ernähren 3-5 Tage nach dem Auflaufen und hinten wie zuvor 21 beschrieben. </li><li> Verwenden Parasiten Plasmodium berghei ANKA Klon mit dem Green Fluorescent Protein (GFP) Gen unter der Kontrolle des konstitutiven Heat Shock Protein 70 (HSP70) Promotors. Dies ergibt helle Fluoreszenz während des gesamten Lebenszyklus Parasit 22. </li><li> Verwenden weibliche C57BL / 6JRj Mäuse (7 Wochen alt). HINWEIS: Alle Reagenzien in dem beschriebenen Protokoll verwendet werden , in der T aufgeführt Lage von Materialien / Ausrüstung. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Radiation-attenuierten Sporozoiten-Isolation von Mosquito Speicheldrüsen <ol><li> Zwischen 18-25 Tage nach dem infektiösen Blutmehl, sammeln und kalt betäuben Stechmücken in einen 15 - ml - Röhrchen auf Eis , wie zuvor 21 beschrieben. übertragen Sie sie vorsichtig auf eine Petrischale durch das Rohr zu invertieren. Pflegen Sie die Insekten auf Eis und entlarven die Mücken zu einer 12 krad Dosis von γ- oder Röntgenbestrahlung. </li><li> Isolieren abgeschwächten Sporozoiten aus bestrahlten Moskitospeicheldrüsen , wie zuvor beschrieben 21. Sammeln infizierten Speicheldrüsen in einem kleinen Volumen (etwa 15 ul) 1x Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) auf Eis und sanft zerdrücken sie Sporozoiten freizusetzen. HINWEIS: Die Injektion einer stark konzentrierten Parasitensuspension in einem kleinen Volumen kritisch, es ist daher wesentlich, eine ausreichende Anzahl von Speicheldrüsen von einer hohen Anzahl von vorgewählten gut infizierten Mücken zu ernten, wie durch ihre robuste ExpressionGrün-Fluoreszenz. </li><li> Filtern Sie die Sporozoiten-Suspension durch eine 35 &amp; mgr; m Zellsieb Kappe angepasst auf eine niedrige Adhäsion 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen zu beseitigen, um Klumpen und Moskito Schutt. </li><li> Zählen Sie die Gesamtzahl der isolierten Sporozoiten wie zuvor 21 beschrieben und stellen Sie die Konzentration der Parasiten Suspension mit kaltem 1x DPBS 83.000 Sporozoiten / ul zu erhalten. Lagern Sie die Parasiten auf Eis, während die nächsten Schritte fort. </li><li> Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von Speicheldrüsen von nicht infizierten Moskitos, die als Negativkontrolle verwendet werden und verarbeiten, um die Probe wie in den Schritten 2.2 und 2.3. Verdünne die Probe wie oben angegeben ähnliche Konzentration der Speicheldrüsenextrakten in der Suspension zu erhalten. HINWEIS: Sporozoiten können für maximal 2 Stunden auf Eis gelagert werden. Allerdings, im Idealfall sind sie innerhalb einer Stunde eingespritzt, nachdem die Speicheldrüsen zerdrücken. </li></ol> 3. Die Injektion von Sporozoiten in die Dermal Layer des Ohres <ol><li> Anästhesieren Tiere durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (50 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg) -Mischung. Warten 5-8 min für die Maus in einen Zustand der Bewusstlosigkeit sein und gelten Augensalbe für die Augen kornealen Austrocknen zu verhindern. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch eine sanfte Zehe Prise an beiden hinteren Füße durchführen. HINWEIS: Die Dosis der Anästhesie dauert weniger als 20 Minuten, so dass die nächsten Schritte müssen schnell ausgeführt werden. </li><li> Stabilisieren Sie die Ohrmuschel der Maus durch die Bauchseite mit durchsichtigem Klebeband Befestigung zuvor unter einem Stereomikroskop (1A) angeordnet. Drücken Sie vorsichtig die Ohrschädigung des Gefäßsystems zu vermeiden. </li><li> Legen Sie eine 10 ul Spritze / 35 Gauge abgeschrägte Nadel mit 0,6 ul resuspendiert Parasiten 10. </li><li> Liefern den Sporozoiten - Suspension in 4 Injektionsstellen (0,15 &amp; mgr; l pro Stelle) durch vorsichtiges die Nadel auf der Rückenseite des Ohres (1A) Einsetzen unter der Epidermis, mitdie Schräge nach oben, Pflege keine Blutgefäße zu vermeiden,. Erlauben die Nadel in der Dermis zu verbleiben einige sec Rückfluss des Injektats zu verhindern, bevor es entfernt wird. Beobachten einer Charakteristik papule an jeder Injektionsstelle am Ende des Verfahrens (1B und 1C). </li><li> Nach der Injektion entfernen Sie vorsichtig das Ohr vom Band. </li><li> Spritzen Sie das kontralaterale Ohr mit der gleichen Dosis von Parasiten durch die Schritte 3,2-3,4 folgen. </li><li> Injizieren Sie 2 zusätzliche Mäuse entweder mit 0,6 ul 1x DPBS oder 0,6 ul 1x DPBS + Speicheldrüsenextrakt von nicht infizierten Mücken, um die Entzündungsreaktion zu bewerten allein durch die Injektion vermittelt und die Ablagerung von Moskitomaterial in der Dermis. </li><li> Überwachen Sie die Maus aus der Narkose, bevor es wieder in den Käfig legen. HINWEIS: Die richtige Sporozoiten - Ablagerung in der Haut kann durch Fluoreszenzmikroskopie (2A und 2B überwacht werden), Wobei die Maus previsously 23 beschrieben , hergestellt. </li></ol> 4. Haut und ableitenden Lymphknoten Dissektion <ol><li> Bereiten Standardmedium (SM), wie folgt: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), ergänzt mit 400 U / ml Kollagenase und 50 ug / ml Deoxyribonuclease (DNase) . </li><li> Bereiten Sie zwei 6-Loch-Flachboden-Gewebekulturplatten auf Eis mit 4,5 ml SM + 70 &amp; mgr; m Zellsieb pro Vertiefung für dLN Proben (Tafel A) und 4,5 ml SM pro Vertiefung für Hautproben (Tafel B). </li><li> Zum gewünschten Zeitpunkt folgende Sporozoiten Inokulation betäuben tief mit der Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin (125 mg / kg) / Xylazin (12,5 mg / kg) Mischung vor Zervikaldislokation. Stellen Sie sicher, dass die Maus Zeichen der klinischen Tod demonstriert und die Präparation sofort beginnen. HINWEIS: Die Kinetik der myeloiden Zellrekrutierung können zu verschiedenen Zeiten nach inj sucht werdenection (dh 2 Stunden, 4 Stunden und 24 Stunden , wie zuvor 14 beschrieben). </li><li> Desinfizieren des beimpften Ohr und den entsprechenden Halsbereich mit 70% Ethanol, um die Möglichkeit einer Kontamination zu reduzieren. </li><li> Mit einer sterilen Schere und Pinzette, sezieren aseptisch das proximale Ohrmuschel dLN ohne das umgebende Fett zu sammeln. Führen Sie einen ersten Einschnitt in der jugulo-carotidian Sulcus und entfernen Sie die Haare aus dem Operationsfeld. Dehnen Sie den Schnitt mit 2 Zange die dLN auszusetzen, die im Vergleich zu dem umgebenden Gewebe gräulich erscheint. </li><li> Pinch das Bindegewebe vorsichtig auf der Oberseite des dLN mit einer Pinzette ihre Entfernung zu erleichtern. Extrahieren Sie die dLN durch eine Zange unterhalb des lymphatischen Gewebes platzieren (3A und 3B). Legen Sie die dLN in einer Vertiefung mit 4,5 ml SM + 70 &amp; mgr; m Zellsieb (Tafel A). </li><li> Ernten Sie die gesamte beimpft Ohr mit einer sterilen scharfen Schere und Pinzette (4A). separaßen die dorsalen und ventralen Aspekte des Ohres durch Kneifen und Beabstanden den Schnitt mit zwei Zangenenden (4B - 4E). Legen Sie sie in einen Brunnen, die 4,5 ml SM (Tafel B) dafür, dass beide Gewebe vollständig in das Medium eingetaucht. HINWEIS: Um die Zuverlässigkeit des Experiments zu verbessern und die Anzahl der Zellen von Interesse zu erhöhen, Pool 2 injiziert Ohren oder 2 DLNs aus der gleichen Maus pro Probe. </li><li> Ernte und Prozess parallel die Ohren und DLNs der Mäuse geimpft mit entweder 1x DPBS oder Speicheldrüsenextrakten. Fügen Sie zwei zusätzliche Ohr und Lymphknoten von einer naiven Maus geerntet Proben für negative und Einzelfärbung Kompensationssteuerungen. </li></ol> 5. Zellisolierung aus Lymphknoten <ol><li> Inkubieren der Lymphknoten (Tafel A) bei 37 ° C + 5% CO 2 für 15 min unter leichtem Schütteln. Zugabe von 10 mM final Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) pro Vertiefung zu neutralisieren Kollagenase und DNase activitäten. Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis. </li><li> Dissoziieren Lymphknoten das obere Ende eines 5 ml Spritzenkolben verwendet. Drücken Sie in kreisenden Bewegungen gegen das Sieb, bis alles, was weiß ist Bindegewebe bleibt. </li><li> Spülen Sie das Zellsieb zweimal mit 500 &amp; mgr; l 1x DPBS + 2% fötales Rinderserum (FBS) + 2 mM EDTA. Übertragen gesamte Volumen der gut in einem 15-ml-Tube. </li><li> Spülen Sie die gut zweimal mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und übertragen das Volumen in den 15-ml-Tube. Halten Sie Röhrchen auf Eis. </li></ol> 6. Zellisolierung aus Haut des Ohres <ol><li> Inkubieren der Ohr Blättchen (Tafel B) bei 37 ° C + 5% CO 2 für 1 Stunde unter leichtem Schütteln. HINWEIS: Nach 20 Minuten Inkubation, schneiden Sie die Ohr Faltblätter mit einer Schere in kleine Stücke Gewebe Verdauung und legte die Probe zurück in den Inkubator für die restlichen 40 min zu erleichtern. Einzelne Zellen können in dem Medium am Ende der Inkubationszeit beobachtet werden. </li><li> In 10 mM final<html> EDTA pro Vertiefung Kollagenase und DNase Aktivitäten zu neutralisieren. Führen Sie die nächsten Schritte auf dem Eis. </li><li> Übertragen Sie die Ohrgewebefragmente und das gesamte Volumen des Mediums in ein neues und ein 70 &amp; mgr; m Zelle Sieb mit einer 1 ml Pipette enthält. Schneiden Sie 2 bis 3 mm vom Ende der Spitze der Ohrgewebefragmente leichter zu sammeln. </li><li> Ohrgewebefragmente mit dem oberen Ende eines 5 ml Spritzenkolben dissoziieren. Drücken Sie in kreisenden Bewegungen gegen das Sieb, bis alles, was weiß ist Bindegewebe bleibt. </li><li> Spülen Sie die Zelle strainers zweimal mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Übertragen, das gesamte Volumen der Vertiefung in eine 50 ml-Röhre durch einen 70 &amp; mgr; m Zellsieb. </li><li> Spülen Sie die gut mit 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und übertragen das Volumen in den 50-ml-Tube. Halten Sie das Röhrchen auf Eis. HINWEIS: Die verschiedenen Schritte gesamten Zellen aus der Haut und dLN Geweben in Figur 5 zusammengefaßt sind , zu isolieren. </li></ol>title &quot;&gt; 7. Graf und Viability von gesammelten Zellen <ol><li> Zentrifugieren Sie die Haut und dLN Proben für 5 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. resuspendieren vorsichtig das Pellet mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Sammeln ein kleines Volumen jeder Probe die Gesamtanzahl von Zellen aus der Haut und dLN unter Verwendung eines Hämozytometers getrennt zu zählen. In 0,04% Trypanblau die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. </li></ol> 8. Die Blockierung der Non Antigen-spezifische Bindung <ol><li> Werden 10 &amp; mgr; g / ml unmarkiertes CD16 / CD32 Fc-block-Antikörper. Inkubiere 20 Minuten bei 4 ° C (kann länger gehen). </li><li> 2 ml kaltem DPBS 1x + 2% FBS + 2 mM EDTA. Zentrifugieren Sie die Probe für 5 Minuten bei 450 × g bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. resuspendieren vorsichtig das Pellet mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA und halten Sie die Proben auf Eis. </li></ol> 9. Die Färbung der Haut und des Lymph Node myeloischen Zellen <ol><li> Inkubieren zuvor blockierten Skin und dLN isolierten Zellen mit Live / Dead tracker (dh 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol oder DAPI), anti-CD45 und anti-CD11b spezifischen Antikörper. Hinweise: Damit können die myeloischer Zell - Subpopulationen von Interesse, vor allem seltene, CD45 + Zellen und Lymphozyten bzw. von der Haut oder von der dLN von magnetischen Kügelchen erleichternde Zellsortierung verarmt gereinigt werden , um zu bereichern. Da die meisten der von der dLN isolierten Zellen sind CD45 +, die Verwendung von anti-CD45 ist nicht zwingend. Andere Marker können myeloischer Zell-Subpopulationen von Interesse zu identifizieren durch positive oder negative Anschnitts Strategie einbezogen werden. In diesem Protokoll werden die myeloische in der dLN rekrutierten Zellen durch den Ausschluss CD8a + Zellen angereichert wurden (die gesamte T - Zell - Fach unter Verwendung von Anti-CD3 - spezifischen Antikörper gezielt werden kann). </li><li> Inkubiere 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. In 500 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA, Zentrifuge die Probe 5 min bei 450 × g bei 4 ° C und entsorgen Sie die Supernatant. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. </li><li> Resuspendieren der Proben mit 300 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. Übertragen Sie das gesamte Volumen in einem FACS-Röhrchen durch ein 35 &amp; mgr; m Zelle Sieb. Spülen Sie den Filter mit 100 ul 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li> Führen Sie die gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer. Tor leben Einzelzellen (DAPI -, FSC-W) abgestorbenen Zellen und Dubletten auszuschließen. Plot CD45 + CD11b + Ereignisse für die Haut (6A) und (CD45 +) CD8a - CD11b + Veranstaltungen für die dLN (6B). </li></ol>

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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine.">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li><li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection.">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

In der Perspektive von großen Impfung von Menschen eine ganze Sporozoiten - Impfstoff gegen Malaria verwendet, einer der wichtigsten Herausforderungen zu überwinden , ist es , optimierte Routen und Methoden der Parasit Verabreichung entwickeln erfolgreiche Immunisierung und Schutz 24,25 zu gewährleisten. Beim Menschen hat die Bewertung der Schutzwirkung vermittelt durch lebende , abgeschwächte Parasiten (LAP) nach Natur Mücke durchgeführt worden beißt 2 sowie intradermale, subkutane 25,...

Malaria ist eine der tödlichsten Infektionskrankheiten der Welt, mehr als eine halbe Million Menschen pro Jahr töten. Infektionen durch Plasmodium, dem Erreger der Krankheit beginnt mit einem vorge erythrozytären (PE) -Phase. Während dieser Phase in die Wirts Haut von einer Mücke weiblichen Anopheles injiziert Sporozoiten erreichen die Leber über die Blutbahn und im Inneren Hepatozyten in die Parasitenformen unterscheiden , die roten Blutkörperchen infizieren und bewirken , dass die Symptome der Krankheit. Die PE - Stadien von Plasmodium stellen eine privilegierte Ziel für Anti-Malaria - Impfung. Tatsächlich abgeschwächten Lebendimpfstoffe gegen diesen Phasen, wie Strahlung abgeschwächt Sporozoiten (RAS), genetisch verhaftet Parasiten (GAP) oder Chemoprophylaxe und Sporozoiten (CPS) haben ihre Fähigkeit unter Beweis gestellt 1-9 sowohl Nagetier und menschlichen Wirten zu schützen. Im Nagetiermodell sind die meisten Impfung Studien intravenöse Immunisierung unter Verwendung von, Das ist der Goldstandard in Bezug auf die Schutzwirkung. Allerdings hat die Beschreibung einer Haut Stufe und die Bedeutung der Haut-assoziierten Lymphknoten (dLN) bei der Auslösung Schutz unserer Wahrnehmung der PE-Phase geändert und betonte die Bedeutung der intradermale Route der Injektion. Intravital Bildgebung von P. berghei - Sporozoiten in die Haut von Nagetieren injiziert hat gezeigt , dass nur ~ 25% des Inokulums über die Blutbahn in die Leber gelangt. Die verbleibende ~ 75% verteilt sich zwischen dem proximalen dLN (~ 15%) und der Haut (~ 50%) 10,11, wo ein kleiner Anteil verwandeln und am Leben bleiben über Wochen Innenhautzellen 12,13. Außerdem beschrieben nachfolgende Studien , dass die Schaffung von wirksamen Schutzimmunität nach intradermale Immunisierung vor allem in der Haut-dLN nimmt, wo Parasiten spezifischen CD8 + T - Zellen aktiviert werden, und nur geringfügig in der Milz oder Leber-DLNs 14,15. Währenddie meisten Studien haben sich auf die Charakterisierung der Effektor-Zellen in der Einrichtung protektive Immunantwort beteiligt konzentriert, noch viel weniger wird über das Schicksal von lebenden attenuierten Parasiten in die Haut injiziert bekannt, insbesondere ihre Wechselwirkungen mit dem angeborenen Immunsystem. Insbesondere Charakterisierung von Antigen-präsentierenden in Parasit - Antigen - Aufnahme, Verarbeitung und Präsentation für CD8 + T - Zellen beteiligten Zellen ist von entscheidender Bedeutung, zu wissen , dass Akquisitions PE Antigen sowohl in der Haut und dLN Kompartimente auftreten können. Zurück intravital Bildgebungsstudien beschrieben einen frühen Zustrom von hell fluoreszierende Lys-GFP - positiven Zellen in der Haut nach einem infektiösen Mückenstich 16 , während frühe Interaktionen zwischen Sporozoiten und dendritischen Zellen wurden in der dLN 10,17 beobachtet. In jüngerer Zeit hat es sich durch Mücken in der Haut inokuliert Sporozoiten erhöht die Beweglichkeit der beiden dendritischen und regulatorische T-Zellen in der Haut berichtet, dassMäuse, während eine Abnahme Anzahl von Antigen - präsentierenden Zellen in der dLN 18 beobachtet. Wir sollen , zu identifizieren und genauer die Leukozytenuntergruppen rekrutiert in der Haut und entsprechenden dLN sowie diejenigen mit dem Parasiten zu quantifizieren 19 folgende intradermale Injektion von immunisierenden Dosen von RAS zu interagieren. In diesem Zusammenhang isolierten wir myeloiden Zellen (CD45 + CD11b +) von beiden Geweben und gekennzeichnet Subpopulationen von Interesse durch Mehr = parametrischer Durchflusszytometrie. In Übereinstimmung mit der Immunantwort in der frühen Phase der Haupt Leishmania beschrieben Infektion der Haut 20, die primäre Wirtsantwort Injektion Sporozoiten besteht aus einer aufeinanderfolgenden Einstellung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) , gefolgt von inflammatorischen Monozyten (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) , die auf der Basis von differenti identifiziertal Expression der Ly6G und Ly6C Oberflächenmarker. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die myeloischen Zellen aus der Haut von Mäusen zu isolieren und dLN folgende intradermale Injektion von infizierten Mücke Speicheldrüsen extrahiert Dosen von RAS immunisieren. Reproduzierbare intradermale Injektionen und Gewebeverarbeitung sind wichtige Schritte phänotypischen Veränderungen infiltrieren Zellpopulation innerhalb infizierten Geweben zu quantifizieren. Der Ansatz detailliert unten stellt einen zuverlässigen Assay die Haut und dLN entzündliche Reaktion auf Plasmodium Parasiten zu bewerten und kann auf verschiedene experimentelle Systeme erweitert werden.

<table><tbody><tr><td>Ketamine: Imalgene&amp;reg; 1,000</td><td>Merial</td><td>-</td><td>50 mg/kg: prior sporozoite injection

125 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>Xylazine: Rompun&amp;reg; 2%</td><td>Bayer</td><td>-</td><td>5 mg/kg: prior sporozoite injection

12.5 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>NanoFil syringe + 35 gauge needle</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Omnican&amp;reg; 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U.</td><td>B. Braun Medical&amp;nbsp;</td><td>9151125</td><td>-</td></tr><tr><td>MultiwellTM 6 well tissue culture plate &amp;ndash; Flat Bottom</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>353046</td><td>-</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td>-</td></tr><tr><td>2 ml syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-02S</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352098</td><td>-</td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 &amp;micro;m Cell-Strainer Cap</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td>-</td></tr><tr><td>DPBS 1x CaCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt; and MgCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt;-free</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>-</td></tr><tr><td>DMEM 1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>-</td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM or 2.5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td>-</td></tr><tr><td>HEPES buffer solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Trypan blue Stain (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Dilution 1:10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 &amp;micro;g/ml final (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPure&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; grade</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 &amp;micro;g/ml final</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (30-F11 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (M1/70 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8&amp;alpha; (5H10 clone)</td><td>Life Technologies</td><td>MCD0830</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)&amp;nbsp;</td><td>Janvier Laboratories</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

myeloid cell isolation from mouse skin and draining lymph node following intradermal immunization with live attenuated plasmodium sporozoites

Malaria - Infektion beginnt , wenn die Sporozoiten - Stadium von Plasmodium in die Haut eines Säugerwirt durch einen Mückenstich beimpft. Der hoch motile Parasit nicht erreicht nur die Leber Hepatozyten einzudringen und in Erythrozyten-infektiöse Form verwandeln. Es wandert auch in die Haut und zum proximalen Lymphknoten die Injektionsstelle Entwässern, wo sie von resident und / oder rekrutiert myeloischen Zellen erkannt und abgebaut werden können. Intravital Imaging berichtet die frühe Rekrutierung von hell fluoreszierende Lys-GFP positiven Leukozyten in der Haut und den Wechselwirkungen zwischen Sporozoiten und CD11c + Zellen im Lymphknoten. Wir präsentieren hier ein effizientes Verfahren zu erholen, zu identifizieren und die myeloischen Zelluntergruppen aufzuzählen, die auf die Haut von Mäusen angeworben werden und ableitenden Lymphknoten folgende intradermale Injektion von Dosen von Sporozoiten in einem Mausmodell immunisieren. Phänotypischen Charakterisierung mittels Multi-parametrischer Durchflusszytometrie bietetein zuverlässiger Assay frühen dynamischen zellulären Veränderungen bei entzündlichen Reaktion auf Plasmodium - Infektion zu bewerten.

Wir haben kürzlich gezeigt , dass die Nadel-Spritze Injektion von immunisierenden Dosen von P. berghei Sporozoiten in die Haut von Mäusen eine sukzessive Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten , gefolgt von inflammatorischen Monozyten in der Haut und dLN 19 induziert. Das Protokoll Abschnitt oben beschriebenen Verfahrensdetails verwendet , um erfolgreich Live - myeloischen Zellen aus beiden Geweben nach mehrfachen Injektionen von großen Anzahl von Sporozoiten i...

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Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

17.1K Aufrufe.  Institut Pasteur. We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Serie: Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bazillus Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting cells. When the skin encounters invading pathogens, different cutaneous DCs initiate a distinct T cell immune response to protect the body. Among the invading pathogens, fungal infection specifically drives a protective interleukin-17-producing Th17 immune response. A protocol was developed to efficiently differentiate Th17 cells by intradermal Candida albicans infection to investigate a subset of cutaneous DCs responsible for inducing Th17 immunity. Flow cytometry and gene expression analyses revealed a prominent induction of Th17 immune response in skin-draining lymph nodes and infected skin. Using diphtheria toxin-induced DC subset-depleting mouse strains, CD301b+ dermal DCs were found to be responsible for mounting optimal Th17 differentiation in this model. Thus, this protocol provides a valuable method to study in vivo function of differential subsets of cutaneous DCs to determine Th17 immunity against deep skin fungal infection.

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

Here, we demonstrate the in vivo function of cutaneous dendritic cell subsets in Th17 immunity of deep dermal Candida albicans infection.

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting ...

Isolierung von Endothelzellen aus dermalen Lymphkapillaren der Maus

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Autor im Rampenlicht: Magnetische Bead-basierte Isolierung von murinen dermalen lymphatischen Endothelzellen

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Ein CFSE-basierten Assay die Migration von murinen Haut Dendritischen Zellen in Lymphknoten während der Infektion zu studieren mit

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus