המחברים מודים פטרישיה Baldacci, ונסה Lagal ו סבין Thiberge לקריאה ביקורתית, אירינה Dobrescu ו סבין Thiberge לעזרה מצלם ופאולין Formaglio להוראה בתחום ההדמיה vivo של תנועתיות sporozoite בעור העכבר. כמו כן, אנו רוצים להודות מארק Szatanik ומרכז ייצור הזיהום של אנופלס (פסטר CEPIA-Institut) לגידול יתושים. מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר AXA וקרנות מן Laboratoire ד אקסלנס &quot;לביולוגיה אינטגרטיבית של מתעוררים מחלות זיהומיות&quot; (מענק לא. ANR-10-LABX-62-IBEID).

<html> כל ההליכים אושרו על ידי ועדה של מכון פסטר על ידי ועדת האתיקה המקומית על ניסויים בבעלי חיים (ועדה אתית צה&quot;ל-פריז 1, פריז, צרפת; מספר הסכם: 2012-0015) וביצע בהתאם להנחיות והתקנות החלים. 1. חומרים ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אנופלס נקבה יתושים stephensi (זן Sda500) הניזונים עכברים נגועים 3-5 ימים לאחר הופעתה ומאחור כפי שתואר לעיל 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש טפילים Plasmodium berghei אנקה שיבוט המבטאים את חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הגן תחת שליטה של חלבון הלם חום המכונן 70 (HSP70) האמרגן. זה מניב קרינה בהירה לאורך כל מחזור החיים הטפילים 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נקבה C57BL / עכברים 6JRj (7 שבועות בן). הערה: כל החומרים הכימיים המשמשים הפרוטוקול המתואר מפורטים T המסוגל של חומרים / ציוד. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. בידוד Sporozoite קרינה מוחלשים מבלוטות הרוק נגד יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 18-25 ימים לאחר ארוחת דם זיהומיות, לאסוף וקור-להרדים יתושים לתוך צינור 15 מיליליטר על קרח כפי שתואר קודם לכן 21. בזהירות להעביר אותם על צלחת פטרי על ידי צינור היפוך. לשמור על חרקים על הקרח ולחשוף את היתושים מנה 12 krad של הקרנה x γ- או. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד sporozoites מוחלש מבלוטות רוק יתוש מוקרנות כפי שתואר לעיל 21. אסוף בלוטות רוק נגועות בנפח קטן (סביב 15 μl) של בופר פוספט של 1x Dulbecco (DPBS) על קרח בעדינות למחוץ אותם לשחרר sporozoites. הערה: ההזרקה של השעיה טפילה מרוכזת מאוד בנפח קטן להיות קריטי, לכן זה חיוני כדי לקצור מספר מספיק של בלוטות רוק ממספר רב של יתושים שנבחרו מראש גם נגועים, כפי שמעידים הביטוי החזק שלהםקרינה ירוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה sporozoite באמצעות כובע מסננת תא 35 מיקרומטר המותאמים צינור הידבקות 1.5 נמוך מ&quot;ל microcentrifuge כדי לחסל גושים ופסולת יתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את המספר הכולל של sporozoites מבודד כפי שתואר לעיל 21 ולהתאים את הריכוז של השעיה טפיל עם DPBS 1x קר להשיג 83,000 sporozoites / μl. אחסן את הטפילים על קרח תוך המשך בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את המספר השווה של בלוטות רוק מפני יתושים נגועים כי תשמשנה שליטה שלילית ולעבד המדגם כמתואר בשלבי 2.2 ו -2.3. לדלל את המדגם כמצוין לעיל כדי להשיג ריכוז דומה של תמציות בלוטת רוק ההשעיה. הערה: ניתן לאחסן Sporozoites על הקרח לכל היותר 2 שעות. עם זאת, באופן אידיאלי הם מוזרקים תוך שעה לאחר ריסוק בלוטות הרוק. </li></ol> 3. הזרקה של Sporozoites לתוך La Dermalyer של האוזן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידי הזרקת intraperitoneal של קטמין (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג) / xylazine (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) תערובת. חכה 5-8 דקות עבור בעכבר כדי להיות במצב של חוסר הכרה וליישם משחת עיניים אל העיניים כדי למנוע התייבשות קרנית. להעריך את עומק ההרדמה על ידי ביצוע קמצוץ בוהן עדין על רגליים אחוריות הוא. הערה: המינון של הרדמה נמשך פחות מ -20 דקות, כך על פי השלבים הבאים חייבים להיעשות במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצבו את אפרכסת האוזן האוזן של העכבר על ידי תיקון בצד הגחון עם קלטת ברורה להציב בעבר תחת (איור 1 א) סטראו. לחץ בעדינות את האוזן כדי למנוע נזק של כלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מחט ומהוקצע 10 מזרק μl / 35 מד עם 0.6 μl של טפילים resuspended 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספק את ההשעיה sporozoite ב 4 המוזרקים (0.15 μl לכל אתר) על ידי החדרת מחט על הגב בצד של האוזן (איור 1 א), מתחת לאפידרמיס בקפידה, עםאת ההטיה, מקפיד להימנע מכל כלי דם. אפשר מחט להישאר בדרמיס עבור כמה שניות כדי למנוע זרימה חוזרת של injectant לפני הסרתו. שימו קשריר מאפיין בכל הזריקה בסוף ההליך (איור 1B ו 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, להסיר את האוזן בזהירות מהקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את האוזן הנגדית באותו המינון של טפילים על ידי ביצוע שלבי 3.2-3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 2 עכברים נוספים עם או 0.6 μl של 1x DPBS או 0.6 μl של תמצית בלוטת הרוק 1x DPBS + מפני יתושים נגוע על מנת להעריך את התגובה הדלקתית מתווכת על ידי הזרקת לבד ואת בתצהיר של חומר נגד יתושים בדרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התאוששות עכבר מן ההרדמה לפני ההצבה אותו בחזרה לתוך הכלוב. הערה: בתצהיר sporozoite הנאה בעור ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א ו -2), מכין את העכבר כמתואר previsously 23. </li></ol> עור 4. וניקוז הלימפה צומת Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני סטנדרטי (SM) כדלקמן: בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) + 25 מ&quot;מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) בתוספת 400 U / collagenase מ&quot;ל ו -50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​deoxyribonuclease (DNase) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו שתי צלחות תרבית הרקמה 6 גם שטוח התחתונה על קרח עם 4.5 מ&quot;ל SM + 70 מיקרומטר תא מסננת לכל טוב עבור דגימות DLN (צלחת) ו -4.5 מ&quot;ל SM לכל טוב עבור דגימות עור (פלייט B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת הזמן הרצוי הבאה חיסון sporozoite, עמוק להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (125 מ&quot;ג / ק&quot;ג) / xylazine (12.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) נקע בצוואר הרחם לפני התערובת. ודא העכבר מדגים סימני מוות קליני ולהתחיל לנתיחה מיד. הערה: קינטיקה של גיוס תא מיאלואידית יכול להיבחן במועדים שונים לאחר injשיקוף (כלומר 2 hr, 4 hr ו -24 שעות כפי שתוארו לעיל 14). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את האוזן המחוסנת ובאזור הצוואר המקביל עם אתנול 70% כדי לצמצם את האפשרות של זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים מלקחיים סטרילית, בסביבה נקייה מחיידקים לנתח את DLN אזני הפרוקסימלי ללא איסוף השומן שמסביב. לבצע חתך ראשון מענית jugulo-carotidian ולהסיר את השערות משדה ההפעלה. למתוח את החתך עם 2 מלקחיים כדי לחשוף את DLN שמופיעה אפרפר לעומת הרקמה הסובבת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את רקמות החיבור בקפידה על החלק העליון של DLN עם מלקחיים כדי להקל הסרתו. חלץ את DLN ידי הצבת מלקחיים מתחת רקמת הלימפה (איור 3 א ו 3 ב). מניחים את DLN בתוך (צלחת) מסננת תא היטב המכיל 4.5 מ&quot;ל SM + 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את האוזן המחוסנת כולו באמצעות מספריים חדים סטרילית מלקחיים (איור 4 א). separאכל את ההיבטים הגב ועל הגחון של האוזן ידי צובט וריווח מלבד הקיצוץ מסתיים עם שני מלקחיים (איור 4 ב - 4E). מניח אותם (B פלייט) 4.5 היטב המכיל מיליליטר SM מוודא הרקמות הם שקועות לחלוטין בטווח הבינוני. הערה: על מנת לשפר את מהימנות הניסוי ולהגדיל את מספר התאים של עניין, ברכה 2 מוזרק אוזניים או 2 dLNs מאותו העכבר לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ולעבד במקביל האוזניים dLNs של עכברים מחוסנים עם או 1x DPBS או תמציות של בלוטות רוק. כלול 2 דגימות אוזן והלימפה נוספות צומת קוצרות עכבר נאיבי עבור פקדי פיצוי מכתים שליליים יחיד. </li></ol> בידוד תא 5. מן בלוטות הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת בלוטות הלימפה (צלחת) ב 37 ° C + 5% CO 2 במשך 15 דקות תחת תסיסה עדינה. הוסף 10 מ&quot;מ הסופי חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) לכל טוב לנטרל collagenase ואת acti DNasevities. בצע את הצעדים הבאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק בלוטות הלימפה באמצעות הקצה העליון של הבוכנה מזרק 5 מ&quot;ל. לחצו בתנועות מעגליות נגד מסננת עד שכל שנותר הוא רקמות החיבור לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מסננת תא פעמיים עם 500 μl 1x DPBS + 2% עוברית בסרום שור (FBS) + 2 מ&quot;מ EDTA. העבר כל נפח של הבאר בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את פעמיים היטב עם 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 מ&quot;מ EDTA ולהעביר את נפח לתוך הצינור 15 מ&quot;ל. שמור צינורות על הקרח. </li></ol> בידוד תא 6. מעור של האוזן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת עלוני האוזן (פלייט B) ב 37 ° C + 5% CO 2 עבור שעה 1 תחת תסיסה עדינה. הערה: לאחר 20 דקות של דגירה, לחתוך את כרוזי אוזן עם מספריים לחתיכות קטנות כדי להקל על עיכול רקמות ולשים את הדוגמת לראש בחממה במשך 40 הדקות הנותרות. תאים בודדים ניתן לצפות בטווח הבינוני בסוף זמן הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;מ סופי<html> EDTA לכל טוב לנטרל פעילויות collagenase ו DNase. בצע את הצעדים הבאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את שברי רקמות אוזן ואת כל הנפח של מדיום חדש המכיל גם מסנן תא 70 מיקרומטר באמצעות פיפטה 1ml. חותכים 2 עד 3 מ&quot;מ מהקצה של קצה כדי לאסוף את שברי רקמות האוזן בקלות רבה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק שברי רקמת אוזן באמצעות הקצה העליון של בוכנת מזרק 5 מיליליטר. לחצו בתנועות מעגליות נגד מסננת עד שכל שנותר הוא רקמות החיבור לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את מסננות תא פעמיים עם 500 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את כל נפח של הבאר לתוך צינור מ&quot;ל 50 דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף היטב עם 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA ולהעביר את נפח לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. שמור את הצינור על הקרח. הערה: פעולות שונות על מנת לבודד תאים בסך הכל מן העור והרקמות DLN מסוכמים באיור 5. </li></ol>כותרת &quot;&gt; 7. רוזן ואת הכדאיות של תאים שנאספו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה העור דגימות DLN במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant. בעדינות resuspend גלולה עם 300 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף נפח קטן של מדגם זה לספור את המספר הכולל של תאים מבודדים מן העור DLN באמצעות hemocytometer. להוסיף 0.04% trypan כחול כדי לקבוע את כדאיות התא. </li></ol> 8. חסימה ללא Antigen ספציפית מחייב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של CD16 נטולות-תווית / CD32 Fc-בלוק נוגדן. דגירה 20 דקות ב 4 ° C (יכול ללכת יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של קר 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA. צנטריפוגה מדגם במשך 5 דקות ב 450 XG ב 4 ° C וזורקים supernatant. בעדינות resuspend גלולה עם 300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA ולשמור על דגימות קרח. </li></ol> 9. עור מכתים תאי מיאלואידית הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת סקי חסם בעברn ו- DLN מבודדים תאים עם גשש Live / Dead (כלומר 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole או DAPI), אנטי CD45 ואנטי CD11b נוגדנים ספציפיים. הערות: על מנת להעשיר את תת-אוכלוסיות תאים מיאלואידית של עניין, במיוחד אלו נדירים, CD45 + תאים לימפוציטים יכולים להיות מטוהרים בהתאמה מהעור או מדולדלת מן DLN ידי מיון תא מגנטי חרוז עזר &#39;. מאחר שרוב התאים המבודדים מן DLN הם CD45 +, השימוש בתרופות אנטי-CD45 הוא לא חובה. ניתן לכלול סמנים אחרים לזהות תת-אוכלוסיות תאים מיאלואידית של הריבית על ידי אסטרטגיה חיובית או שלילית-gating. בפרוטוקול זה, התאים מיאלואידית גייס את DLN הועשרו על ידי למעט תאי CD8α + (תא תא T כולו יכול להיות ממוקד באמצעות נוגדן ספציפי אנטי CD3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 30 דקות ב 4 ° C בחושך. הוספת 500 DPBS 1x μl + 2 FBS% + 2 מ&quot;מ EDTA, צנטריפוגה דקות מדגם 5 ב 450 XG ב 4 ° C ו להתעלמות Supernatant. חזור על השלב לשטוף פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend דגימות עם 300 DPBS 1x μl + 2 FBS% + 2 mM EDTA. מעביר את כל הנפח בתוך שפופרת FACS דרך מסננת תא 35 מיקרומטר. יש לשטוף את המסנן עם 100 DPBS 1x μl + 2% FBS + 2 mM EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התאים מוכתמים בתוך cytometer זרימה. שער לחיות תאים בודדים (DAPI -, FSC-W) כדי לכלול תאים ו כפילויות מתים. מגרש CD45 + CD11b + אירועים העור (איור 6 א) ו- (+ CD45) CD8α - CD11b + אירועים עבור (6B איור) DLN. </li></ol>

<ol>
	<li>Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+immunity+produced+by+the+injection+of+x-irradiated+sporozoites+of+plasmodium+berghei.">Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei.</a> Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).</li><li>Hoffman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+humans+against+malaria+by+immunization+with+radiation-attenuated+Plasmodium+falciparum+sporozoites.">Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum sporozoites.</a> J Infect Dis. 185 (8), 1155-1164 (2002).</li><li>Mueller, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+liver+stage+developmental+arrest+by+depletion+of+a+protein+at+the+parasite-host+interface.">Plasmodium liver stage developmental arrest by depletion of a protein at the parasite-host interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 3022-3027 (2005).</li><li>Mueller, A. K., Deckert, M., Heiss, K., Goetz, K., Matuschewski, K., Schl&#252;ter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+Plasmodium+berghei+liver+stages+persist+and+elicit+sterile+protection+primarily+via+CD8+T+cells.">Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells.</a> Am J Pathol. 171 (1), 107-115 (2007).</li><li>Tarun, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protracted+sterile+protection+with+Plasmodium+yoelii+pre-erythrocytic+genetically+attenuated+parasite+malaria+vaccines+is+independent+of+significant+liver-stage+persistence+and+is+mediated+by+CD8++T+cells.">Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells.</a> J Infect Dis. 196 (4), 608-616 (2007).</li><li>van Dijk, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated,+P36p-deficient+malarial+sporozoites+induce+protective+immunity+and+apoptosis+of+infected+liver+cells.">Genetically attenuated, P36p-deficient malarial sporozoites induce protective immunity and apoptosis of infected liver cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (34), 12194-12199 (2005).</li><li>Butler, N. S., Schmidt, N. W., Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+antimalarial+immunity+after+vaccination+with+late+liver+stage-arresting+genetically+attenuated+parasites.">Superior antimalarial immunity after vaccination with late liver stage-arresting genetically attenuated parasites.</a> Cell Host Microbe. 9 (6), 451-462 (2011).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+T+cell+immunity+against+malaria+liver+stage+after+vaccination+with+live+sporozoites+under+chloroquine+treatment.">Protective T cell immunity against malaria liver stage after vaccination with live sporozoites under chloroquine treatment.</a> J Immunol. 172 (4), 2487-2495 (2004).</li><li>Behet, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporozoite+immunization+of+human+volunteers+under+chemoprophylaxis+induces+functional+antibodies+against+pre-erythrocytic+stages+of+Plasmodium+falciparum.">Sporozoite immunization of human volunteers under chemoprophylaxis induces functional antibodies against pre-erythrocytic stages of Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 13, 136 (2014).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+Plasmodium+transmission+from+mosquito+to+mammal.">Quantitative imaging of Plasmodium transmission from mosquito to mammal.</a> Nat Med. 12 (2), 220-224 (2006).</li><li>Yamauchi, L. M., Coppi, A., Snounou, G., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+sporozoites+trickle+out+of+the+injection+site.">Plasmodium sporozoites trickle out of the injection site.</a> Cell Microbiol. 9 (5), 1215-1222 (2007).</li><li>Gueirard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host.">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18640-18645 (2010).</li><li>Voza, T., Miller, J. L., Kappe, S. H., Sinnis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrahepatic+exo-+erythrocytic+forms+of+rodent+malaria+parasites+at+the+site+of+inoculation:+clearance+after+immunization,+susceptibility+to+primaquine,+and+contribution+to+blood-stage+infection.">Extrahepatic exo- erythrocytic forms of rodent malaria parasites at the site of inoculation: clearance after immunization, susceptibility to primaquine, and contribution to blood-stage infection.</a> Infect Immun. 80 (6), 2158-2164 (2012).</li><li>Chakravarty, S., Cockburn, I. A., Kuk, S., Overstreet, M. G., Sacci, J. B., Zavala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+protective+against+malaria+liver+stages+are+primed+in+skin-draining+lymph+nodes.">CD8+ T lymphocytes protective against malaria liver stages are primed in skin-draining lymph nodes.</a> Nat Med. 13 (9), (2007).</li><li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-draining+lymph+node+priming+is+sufficient+to+induce+sterile+immunity+against+pre-erythrocytic+malaria.">Skin-draining lymph node priming is sufficient to induce sterile immunity against pre-erythrocytic malaria.</a> EMBO Mol Med. 5 (2), 250-263 (2013).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+traversal+is+important+for+progression+of+the+malaria+parasite+through+the+dermis+to+the+liver.">Host cell traversal is important for progression of the malaria parasite through the dermis to the liver.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 88-96 (2008).</li><li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph-node+resident+CD8&#945;++dendritic+cells+capture+antigens+from+migratory+malaria+sporozoites+and+induce+CD8++T+cell+responses.">Lymph-node resident CD8&#945;+ dendritic cells capture antigens from migratory malaria sporozoites and induce CD8+ T cell responses.</a> PLoS Pathog. 11 (2), e1004637 (2015).</li><li>da Silva, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+skin+immunological+disturbance+after+Plasmodium-infected+mosquito+bites.">Early skin immunological disturbance after Plasmodium-infected mosquito bites.</a> Cell Immunol. 277 (1-2), 22-32 (2012).</li><li>Mac-Daniel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+immune+response+to+injection+of+Plasmodium+sporozoites+into+the+skin.">Local immune response to injection of Plasmodium sporozoites into the skin.</a> J Immunol. 193 (3), 1246-1257 (2014).</li><li>Ribeiro-Gomes, F. L., Peters, N. C., Debrabant, A., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+capture+of+infected+neutrophils+by+dendritic+cells+in+the+skin+inhibits+the+early+anti-leishmania+response.">Efficient capture of infected neutrophils by dendritic cells in the skin inhibits the early anti-leishmania response.</a> PLoS Pathog. 8 (2), e1002536 (2012).</li><li>Thiberge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo.+imaging+of+malaria+parasites+in+the+murine+liver.">In vivo. imaging of malaria parasites in the murine liver.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1811-1818 (2007).</li><li>Ishino, T., Orito, Y., Chinzei, Y., Yuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-dependent+protein+kinase+regulates+Plasmodium+ookinete+access+to+the+midgut+epithelial+cell.">A calcium-dependent protein kinase regulates Plasmodium ookinete access to the midgut epithelial cell.</a> Mol Microbiol. 59 (4), 1175-1184 (2006).</li><li>Amino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+malaria+sporozoites+in+the+dermis+of+the+mammalian+host.">Imaging malaria sporozoites in the dermis of the mammalian host.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1705-1712 (2007).</li><li>Ploemen, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+liver+load+following+parenteral+sporozoite+administration+in+rodents.">Plasmodium liver load following parenteral sporozoite administration in rodents.</a> Vaccine. 31 (34), 3410-3416 (2013).</li><li>Epstein, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+attenuated+malaria+vaccine+designed+to+protect+through+hepatic+CD8+T+cell+immunity.">Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8 T cell immunity.</a> Science. 334 (6055), 475-480 (2011).</li><li>Roestenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+protection+against+malaria+after+experimental+sporozoite+inoculation:+an+open-label+follow-up+study.">Long-term protection against malaria after experimental sporozoite inoculation: an open-label follow-up study.</a> Lancet. 377 (9779), 1770-1776 (2011).</li><li>Seder, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+malaria+by+intravenous+immunization+with+a+nonreplicating+sporozoite+vaccine.">Protection against malaria by intravenous immunization with a nonreplicating sporozoite vaccine.</a> Science. 341 (6152), 1359-1365 (2013).</li><li>Douradinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+attenuated+P36p-deficient+Plasmodium+berghei+sporozoites+confer+long-lasting+and+partial+cross-species+protection.">Genetically attenuated P36p-deficient Plasmodium berghei sporozoites confer long-lasting and partial cross-species protection.</a> Int J Parasitol. 37 (13), 1511-1519 (2007).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function.">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> Eur J Microbiol Immunol (Bp. 2 (2), 112-120 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בפרספקטיבה של החיסון בקנה מידה גדול של בני אדם באמצעות חיסון למלריה sporozoite שלם, אחד האתגרים העיקריים להתגבר היא לפתח נתיבים אופטימיזציה ושיטות ממשל טפיל על מנת להבטיח חיסון מוצלח והגנה 24,25. אצל בני אדם, הערכת יעילות מגנה בתיווך הטפיל מוחלשים חיים (LAP) שבוצעה בעקב?...

מלריה היא אחת המחלות הזיהומיות הקטלניות בעולם, הרג יותר מחצי מיליון בני אדם בשנה. זיהום על ידי Plasmodium, הסוכן סיבתי של המחלה, מתחיל שלב טרום האריתרוציטים (PE). במהלך שלב זה, sporozoites מוזרק לתוך העור מארח ידי יתוש נקבת Anopheline להגיע הכבד דרך מחזור הדם ולבדל hepatocytes בתוך לצורות הטפילות המדביקים תאי דם אדומים ולגרום הסימפטומים של המחלה. שלבי PE של Plasmodium מהווים יעד חסוי לחיסון נגד מלריה. אכן, לחיות חיסונים מוחלשים נגד בשלבים אלה, כגון sporozoites נחלש קרינה (RAS), טפילים נעצר גנטית (GAP) או chemoprophylaxis ו sporozoites (CPS) הוכיחו את יכולתם להגן הן מכרסמים ומארחים האנושי 1-9. במודל המכרסם, רוב מחקרי חיסון נערכים ניצול חיסון תוך ורידים, המהווה את תקן הזהב במונחים של יעילות מגן. עם זאת, התיאור של שלב עור ואת החשיבות של הבלוטה לימפה הניקוז הקשורים עור (DLN) ב לעורר הגנה השתנה התפיסה שלנו של שלב PE והדגיש את החשיבות של המסלול תוך-עורית של הזרקה. הדמיה Intravital של פ sporozoites berghei מוזרק לתוך העור של מכרסמים הראו כי רק ~ 25% של הבידוד מגיע הכבד דרך מחזור הדם. הנותרים ~ 75% מפיצה בין הפרוקסימלי DLN (~ 15%) ואת העור (~ 50%) 10,11, שבו חלק קטן יכול להפוך ולהישאר בחיים במשך שבועות בתוך תאי העור 12,13. יתר על כן, מחקרים מאוחרים יותר תיאר כי הקמת הגנה חיסונית יעילה לאחר חיסון intradermal בעיקר מתרחש בעור-DLN, שבו טפיל ספציפי תאי CD8 + T מופעלים, ורק באופן שולי בטחול או בכבד-dLNs 14,15. בזמןרוב המחקרים התמקדו באפיון תא המפעיל המעורב בהקמה בתגובת מגן חיסון, הרבה פחות ידוע על גורלם של טפילי מוחלשים חיים מוזרקים לתוך העור, במיוחד יחסי הגומלין שלהם עם מערכת החיסון המולדת. בפרט, אפיון של תאי מציגי אנטיגן מעורבים ספיג אנטיגן הטפיל, עיבוד והצגה לתאי CD8 + T הוא בעלת חשיבות מכרעת, בידיעה כי רכישת אנטיגן PE יכולה להתרחש הוא בעור ותאי DLN. מחקרי הדמיה intravital הקודם תיאר נהירה מוקדם של תאים חיוביים במאור פלורסנט ליס-GFP בעור בעקבות עקיצת יתוש זיהומיות 16 תוך אינטראקציות מוקדם בין sporozoites ותאים דנדריטיים נצפו DLN 10,17. לאחרונה, זה כבר דווח כי sporozoites המחוסן בעור על ידי יתושים מגביר את תנועתיות של שני תאי T הדנדריטים ורגולטוריים בעורעכברים, בעוד מספר ירידה של תאים מציגי אנטיגן נצפתה DLN 18. החוקרים ביקשו לזהות ולכמת ליתר דיוק תת לויקוציטים גייס בעור המקביל DLN כמו גם אלה אינטראקציה עם הטפיל לאחר ההזרקה intradermal של מחסנת מינונים של RAS 19. בהקשר זה, אנחנו מבודדים תאי מיאלואידית (CD45 + CD11b +) משני הרקמות ומאופיינות תת-אוכלוסיות של ריבית על ידי זרימה רבה = פרמטרית cytometry. עולה בקנה אחד עם התגובה החיסונית מתוארת בשלב המוקדם של דלקת עור גדולה שושנת יריחו 20, תגובת המארח העיקרית sporozoite הזרקת מורכב גיוס רצוף של נויטרופילים polymorphonuclear (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) ואחריו מונוציטים דלקתיים (CD45 + CD11b + Ly6G - Ly6C +) אשר מזוהים על בסיס differentiביטוי אל של סמני משטח Ly6G ו Ly6C. אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד תאי מיאלואידית מעור עכבר DLN לאחר הזרקת intradermal של מחסנת מינונים של RAS שחולצו מן בלוטות רוק יתוש נגועות. זריקות תוך-עורית לשחזור ועיבוד רקמה הם שלבים קריטיים לכמת שינויים פנוטיפי של הסתננות אוכלוסיית תאים בתוך רקמות נגועות. הגישה כמפורט להלן מספק assay אמין להעריך את העור לתגובה דלקתית DLN כדי טפיל Plasmodium ויכול להתארך עד מערכות ניסיוניות שונות.

<table><tbody><tr><td>Ketamine: Imalgene&amp;reg; 1,000</td><td>Merial</td><td>-</td><td>50 mg/kg: prior sporozoite injection

125 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>Xylazine: Rompun&amp;reg; 2%</td><td>Bayer</td><td>-</td><td>5 mg/kg: prior sporozoite injection

12.5 mg/kg: prior sacrifice</td></tr><tr><td>NanoFil syringe + 35 gauge needle</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Omnican&amp;reg; 50 Insulin syringe 0.5 ml/50 I.U.</td><td>B. Braun Medical&amp;nbsp;</td><td>9151125</td><td>-</td></tr><tr><td>MultiwellTM 6 well tissue culture plate &amp;ndash; Flat Bottom</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>353046</td><td>-</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352350</td><td>-</td></tr><tr><td>2 ml syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-02S</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 15 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352097</td><td>-</td></tr><tr><td>BLUE MAXTM 50 ml Polypropylene conical tube</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352098</td><td>-</td></tr><tr><td>5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35 &amp;micro;m Cell-Strainer Cap</td><td>BD Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td>-</td></tr><tr><td>DPBS 1x CaCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt; and MgCl&lt;sup&gt;2-&lt;/sup&gt;-free</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>-</td></tr><tr><td>DMEM 1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>-</td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM or 2.5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td>-</td></tr><tr><td>HEPES buffer solution (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Trypan blue Stain (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Dilution 1:10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 &amp;micro;g/ml final (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPure&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; grade</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 &amp;micro;g/ml final</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD45 (30-F11 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:200</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (M1/70 clone)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8&amp;alpha; (5H10 clone)</td><td>Life Technologies</td><td>MCD0830</td><td>&amp;nbsp;Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Female C57BL/6JRj mice (7-week-old)&amp;nbsp;</td><td>Janvier Laboratories</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

myeloid cell isolation from mouse skin and draining lymph node following intradermal immunization with live attenuated plasmodium sporozoites

זיהום מלריה מתחיל כאשר בשלב sporozoite של Plasmodium הוא מחוסן לתוך העור של מארח יונק באמצעות עקיצת יתוש. הטפיל הניע מאוד לא רק מגיע הכבד לפלוש hepatocytes ולהפוך לצורה כדורית-זיהומיות. זה גם נודד לתוך העור כדי הלימפה הפרוקסימלי ניקוז באזור הזריקה, שם הוא יכול להיות מוכר מושפל על ידי תושב ו / או תאי מיאלואידית גייס. הדמית Intravital דיווחה על הגיוס המוקדם של לויקוציטים החיובי ליס-GFP ניאון בהיר בעור ואת יחסי הגומלין בין sporozoites ו CD11c + תאי הלימפה הניקוז. אנו מציגים כאן הליך יעיל להתאושש, לזהות למנות את תת תא מיאלואידית כי מגויסים על העור העכבר וניקוז בלוטת לימפה לאחר ההזרקה intradermal של מחסנת מינונים של sporozoites במודל בעכברים. זרימת אפיון פנוטיפי רבה פרמטרית באמצעות cytometry מספקתassay אמין להעריך שינויים הסלולר דינמיים מוקדם במהלך תגובה דלקתית לזיהום Plasmodium.

אנחנו לאחרונה הראינו כי הזרקת מחט מזרק של מינונים מחסנים של פ berghei sporozoites בעור העכבר גורם גיוס רצוף של נויטרופילים polymorphonuclear ואחריו מונוציטים דלקתיים בעור DLN 19. באזור הפרוטוקול שתואר לעיל מפרט את ההליך המשמש לבודד תאי מיאלואידית חיו בהצלח?...

Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites at JoVE.com

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

17.1K Views.  Institut Pasteur. We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

Video: Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and epidermis home a variety of immune cells in both homeostatic and inflammatory conditions. Tools to obtain skin cell release for cytofluorimetric analyses are, therefore, very useful in order to study the complex network of immune cells residing in the skin and their response to microbial stimuli. Here, we describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin to rapidly and efficiently obtain single-cell suspensions. This protocol allows maintenance of maximum cell viability without compromising surface antigen expression. We also describe how to take and digest skin samples from different anatomical locations, such as the ear, trunk, tail, and footpad. The obtained suspensions are then stained and analyzed by flow cytometry to discriminate between different leukocyte populations.

The skin is home to a complex immune cell network. We describe an efficient methodology for the digestion of mouse skin, from different parts of the animal's body, in order to obtain a single-cell suspension and analyze the different leukocyte populations resident in the skin by flow cytometry.

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום<em&gt; Mycobacterium בוביס</em&gt; Bacille Calmette-גרן

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting cells. When the skin encounters invading pathogens, different cutaneous DCs initiate a distinct T cell immune response to protect the body. Among the invading pathogens, fungal infection specifically drives a protective interleukin-17-producing Th17 immune response. A protocol was developed to efficiently differentiate Th17 cells by intradermal Candida albicans infection to investigate a subset of cutaneous DCs responsible for inducing Th17 immunity. Flow cytometry and gene expression analyses revealed a prominent induction of Th17 immune response in skin-draining lymph nodes and infected skin. Using diphtheria toxin-induced DC subset-depleting mouse strains, CD301b+ dermal DCs were found to be responsible for mounting optimal Th17 differentiation in this model. Thus, this protocol provides a valuable method to study in vivo function of differential subsets of cutaneous DCs to determine Th17 immunity against deep skin fungal infection.

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

Here, we demonstrate the in vivo function of cutaneous dendritic cell subsets in Th17 immunity of deep dermal Candida albicans infection.

The skin is the outermost barrier organ in the body, which contains several types of dendritic cells (DCs), a group of professional antigen-presenting ...

Intradermal Immunization with Live Attenuated Sporozoites in a Mouse Model

Source: Mac-Daniel, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53796">Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay for immunizing a mouse model with live attenuated sporozoites. The radiation-attenuated Plasmodium sporozoites are injected into the dorsal side of the mouse&#39;s ear. After injections at multiple locations on both ears, the mouse is allowed to recover.

חיסון תוך עורי עם ספורוזואיטים חיים מוחלשים במודל עכבר

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי

הכנת תא בודד השעיות עבור ניתוח Cytofluorimetric מאזורים העור עכבר שונים

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

בידוד של ההסתננות Leukocytes מעור העכבר באמצעות אנזימתי לעכל והפרדת צבע

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Assay CFSE המבוסס לחקר נדידת תאי דנדריטים עור Murine לתוך ניקוז בלוטות הלימפה במהלך זיהום

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

In vivo Function of Differential Subsets of Cutaneous Dendritic Cells to Induce Th17 Immunity in Intradermal Candida albicans Infection

חיסון תוך עורי עם ספורוזואיטים חיים מוחלשים במודל עכבר