The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P Domain Cloning <ol><li> Bestimmen Sie die P - Domäne kodierende Region durch Sequenzabgleich von Norovirus - Stämme (zB GII.10 Stamm, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Außerdem entfernen die flexible Region am C-terminalen Ende der P - Domäne (2A). Codonspezifische Optimierung der DNA für E. coli - Expression und umfassen BamHI (N-terminal) und NotI (C-terminal) Restriktionsstellen , um Sub-Klon der P - Domäne kodierende Region in den pMalc2x Expressionsvektor 6,7. Hinweis: Der P-Domäne codierende Region wird optimiert und durch einen kommerziellen Service synthetisiert. Die P-Domäne kodierende Region (Einsatz) beträgt etwa 1 kb in der Länge und in einem Standard-Transfervektor geliefert. </li><li> Digest 2 ug des Transfervektors mit je 1 ul BamHI (20000 U / ml) und NotI (10.000 U / ml) Restriktionsenzyme für 1 h bei 37 ° C mit einer vom Hersteller gelieferten Puffer. </li><li> Trennen Sie die verdaute Einsatz auf einem 1% Agarosegelfür 20 min bei 135 V und reinigen die Insert-DNA aus dem Gel unter Verwendung eines kommerziellen Kits. </li><li> Bereiten Sie die pMalc2x Expressionsvektor von 2 ug dieses Vektors Digerieren mit je 1 ul BamHI (20000 U / ml) und NotI (10.000 U / ml) Restriktionsenzyme für 1 h bei 37 ° C. Reinige den Vektor aus einem Agarosegel, wie oben beschrieben (1,3). Anmerkung: Beide Proben (1,2 und 1,4) bei -20 ° C gelagert werden. </li><li> Ligieren des gereinigten Inserts in dem verdauten Vektor pMalc2x an den BamHI- und NotI - Restriktionsstellen mit 1 ul T4-DNA - Ligase (400.000 U / ml) für 15 min bei Raumtemperatur (RT) (2B und 2C). Verwenden Sie mindestens 20 ng des pMalc2x Vektor und einem Vektor: Insert Verhältnis 1: 3 (Molekulargewicht). Die Ligationsmix ist in der Regel ~ 20 &amp; mgr; l. </li><li> Transformieren 2 &amp; mgr; l der Ligationsmischung in 50 &amp; mgr; l chemisch kompetente E. coli DH5a Bakterienzellen ein Standard - Transformationsprotokoll (10 min auf Eis, Hitzeschock 45 Sekunden bei 42 ° C) und wachsen in 600 unter Verwendung von&amp; mgr; l SOC-Medium für 1 Stunde bei 37 ° C. Centrifuge die transformierten Zellen für 3 min bei 1000 · g, den Überstand verwerfen und das Pellet in 30 &amp; mgr; l SOC-Medium. <ol><li> Platte der Transformationsmischung auf LB-Agar-Platten, 100 ug / ml Ampicillin zur Selektion enthält, und wachsen über Nacht bei 37 ° C. Wählen Sie mindestens fünf Kolonien. </li></ol></li><li> Für jede der fünf Kolonien inokulieren 2-3 ml Kultur von LB-Medium, ergänzt mit 50 ug / ml Ampicillin (LB-amp) und wachsen über Nacht bei 160 rpm bei 37 ° C schüttelnd. </li><li> Extrahieren Sie die Plasmide, die aus der über Nacht Kultur eines kommerziellen Kits verwenden. Überprüfen Sie das Vorhandensein der P-Domäne Einsatz durch Sequenzierung mit einem pMalc2x Forward-Primer (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;) und Reverse-Primer (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> 2. P Domain Expression <ol><li> Transformieren 1 ul (150 ng / ul - 400 ng / &amp; mgr; l) des pMalc2x Vektors kodierend für das MBP-His-P domainFusionsproteins in 50 ul kompetenten E. coli BL21 Zellen eine Standard - Transformationsprotokoll (10 min auf Eis, Hitzeschock 45 sec bei 42 ° C) verwendet und bei 37 ° C für 1 Stunde in 600 &amp; mgr; l SOC - Medium wachsen. Subkultur in 120 ml LB-amp über Nacht bei 160 rpm und 37 ° C. </li><li> Beimpfen von neun Litern (beispielsweise 6 x 5 L Kolben mit 1,5 l Medium jeweils) von LB-amp mit der Subkultur (1: 100). Wachsen die Zellen bei 160 Umdrehungen pro Minute und 37 ° C schütteln , bis die OD 600 0,4 erreicht - 0,6. Anschließend wird für ca. 1 Stunde die Temperatur auf 22 ° C abzusenken und dann mit 0,66 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 8 , um die Proteinexpression induzieren. Wachsen die Zellen über Nacht bei 22 ° C (~ 18 h). Hinweis: Die Temperatur variiert werden kann, aber wir empfehlen 22 ° C oder weniger zu verwenden. </li><li> Ernte der Zellen durch Zentrifugation (10.543 xg, 15 min, 4 ° C). Überstand verwerfen und frieren das Zellpellet bei -20 ° C. </li></ol>1. Reinigungsschritt und Protease - Spaltung <ol><li> Bereiten Puffer, die während der Proteinreinigungsschritte aus Stammlösungen verwendet werden, die Reproduzierbarkeit und die Stabilität der Experimente zu gewährleisten. Bereiten vier verschiedenen Puffern für die immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC), die jeweils eine andere Konzentration an Imidazol (10 mM, 20 mM, 50 mM und 250 mM). Für die SEC, bereiten Sie einen Gelfiltrationsexperimente Puffer (GFB) mit einer höheren Salzkonzentration, jedoch ohne Imidazol. Verwenden deionisiertem Wasser und filtern alle Puffer vor Verwendung mit einer Porengröße von 0,45 um. Hinweis: Für eine detaillierte Pufferherstellungsschema finden Sie in Tabelle 1. </li><li> Auftauen des Zellpellets aus der neun Liter Kultur und lösen sich bei 4 ° C in 150 ml PBS. Beschallen die Zellsuspension dreimal für 2 min (Leistung 130 W, 20% Amplitude, Impulsfrequenz 50%) der Zellen zu stören. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis während der Beschallung. </li><li> Centrifuge Die beschallte Zellsuspension (43.667 xg, 30 min, 4 ° C) aus dem Überstand von Zelltrümmern zu trennen exprimierte Protein enthält. Sammeln Sie den Überstand und das Pellet verwerfen. </li><li> Wash und 10 ml (= 1 Säulenvolumen [CV]) Schlamm aus Nickel (Ni) -NTA Agarose-Kügelchen mit 10 mM Imidazol-Puffer in einer Chromatographiesäule äquilibrieren. Fügen Sie die äquilibrierte Ni-Perlen zu dem Überstand aus Stufe 3.3, enthaltend exprimierten MBP-His-P-Domäne-Fusionsprotein und Inkubieren für 30 min bei 4 ° C unter langsamer Rotation. </li><li> Nach der Inkubation gelten für eine Chromatographiesäule die gesamte Ni-bead-Proteinmischung. Die Säule wird langsam mit je 5 CVs von 10 mm, 20 mm und 50 mM Imidazol - Puffer mit 10 mM beginnen, dann 20 mM und letzten 50 mM (3A). </li><li> Eluieren die MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein unter Verwendung von 250 mM Imidazol - Puffer (3A). Während der Elution, überprüfen Sie die OD 280nm die Elution des Fusionsproteins zu überprüfen (der Anstieg der OD 280nm). Weiterhin Elution , bis die OD 280nm zu Tropfen ~ 0,1. Waschen der Kügelchen mit übermäßiger Mengen von 250 mM Imidazol-Puffer (mindestens 10 CVs), gefolgt von mindestens 10 CVs von 10 mM Imidazol-Puffer. Speichern Sie die Perlen für die zweite Reinigungsstufe (Abschnitt 4). </li><li> Überprüfen die Anwesenheit des MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein mit SDS-PAGE unter Verwendung eines 12% SDS-Polyacrylamidgel (10 x 8 cm) 9 (3A). Führen Sie Gel-Elektrophorese bei 45 A und 200 V für 45 min. </li><li> Konzentrat (beispielsweise eine kommerzielle Konzentrator verwendet wird ) das eluierte MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein zu einer Endkonzentration von ~ 3 mg / ml. Spalten die MBP-His-P Domäne Fusion mit HRV-3C - Protease während der Dialyse gegen 2 l 10 mM Imidazol - Puffer (~ 1: 100) über Nacht bei 4 ° C (Abbildung 3A). Je nach Endvolumen von konzentriertem Protein, führen Dialyse in einer Dialysekassette oder Dialyseschlauch. Anmerkung: Die Menge der HRV-3C-Protease für die ProteinSpaltung berechnet wird entsprechend der spezifischen Protease-Aktivität (2 U / &amp; mgr; l, 1 U ist ausreichend, um 100 ug Protein abzuspalten) und der Menge des eluierten Fusionsproteins, die auf dem Expressionsniveau variiert und kann aus dem SDS-PAGE-Ergebnis (3.7 abschätzbar ). </li></ol> 4. 2. Reinigungsschritt <ol><li> Äquilibrieren die Ni-Perlen aus Schritt 3.6 in 10 Imidazolpuffers mM. </li><li> Inkubieren der dialysierten Protein aus Schritt 3.7 mit den äquilibriert Ni-beads (4.1) für 30 min bei 4 ° C unter langsamer Rotation (gespalten P domain, MBP-Protein und HRV-Protease enthält). </li><li> Tragen Sie die Ni-Perlen - Mischung auf eine Säule und sammeln Sie die Flow-Through (gespalten P - Domäne) (3B). Messen Sie die Konzentration des Proteins , wie es die Spalte , bis die OD 280 nm erreicht ~ 0.1 kommt weg. Hinweis: Das MBP-His sollte die Ni-beads (3B) gebunden bleiben. </li><li> Prüfen Sie das Vorhandensein von gespaltenen P-Domäne unter Verwendung von SDS-PAGE mit einem 12% Gel , wie oben (3B) beschrieben. Konzentrieren der eluierten P Domäne ~ 3 mg / ml und dialysiere über Nacht bei 4 ° C gegen GFB für nachfolgende SEC Reinigung. </li></ol> 5. 3. Reinigungsschritt <ol><li> Waschpumpen und Leitungen der HPLC-Reinigungsanlage und Pre-äquilibrieren der SEC-Säule (siehe Materialliste) mit GFB. </li><li> Injizieren der P-Domäne auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min eine Superloop (bis zu 12 ml) oder Schleife (bis zu 3 ml), je nach dem Volumen der konzentrierten Probe. Nach der Injektion abgeschlossen ist, erhöhen auf 2,5 ml / min Volumenstrom. </li><li> Da die OD erhöht und die P-Domäne aus der Säule kommt, sammeln Fraktionen von 1,5 ml. Überprüfen Fraktionen mittels SDS-PAGE mit einem 12% -Gel (4A und 4B). Pool nur die reinsten Fraktionen und konzentriere auf ~ 3 mg / ml und ~ 8 mg / ml. Hinweis: Nach ~ 110 ml (Hohlraumvolumen) die meisten Verunreinigungen aus einer SEC-Säule mit 320 ml Bettvolumen eluiert werden. DasP-Domäne wird in der Regel als ein Dimer eluiert. Elutionszeit / Volumen der P-Domäne Dimer ist abhängig von der Präparationsgüte (pg) der SEC-Säule. </li></ol> 6. Die Kristallisation des P-Domäne <ol><li> Verwenden, um die P-Domäne bei ~ 3 mg / ml und 8 mg / ml für die anfängliche Kristallisation Screening. Bereiten Sie mindestens 100 &amp; mgr; l P-Domäne pro Konzentration für Einstiegsbildern mit 384 im Handel erhältlichen Screening-Bedingungen. Screening bei 18 ° C in einer 96-Well-Plattenformat, in dem der Vorratsbehälter enthält 100 &amp; mgr; l Stammlösung und ein Tropfen besteht aus 0,2 &amp; mgr; l Stammlösung und 0,2 &amp; mgr; l Protein. </li><li> Wiederholen und optimieren erfolgreiche Kristallisationsbedingungen. Daher verwenden 15-Well-Platten, die 3 Zeilen enthalten. Stellen Sie die erste Zeile mit 100% Mutterlösung auf, die zweite Reihe mit 90% Stammlösung und 10% Wasser, und die dritte Reihe mit 80% Stammlösung und 20% Wasser. Verwenden Sie eine Tropfengröße von 2 &amp; mgr; l (1 ul Protein + 1 &amp; mgr; l Stammlösung) und 50081; l der Mutterlösung als Behältervolumen. </li><li> Verwenden Sie optimierte Kristall Bedingungen für die Co-Kristallisation des P-Domäne mit Liganden. Bereiten Platten wie in 6.2 beschrieben. Anstelle von 2 ul Tropfengröße eingesetzten Tropfen, die 1 &amp; mgr; l Mutterlösung, 1 &amp; mgr; l Protein und 1 ul-Ligand in einer Konzentration von 1 mg / ml. </li><li> Sammeln Sie Datensätze von Einkristallen mit Synchrotronstrahlung. Führen des molekularen Ersatzes unter Verwendung veröffentlichter P Domänenstrukturen mit einer hohen Sequenzähnlichkeit als erste Suche Modell 6,10-13. Hinweis: Die Anwesenheit eines Liganden zeigt sich als nicht modellierte blob der Elektronendichte. </li></ol>

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	<li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li><li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+calicivirus.">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li><li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus.">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li><li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals.">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability.">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li><li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+RNA+and+codon+optimization:+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression.">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants.">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li><li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly.">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle.">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li><li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+noroviruses'+fondness+for+histo-blood+group+antigens.">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li><li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens.">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Expression und Reinigung von Norovirus P-Domänen in hoher Qualität und Quantität. Noroviren sind nicht gut untersucht und Strukturdaten werden kontinuierlich benötigt. Unseres Wissens P Domain Produktion mit anderen Protokollen (zB GST-tagged P - Domänen) war problematisch, so weit, und eine ausreichende strukturelle Daten auf Norovirus-Wirt - Interaktion gefehlt haben. Mit dem hier beschriebenen Verfahren haben wir in letzter Zeit wesentlich zum Verständnis der...

Menschliche Noroviren sind die Hauptursache der akuten Gastroenteritis weltweit 1. Diese Viren gehören zur Familie der Caliciviridae, von denen es mindestens fünf Gattungen, einschließlich Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus und Nebovirus. Trotz ihrer hohen Einfluss auf das Gesundheitssystem und die weite Verbreitung, die Untersuchung der menschlichen noroviruses wird durch das Fehlen eines stabilen Zellkultursystem behindert. Bis heute gibt es keine zugelassenen Impfstoffe oder antivirale Strategien zur Verfügung. Das Norovirus Hauptkapsidprotein, genannt VP1, kann in eine Schale (S) -Bereich und einem vorstehenden (P) Domäne 2 geteilt werden. Die P-Domäne wird durch ein flexibles Scharnier (H) Region der S-Domäne verbunden. Die S-Domäne bildet ein Gerüst, um die Virus-RNA, während die P-Domäne den äussersten Teil des viralen Capsid bildet. Die P-Domäne versammelt in biologisch relevanten Dimere, wenn sie in Bakterien exprimiert. Die P dimer mit Kohlenhydratstrukturen in Wechselwirkung tritt, bezeichnet als histo-Blutgruppenantigene (HBGAs) , die als lösliche Antigene im Speichel vorhanden sind und auf bestimmte Wirtszellen 3 gefunden. Die P domain-HBGA Interaktion wird gedacht für Infektions 4 wichtig. Tatsächlich ergab eine kürzlich veröffentlichten Bericht die Bedeutung von synthetischen HBGAs oder Bakterien , die für die menschliche Norovirus - Infektion in vitro 5 HBGA-Ausdruck zu bringen. Aktuelle Studien der Wirtszelle Befestigung noroviruses Bezug hauptsächlich mit virusähnlichen Partikeln (VLPs) durchgeführt , die in Insektenzellen oder die mit rekombinanten P Domänen exprimiert in Escherichia coli (E. coli) exprimiert werden kann. Um zu verstehen, können die P-Domäne-HBGA Wechselwirkungen auf atomarer Ebene, P Domain-HBGA komplexe Strukturen werden Röntgenkristallographie gelöst werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die P-Domäne Expression und Reinigung, die für Röntgen Crystall verwendet Produktion von P-Domäne in hoher Quantität und Qualität werden könnengraphie. Außerdem kann dieses Verfahren für andere Calicivirus P-Domänen und nicht-strukturelle Proteine ​​angewendet werden. Die P - Domäne wird Codon-optimiert für E. coli - Expression und in einem Standard - Transfer - Vektor geklont. Die P-Domäne wird dann in einen Expressionsvektor re-kloniert, das einen Polyhistidin (His) Markierung und ein Mannose-bindendes Protein (MBP), die durch eine Protease-Spaltstelle gefolgt werden codiert. Das MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein wird in E. ausgedrückt coli, durch drei Reinigungsschritten gefolgt. Das MBP-His-P-Domäne-Fusionsprotein wird unter Verwendung von immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC). Als nächstes wird das Fusionsprotein mit humanem Rhinovirus (HRV) -3C Protease gespalten und die P-Domäne von MBP-His durch eine zusätzliche IMAC-Reinigungsschritt abgetrennt wird. Schließlich wird die P-Domäne unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie (SEC) gereinigt. Das gereinigte P-Domäne können dann für die Röntgenkristallographie verwendet werden. Screening von Proteinkristallisationsbedingungen ist perfoRMED mit im Handel erhältlichen Screening-Kits unterschiedliche P Domäne Proteinkonzentrationen verwendet wird. Kristallwachstum beobachtet und die vielversprechendste Bedingungen optimiert sind. Mit den hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, vom Gen zum Protein zu gehen innerhalb von weniger als vier Wochen zu strukturieren. Deshalb ist unsere Methode der P Domain Expression, Reinigung und Kristallisation eignet Norovirus-Wirt-Interaktion auf molekularer Ebene zu untersuchen und wichtige Daten liefern zu unterstützen, up-to-date Impfstoff-Design und Wirkstoff-Screening.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>P domain DNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GeneArt Gene Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMalc2x&#160; vector</td>
			<td>On request</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column Chromatography Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td>2.5 cm x 10 cm, possible to use other size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>various</td>
			<td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRV 3C Protease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>71493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-34</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG Core suites</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>various</td>
			<td>4 screens with each 96 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrates</td>
			<td>Dextra Laboratories, UK</td>
			<td>various</td>
			<td>Blood group products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

Die Norovirus-Kapsid eines einzigen großen strukturellen Protein zusammengesetzt ist, bezeichnet VP1. VP1 in eine Schale (S) -Bereich und einem vorstehenden (P) Domäne unterteilt. Die S-Domäne bildet eine zusammenhängende Gerüst um die virale RNA, während die P-Domäne Formen viraler Spitzen auf der S-Domäne enthält und Determinanten für die Antigenität und Host-Zell-Interaktionen. Die P - Domäne bindet Kohlenhydratstrukturen, dh., Histo-Blutgruppenantigene, die für Norovirus - Infektionen wichtig sind gedacht zu sein. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode für hochwertige Norovirus P-Domänen in hohen Ausbeuten herzustellen. Diese Proteine ​​können dann für die Röntgenkristallographie und ELISA verwendet werden, um die Antigenität und Host-Zell-Interaktionen zu studieren. Die P-Domäne wird zuerst in einen Expressionsvektor kloniert und exprimiert dann in Bakterien. Das Protein wird gereinigt drei Schritte ausführen, die Metall-Ionen-Affinitätschromatographie und Grßenausschlußchromatographie immobilisiert beinhalten. ImGrundsätzlich ist es möglich, zu klonen, Express, zu reinigen und zu kristallisieren Proteine ​​in weniger als vier Wochen, die in diesem Protokoll zur Analyse von neu entstehenden Norovirus-Stämme ein schnelles System macht.

Die schematische Darstellung der beschriebenen Protokoll ist in 1 dargestellt. Das Protokoll 6 Hauptteile umfasst , die Klonierung des Zielgens die Expression umfassen einen dreistufigen Reinigung und Kristallisation. 2 veranschaulicht die Konstruktion des Expressionskonstrukts (EC) und Eigenschaften des pMalc2x Expressionsvektor. Die Sequenz der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des pMalc2x Vektor zeigt Restriktions und Proteasespaltstellen. Abb...

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Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Herstellung von humanen Noroviren hervorstehendem Domains in<em&gt; E. coli</em&gt; Für Röntgenkristallographie

Hier beschreiben wir eine Methode zum Ausdruck bringen und eine hohe Qualität Norovirus vorstehende (P) Domänen in E. reinigen coli für die Verwendung in der Röntgenkristallographie Studien. Dieses Verfahren kann auf andere Calicivirus P Domänen angewendet werden, sowie Nicht-Strukturproteine, dh., Virales Protein - Genom-linked (VPg), Protease und RNA - abhängige RNA - Polymerase (RdRp).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

8.6K Aufrufe.  University of Heidelberg and the German Cancer Research Center.  Hier beschreiben wir eine Methode zum Ausdruck bringen und eine hohe Qualität Norovirus vorstehende (P) Domänen in E. reinigen coli für die Verwendung in der Röntgenkristallographie Studien. Dieses Verfahren kann auf andere Calicivirus P Domänen angewendet werden, sowie Nicht-Strukturproteine, dh., Virales Protein - Genom-linked (VPg), Protease und RNA - abhängige RNA - Polymerase (RdRp). 

Serie: Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Transformation von Plasmid-DNA in E. coli mit dem Hitzeschock-Methode

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Forschung

Biologie

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Nicht-invasive 3D-Visualisierung mit Sub-Mikron-Auflösung mit Synchrotron-Röntgen-Tomographie

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing. Traditional, mold-injection methods to create models or parts have several limitations, the most important of which is a difficulty in making highly complex products in a timely, cost-effective manner.1 However, gradual improvements in three-dimensional printing technology have resulted in both high-end and economy instruments that are now available for the facile production of customized models.2 These printers have the ability to extrude high-resolution objects with enough detail to accurately represent in vivo images generated from a preclinical X-ray CT scanner. With proper data collection, surface rendering, and stereolithographic editing, it is now possible and inexpensive to rapidly produce detailed skeletal and soft tissue structures from X-ray CT data. Even in the early stages of development, the anatomical models produced by three-dimensional printing appeal to both educators and researchers who can utilize the technology to improve visualization proficiency. 3, 4 The real benefits of this method result from the tangible experience a researcher can have with data that cannot be adequately conveyed through a computer screen. The translation of pre-clinical 3D data to a physical object that is an exact copy of the test subject is a powerful tool for visualization and communication, especially for relating imaging research to students, or those in other fields. Here, we provide a detailed method for printing plastic models of bone and organ structures derived from X-ray CT scans utilizing an Albira X-ray CT system in conjunction with PMOD, ImageJ, Meshlab, Netfabb, and ReplicatorG software packages.

Using modern plastic extrusion and printing technologies, it is now possible to quickly and inexpensively produce physical models of X-ray CT data taken in a laboratory. The three -dimensional printing of tomographic data is a powerful visualization, research, and educational tool that may now be accessed by the preclinical imaging community.

3D Printing der präklinischen X-ray computertomographische Datensätze

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.