The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P Alan Klonlama <ol><li> Norovirus soylarının dizi hizalama P etki kodlama bölgesini belirlemek (örneğin, GII.10 suşu, GenBank: AF504671, pdb-ID: 3ONU) 6. Ayrıca, p alan (Şekil 2A) C-terminal ucunda, esnek bölümünün ayrılması. E için DNA kodon-optimize E. coli ekspresyonu ve BamHI alt-klonlamak için (N-terminal) ve Notl (C-ucu) sınırlama sitelerini pMalc2x sentezleme vektörü 6,7 bölgeyi kodlayan P alanı bulunmaktadır. Not: P alan kodlama bölgesi optimize edilmiş ve ticari bir hizmet tarafından sentezlenir. bölge (insert) kodlama P etki yaklaşık 1 uzunluğunda kb ve standart bir transfer vektörü teslim olduğunu. </li><li> Her 1 ul, BamHI (20,000 U / ml) ve Notl (10,000 U / ml) sınırlama üreticisi tamponlar birlikte 37 ° C &#39;de 1 saat boyunca enzimler ile transfer vektörü 2 ug Digest. </li><li> bir% 1 agaroz jeli üzerinde sindirildi insert Ayrıve 135 V&#39;da 20 dakika boyunca, bir ticari kit kullanılarak kolloidden uç DNA arındırmak. </li><li> her biri 1 ul BamHI (20,000 U / ml) ve Notl (10,000 U / ml) bir kısıtlama, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca enzimleri bu vektörün 2 ug sindirerek pMalc2x ekspresyon vektörü hazırlanır. (1.3) yukarıda tarif edildiği gibi bir agaroz jelinden vektör saflaştınlır. Not: her iki numune (1.2 ve 1.4) -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) (Şekil 2B ve 2C), 15 dakika boyunca 1 ul T4 DNA ligazı (400,000 U / mL) ile, BamHI ve Notl sınırlama mevkilerinde sindirilmiş pMalc2x vektörüne saflaştırılmıştır ekleme Arter. uç oranı 1: 3 (molekül ağırlığı) pMalc2x vektör ve bir vektör, en az 20 ng kullanımı. Bağlama karışımı genellikle ~ 20 ul. </li><li> 50 ul kimyasal yeterli E. içine ligasyon karışımı 2 ul Transform E. coli DH5α standart transformasyon protokolü (buz üzerinde 10 dakika, ısı şoku 42 ° C&#39;de 45 saniye) kullanarak, bakteri hücreleri ve 600 büyür37 ° C&#39;de 1 saat boyunca ul SOC ortamı. Santrifüj dönüştürülmüş hücreler 1,000 xg&#39;de 3 dakika boyunca, supernatant atmak ve SOC ortamı 30 ul pelletini. <ol><li> seçimi için, 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB-agar plakaları üzerinde bir dönüşüm karışımı plakası ve 37 ° C&#39;de gece boyunca büyür. en az beş koloni seçin. </li></ol></li><li> Beş kolonilerin her biri için, 50 ug / ml ampisilin (amp LB-) ile desteklenmiş LB-ortamı 2-3 ml kültürü inoküle ve 37 ° C&#39;de 160 rpm&#39;de bir gece boyunca çalkalanarak büyür. </li><li> ticari bir kit kullanılarak gece boyunca kültürden plazmidler ekstrakte edin. Bir pMalc2x ileri primer (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;) ile dizilenerek P alanı, ek maddenin varlığını doğrulamak ve ters primer (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> 2. P Alan İfade <ol><li> MBP-His-P etki alanı için pMalc2x vektör kodlama - (400 ng / ml 150 ng / ul) 1 ul Transformyeterli E., 50 ul olarak füzyon proteini, Standart bir transformasyon protokolü (buz üzerinde 10 dakika, ısı şoku 42 ° C&#39;de 45 saniye) kullanılarak E. coli BL21 hücreleri ve 37 ° C &#39;de 1 saat süre ile 600 ul SOC ortamında büyür. gece boyunca 160 rpm&#39;de ve 37 ° C&#39;de LB-amp 120 ml Alt kültür. </li><li> Altkültür (: 100 1) ile LB-amp (1.5 L ortamı ile her örneğin 6 x 5 L şişeleri), dokuz litre aşılamak. 0.6 - OD600 0.4 ulaşana kadar 160 rpm&#39;de ve 37 ° C de çalkalanarak hücrelerin büyütün. Daha sonra, yaklaşık 1 saat boyunca 22 ° C&#39;ye kadar sıcaklık daha düşük ve daha sonra izopropil-β-D-tiogalaktopiranosid 0,66 mM (IPTG) 8 protein ifadesini teşvik eder. gece boyunca 22 ° C (~ 18 saat) hücreler büyütün. Sıcaklık, çeşitli olabilir, ancak, 22 ° C veya daha düşük kullanımı önerilir: edin. </li><li> santrifüj ile (10.543 xg, 15 dakika, 4 ° C) hücreler hasat edilir. Süpernatantı atın ve -20 ° C&#39;de hücre pelletini dondurmak. </li></ol>1. saflaştırma adımı ve proteaz parçalama <ol><li> deneylerin tekrarlanabilirliği ve istikrarı garanti altına almak için hisse senedi çözümlerinden protein saflaştırma adımları sırasında kullanılan tamponlar hazırlamak. hareketsiz metal iyonu yakınlık kromatografisi için dört farklı tamponlar (IMAC), imidazol farklı bir konsantrasyonunu ihtiva eden her bir (10 mM, 20 mM, 50 mM ve 250 mM) hazırlayın. SEC için, daha yüksek bir tuz konsantrasyonuna sahip bir jel filtrasyon tamponu (GFB) maddesinin hazırlanması, ancak imidazol yoktur. iyonu giderilmiş su kullanarak ve 0.45 um&#39;lik bir gözenek büyüklüğüne sahip kullanımdan önce tüm tamponları filtre. Not: detaylı tampon hazırlanması Şema için Tablo 1 &#39;e bakın. </li><li> dokuz litrelik kültür hücre pelletini çözülme ve 4 ° C&#39;de 150 mi, PBS içinde çözülür. Hücreleri bozmaya hücre süspansiyonu 2 dakika (güç 130 W, genlik% 20, darbe frekansı% 50) için üç kez sonikasyon. sonikasyon sırasında buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li><li> SantrifüjGE sonike hücre süspansiyonu (43.667 xg, 30 dakika, 4 ° C) olarak tanımlanan bir proteini ihtiva eden yüzer hücre artıkları ayırmak için. Süpernatant toplayın ve pelet atın. </li><li> Yıkama ve Nikel (Ni), bir kromatografi kolonu 10 mM imidazol tamponu -NTA agaroz boncuklar 10 ml (= 1 kolon hacminde [CV]) bulamaç dengelenmesi. Aşama 3,3 süpernatana dengelenmiş Ni boncuk ekleyin MBP-His-P alanı füzyon proteini olarak ifade ve yavaş dönme ile, 4 ° C&#39;de 30 dakika inkübe içeren. </li><li> İnkübasyondan sonra, bir kromatografi kolonuna, tüm Ni-Boncuk protein karışımı uygulanır. 10 mM, 20 mM, 10 mM, daha sonra 20 mM son 50 mM (Şekil 3A) ile başlanarak, 50 mM imidazol tampon her biri 5 CV ile yavaş yavaş sütundan yıkanır. </li><li> 250 mM imidazol tamponu (Şekil 3A) kullanılarak MBP-His-P alanı füzyon proteinini ayrıştırmak. Elüsyon süresince, füzyon proteininin elüsyon (OD 28 artış doğrulamak için OD 280nm kontrol0nm). OD 280nm ~ 0.1 düşene kadar elüsyon devam edin. 10 mM imidazol tamponu en az 10 CV ardından 250 mM imidazol tamponu (en az 10 CV) aşırı miktarda boncuk yıkayın. İkinci saflaştırma aşamasından (bölüm 4) için boncuk kaydedin. </li><li> % 12 SDS-poliakrilamit jeli (10 x 8 cm) 9 (Şekil 3A) kullanılarak SDS-PAGE ile MBP-His-P alanı füzyon proteininin varlığını kontrol edin. 45 A jel elektroforezi gerçekleştirmek ve 45 dakika için 200 V. </li><li> ~ 3 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar (ticari konsantratör kullanılarak, örneğin) elüe MBP-His-P alanı füzyon proteinini konsantre edilir. (~ 1: 100), 10 mM 2 L karşı diyaliz sırasında imidazol tampon HRV-3C proteazı ile MBP-His-P alanı füzyon klivaj gece boyunca 4 ° C&#39;de (Şekil 3A). Konsantre edilen protein nihai hacmine bağlı olarak, bir diyaliz kaseti veya diyaliz tübüne diyaliz gerçekleştirin. Not: proteini için HRV-3C proteaz miktarınıbölünmesi belirli bir proteaz aktivitesi göre hesaplanır ve ifade düzeyinde değişiklik ve SDS-PAGE sonuç tahmin edilebilir temizlenen füzyon proteinin bir miktar (3,7 (2 U / ul, 1 U-100 protein ug parçalamak için yeterlidir) ). </li></ol> 4. 2. saflaştırma adımından <ol><li> 10 mM imidazol tamponu içinde adım 3.6 Ni-boncuk dengelenmesi. </li><li> Yavaş rotasyon ile 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca dengeye Ni-boncuk (4.1) ile (ayrıldı P alan MBP protein ve HRV-proteaz ihtiva eden) aşama 3,7 Diyaliz edilen protein inkübe edin. </li><li> Bir sütuna Ni-boncuk karışımı uygulayın ve flow-through (bölünmüş P etki) (Şekil 3B) toplamak. OD 280nm ~ 0.1 ulaşana kadar sütun kapalı geliyor gibi protein konsantrasyonu ölçün. Not: MBP-His Ni-boncuk (Şekil 3B) bağlı olarak kalır. </li><li> 1 ile SDS-PAGE kullanılarak bölünmüş P etki varlığını kontrol% 2 jeli (Şekil 3B), yukarıda tarif edilen. ~ 3 mg / ml ila elüt P alan konsantre edin ve daha sonra saflaştırma için SEC GFB karşı 4 ° C de bir gece boyunca diyaliz. </li></ol> 5. 3. saflaştırma adımından <ol><li> Yıkama pompaları ve HPLC arıtma sisteminin boruları ve ön denge SEC-sütunu GFB ile (Malzeme Listesine bakınız). </li><li> Konsantre edilmiş örneğin hacmine bağlı olarak, 1 ml (3 ml kadar) süper-(en fazla 12 mi) ya da öze kullanılarak / dakikalık bir akış hızında kolona P alan enjekte edilir. Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, / dakika 2.5 ml akış oranı. </li><li> OD artar ve p alan sütun dışan geldiğinde, 1.5 ml fraksiyonlar toplanır. % 12 jel ile SDS-PAGE kullanılarak fraksiyonların kontrol (Şekil 4A ve 4B). Havuz yalnızca en saf parçalar ve • 3 mg / ml ve • 8 mg / ml olacak şekilde konsantre edilir. Not: 110 ° sonra, ml (boşluk hacmi) en yabancı maddeler 320 ml yatak hacmi ile SEC kolonundan elüte edilir.P alanı genellikle bir dimer halinde elüt edilmiştir. P alanı dimerinin elüsyon zaman / hacim SEC kolonunun hazırlık derecesindeki (PG) bağlıdır. </li></ol> P Domain 6. Kristalleşme <ol><li> Başlangıç ​​taraması için kristalizasyon ~ 3 mg / ml ve 8 mg / ml&#39;de p alan kullanın. 384 piyasada mevcut tarama koşulları ile ilk ekranlar için konsantrasyon başına P etki en az 100 ul hazırlayın. Rezervuar ana çözelti 100 ul ihtiva eden bir 96-yuvalı plaka formatı, 18 ° C de bir tarama yapmak ve bir damla 0.2 ul ana çözelti ve 0.2 ul protein oluşmaktadır. </li><li> Tekrarlayın ve başarılı kristalleşme koşulları optimize. Bu nedenle, 3 satır içerecek 15-kuyu tabak kullanın. % 100 ana çözelti,% 90 anne solüsyonu ve% 10 su ve% 80 anne solüsyonu ve% 20 su ile üçüncü sırada ikinci satır ile ilk sırayı ayarlayın. 2 ul (1 ul protein + 1 ul anne çözelti) ve 500 bir damla boyutu kullanın81; bir hazne hacmi ana çözelti l. </li><li> ko-kristalize ligandlar P etki alanı için optimize kristal koşullarını kullanın. 6.2 de tarif edildiği gibi tabak hazırlayın. Bunun yerine 2 | il damla boyutu, 1 ul ana çözelti, 1 ul protein ve 1 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda ligandın 1 ul ihtiva eden damla ayarlayın. </li><li> sinkrotron radyasyon kullanarak tek kristallerin veri setleri toplayın. Ilk arama modeli 6,10-13 gibi yüksek sekans benzerliği ile yayınlanan P alan yapıları kullanılarak moleküler değiştirme gerçekleştirin. Not: Bir ligand varlığı elektron yoğunluğunun un modellenmiştir blob olarak gösterir. </li></ol>

<ol>
	<li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li><li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+calicivirus.">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li><li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus.">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li><li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals.">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li><li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells.">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability.">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li><li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+RNA+and+codon+optimization:+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression.">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants.">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li><li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaser+crystallographic+software.">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li><li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHENIX:+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution.">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li><li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly.">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li><li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle.">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li><li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+noroviruses'+fondness+for+histo-blood+group+antigens.">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li><li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens.">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada yüksek kalite ve miktar norovirus P etki ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol açıklar. Noroviruses iyi çalışılmış değildir ve yapısal verileri sürekli ihtiyaç vardır. Bildiğimiz kadarıyla, diğer protokolleri (örneğin, GST-etiketli P alanları) kullanarak P etki üretimi bugüne kadar, sorunlu olmuştur ve norovirus-konak etkileşimi yeterli yapısal verilerin eksik edilmiştir. yöntem burada açıklanan, biz son zamanlarda bağlayıcı karbohidrat norovirusa moleküler ay...

İnsan Noroviruses akut gastroenterit, dünya çapında 1 başlıca nedenidir. Bu virüsler Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus ve Nebovirus dahil olmak üzere en az beş cins, var olan Calıcıvırıdae ailesine aittir. sağlık sisteminin ve geniş dağılımı üzerindeki yüksek etkisine rağmen, insan Noroviruses çalışma sağlam bir hücre kültürü sisteminin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Bugüne kadar hiçbir onaylı aşılar veya antiviral stratejiler vardır. Norovirus majör kapsid proteini, VP1 olarak da adlandırılan bir tabaka (S) alan ve çıkıntı yapan bir (P) etki 2 ayrılabilir. P etki esnek menteşe (H) bölgeye göre S etki alanına bağlıdır. P etki viral kapsid dıştaki bölümünü oluşturur oysa S etki, viral RNA etrafında bir iskele oluşturur. bakterilerde ifade edildiğinde P etki biyolojik ilgili dimerleri içine toplanır. Öimer karbonhidrat yapıları ile etkileşim, tükürük çözünür antijenler olarak mevcut ve belirli konakçı hücreler 3 bulundu olan histo-kan grubu antijenleri (HBGAs) olarak adlandırılan. P etki alanı HBGA etkileşim enfeksiyonu 4 için önemli olduğu düşünülmektedir. Nitekim, son bir rapor sentetik HBGAs veya in vitro 5 insan norovirus enfeksiyonu için bakteri HBGA-ifade önemini ortaya koymuştur. Noroviruses konakçı hücre eki ile ilgili Güncel çalışmalar çoğunlukla böcek hücrelerinde veya Escherichia coli (E. Coli) &#39;de eksprese edilen rekombinant P alanları ile ifade edilebilir virüs benzeri partiküller (VLP&#39;ler) ile gerçekleştirilmiştir. atomik çözünürlükte P etki alanı HBGA etkileşimleri anlamak için, P etki-HBGA kompleks yapıların X-ışını kristalografisi kullanılarak çözülebilir. Burada, yüksek miktarda ve kalitede P alanının üretimi X-ışını da kristalin için kullanılmasına imkan verir P alan ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol açıklarcoğrafyayı. Dahası, bu yöntem, diğer calicivirüs P alanları ve yapısal olmayan proteinler için uygulanabilir. P etki E. için kodon optimizasyonu E. coli sentezleme ve standart bir aktarım vektörü içine klonlandı. P alanı daha sonra, bir polihistidin bölgesini (His) etiketi ve bir proteaz bölünme sitesi tarafından takip edilen mannoz bağlayıcı protein (MBP) kodlayan bir ekspresyon vektörü içine yeniden klonlanmıştır. MBP-His-P alanı füzyon proteini E. ifade edilir E. coli, üç saflaştırma kademesi takip. MBP-His-P alanı füzyon proteini hareketsizleştirilmiş metal iyonu ilişkisi kromatografisi (IMAC) kullanılarak saflaştırılır. Daha sonra, füzyon proteini, insan rinovirüs (HRV) -3C proteaz ve P alanı ayrılır yarılır MBP-His ek IMAC saflaştırma aşaması. Son olarak, P alan boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırılır. saflaştınldı P alan X-ışını kristalografisi için kullanılabilir. Protein kristalizasyon koşullarına taranması perfo olanFarklı P domain proteini konsantrasyonları kullanılarak piyasada mevcut tarama kitleri ile rmed. Kristal büyüme gözlenir ve en umut verici koşullar optimize edilmiştir. yöntemleri burada tarif ile, en az dört hafta içinde yapısı proteine ​​gen gitmek mümkündür. Bu nedenle, P etki ifadesi, saflaştırma ve kristalizasyon bizim yöntem moleküler düzeyde norovirus-host etkileşimi incelemek ve up-to-date aşı tasarımı ve ilaç tarama yardımcı olmak için önemli veri sağlamak için uygundur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>P domain DNA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>GeneArt Gene Synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMalc2x&#160; vector</td>
			<td>On request</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column Chromatography Column</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7372512</td>
			<td>2.5 cm x 10 cm, possible to use other size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>various</td>
			<td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Subcloning Efficiency DH5&#945; Competent Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRV 3C Protease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>71493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-34</td>
			<td>SEC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG Core suites</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>various</td>
			<td>4 screens with each 96 wells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrates</td>
			<td>Dextra Laboratories, UK</td>
			<td>various</td>
			<td>Blood group products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

norovirus kapsid tek büyük yapısal protein oluşur, VP1 olarak adlandırılır. VP1, bir tabaka (S) alan ve çıkıntı yapan bir (P) etki bölünür. S etki P etki formları S etki viral sivri ise, viral RNA etrafında bitişik iskele oluşturan ve antijenikliği ve konak hücre etkileşimleri belirleyicilerini içerir. P etki, yani., Düşünülen histo-kan grubu antijenleri, norovirus enfeksiyonları için önemli olduğu, karbonhidrat yapıları bağlar. Bu protokol, yüksek verimlerle kaliteli norovirus P etki üretmek için bir yöntem tarif eder. Bu proteinler daha sonra antijenikliği ve konak hücre etkileşimleri incelemek üzere X-ışını kristalografisi ve ELISA için kullanılabilir. P alan ilk bir ekspresyon vektörü içine klonlanabilir ve bakterilerde ifade edilmektedir. Protein, metal iyon afinite kromatografisi ve boyut dışlama kromatografisi immobilize barındırır üç adım kullanılarak saflaştırılır. İçindeilkesi, ekspres, klonlama arındırmak ve bu protokol yeni ortaya çıkan norovirus suşları analiz etmek için hızlı bir sistem yapar az dört hafta, proteinleri kristalize etmek mümkündür.

Tarif edilen protokol şematik Şekil 2. Protokol hedef genin klonlanması, ekspresyonu, üç aşamalı bir saflaştırma ve kristalizasyon, 6 ana parçaları kapsamaktadır., Şekil 1 &#39;de gösterilen sentezleme konstruktunun tasarımını görüntülemektedir (AT) ve pMalc2x ifade vektörünün özellikleri. PMalc2x vektörünün çoklu klonlama bölgesinin (MCS) dizisi sınırlama ve proteaz parçalama sitesi gösterir. Şekil 3, i...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

İnsan Norovirüs çıkıntılı Domains üretimi içinde<em&gt; E. E. coli</em&gt;, X ışını Kristallografi için

Burada, ifade ve E. (P) etki çıkıntılı yüksek kaliteli Norovirus arındırmak için bir yöntem tarif E. coli X-ışını kristalografisi çalışmalarında kullanılmak üzere. Bu yöntem, diğer calicivirüs P etki, hem de yapısal olmayan proteinleri de uygulanabilir, yani., Virüs protein genom bağlı (VPg), proteaz ve RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

production-human-norovirus-protruding-domains-e-coli-for-x-ray

Research

JoVE Journal

Biology

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

8.6K Görüntüleme.  University of Heidelberg and the German Cancer Research Center.  Burada, ifade ve E. (P) etki çıkıntılı yüksek kaliteli Norovirus arındırmak için bir yöntem tarif E. coli X-ışını kristalografisi çalışmalarında kullanılmak üzere. Bu yöntem, diğer calicivirüs P etki, hem de yapısal olmayan proteinleri de uygulanabilir, yani., Virüs protein genom bağlı (VPg), proteaz ve RNA bağımlı RNA polimeraz (RdRp). 

Video: Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Isı Şoku Yöntemiyle E. coli içine Plazmid DNA Dönüşüm

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Biyoloji

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Sinkrotron-X-ray tomografi Sub-mikron Çözünürlük ile Non-invaziv 3D Görselleştirme

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

3D Printing of Preclinical X-ray Computed Tomographic Data Sets

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing. Traditional, mold-injection methods to create models or parts have several limitations, the most important of which is a difficulty in making highly complex products in a timely, cost-effective manner.1 However, gradual improvements in three-dimensional printing technology have resulted in both high-end and economy instruments that are now available for the facile production of customized models.2 These printers have the ability to extrude high-resolution objects with enough detail to accurately represent in vivo images generated from a preclinical X-ray CT scanner. With proper data collection, surface rendering, and stereolithographic editing, it is now possible and inexpensive to rapidly produce detailed skeletal and soft tissue structures from X-ray CT data. Even in the early stages of development, the anatomical models produced by three-dimensional printing appeal to both educators and researchers who can utilize the technology to improve visualization proficiency. 3, 4 The real benefits of this method result from the tangible experience a researcher can have with data that cannot be adequately conveyed through a computer screen. The translation of pre-clinical 3D data to a physical object that is an exact copy of the test subject is a powerful tool for visualization and communication, especially for relating imaging research to students, or those in other fields. Here, we provide a detailed method for printing plastic models of bone and organ structures derived from X-ray CT scans utilizing an Albira X-ray CT system in conjunction with PMOD, ImageJ, Meshlab, Netfabb, and ReplicatorG software packages.

Using modern plastic extrusion and printing technologies, it is now possible to quickly and inexpensively produce physical models of X-ray CT data taken in a laboratory. The three -dimensional printing of tomographic data is a powerful visualization, research, and educational tool that may now be accessed by the preclinical imaging community.

Preklinik X-ışını bilgisayarlı tomografi Veri 3D Yazdırma Setleri

Three-dimensional printing allows for the production of highly detailed objects through a process known as additive manufacturing.  Traditional, ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.