The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P dominio Clonazione <ol><li> Determinare la regione codificante dominio P per l&#39;allineamento di sequenze di ceppi di norovirus (ad esempio, ceppo GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Inoltre, rimuovere la regione flessibile all&#39;estremità C-terminale del dominio P (Figura 2A). Codone-ottimizzare il DNA per E. espressione coli e comprendono BamHI (N-terminale) e NotI (C-terminale) siti di restrizione al fine di sub-clone del dominio P regione codificante in pMalc2x vettore di espressione 6,7. Nota: La regione codificante dominio P è ottimizzata e sintetizzato da un servizio commerciale. Il dominio P regione codificante (inserto) è di circa 1 kb di lunghezza e consegnato in un vettore di trasferimento standard. </li><li> Digest 2 ug del vettore di trasferimento con ogni 1 BamHI microlitri (20.000 U / ml) e NotI (10.000 U / ml) enzimi di restrizione per 1 ora a 37 ° C con il produttore fornito buffer. </li><li> Separare l&#39;inserto digerito su un gel di agarosio 1%per 20 min a 135 V e purificare il DNA dell&#39;inserto dal gel usando un kit commerciale. </li><li> Preparare il vettore di espressione pMalc2x digerendo 2 ug di questo vettore con ciascuna 1 ml BamHI (20.000 U / ml) e NotI (10.000 U / ml) enzimi di restrizione per 1 ora a 37 ° C. Purificare il vettore da un gel di agarosio come descritto sopra (1.3). Nota: Entrambi i campioni (1.2 e 1.4) possono essere conservati a -20 ° C. </li><li> Legare l&#39;inserto purificato nel vettore pMalc2x digerito nei siti di restrizione BamHI e NotI con 1 ml T4-DNA ligasi (400.000 U / ml) per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) (Figura 2B e 2C). Utilizzare almeno 20 ng del vettore pMalc2x e un vettore: rapporto inserto 1: 3 (peso molecolare). La miscela di legamento è di solito ~ 20 l. </li><li> Transform 2 ul di miscela di ligasi in E. 50 microlitri chimicamente competenti coli DH5α cellule batteriche utilizzando un protocollo standard di trasformazione (10 min in ghiaccio, heat shock 45 sec a 42 ° C) e crescere in 600media SOC ml per 1 ora a 37 ° C. Centrifugare le cellule trasformate per 3 minuti a 1000 xg, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 30 ml di mezzo SOC. <ol><li> Piatto mix trasformazione su piastre LB-Agar, contenente 100 ug / ml di ampicillina per la selezione, e crescere durante la notte a 37 ° C. Selezionare almeno cinque colonie. </li></ol></li><li> Per ciascuna delle cinque colonie, inoculare 2-3 coltura ml di LB-medium supplementato con 50 ug / ml di ampicillina (LB-amp) e crescere agitando per una notte a 160 rpm a 37 ° C. </li><li> Estrarre i plasmidi dalla cultura durante la notte utilizzando un kit commerciale. Verificare la presenza dell&#39;inserto dominio P mediante sequenziamento con un primer forward pMalc2x (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;) e primer reverse (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> Espressione 2. P Domain <ol><li> Trasforma 1 ml (150 ng / ml - 400 ng / ml) della codifica vettore pMalc2x per il MBP-His-P dominioproteina di fusione in 50 ml di E. competente cellule coli BL21 utilizzando un protocollo standard di trasformazione (10 min in ghiaccio, heat shock 45 sec a 42 ° C) e crescono in media SOC 600 ml per 1 ora a 37 ° C. Subculture in 120 ml di LB-amp durante la notte a 160 giri al minuto e 37 ° C. </li><li> Seminare nove litri (ad esempio, 6 x 5 L palloni con 1,5 L di medie ciascuna) di LB-amp con la sottocultura (1: 100). Crescere le cellule agitando a 160 giri al minuto e 37 ° C fino a quando la OD 600 raggiunge 0,4-0,6. Successivamente, abbassare la temperatura a 22 ° C per ~ 1 ora e quindi indurre l&#39;espressione di proteine ​​con 0,66 mM di isopropil-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 8. Crescere le cellule durante la notte a 22 ° C (~ 18 ore). Nota: La temperatura può essere variata, ma si consiglia di utilizzare 22 ° C o inferiore. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione (10.543 xg, 15 min, 4 ° C). Eliminare il surnatante e congelare il pellet cellulare a -20 ° C. </li></ol>° Purificazione Step e proteasi fenditura <ol><li> Preparare buffer che vengono utilizzati durante le fasi di purificazione proteine ​​da soluzioni madre di garantire riproducibilità e stabilità degli esperimenti. Preparare quattro tamponi differenti per il metallo immobilizzato ionico cromatografia di affinità (IMAC), ciascuno contenente una diversa concentrazione di imidazolo (10 mM, 20 mM, 50 mM e 250 mM). Per la SEC, preparare un tampone di gel-filtrazione (GFB) con una concentrazione di sale più elevata, ma senza imidazolo. Utilizzare acqua deionizzata e filtrare tutti i buffer prima di utilizzarlo con una dimensione dei pori di 0,45 micron. Nota: Per una dettagliata schema di preparazione del buffer, fare riferimento alla Tabella 1. </li><li> Scongelare il pellet di cellule dalla cultura nine litri e sciogliere in 150 ml di PBS a 4 ° C. Sonicare la sospensione cellulare tre volte per 2 min (potenza 130 W, ampiezza 20%, frequenza impulsi 50%) per distruggere le cellule. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio durante sonicazione. </li><li> Centrifuge la sospensione cellulare sonicato (43.667 xg, 30 min, 4 ° C) per separare detriti cellulari dal supernatante contenente proteina espressa. Raccogliere il surnatante e scartare il pellet. </li><li> Lavare ed equilibrare 10 ml (= 1 volume colonna [CV]) impasto di Nichel (Ni) perline agarosio -nta con 10 mM tampone imidazolo in una colonna cromatografia. Aggiungere le perline Ni equilibrati per il surnatante dal punto 3.3 contenente espresso MBP-His-P dominio proteina di fusione e incubare per 30 minuti a 4 ° C con rotazione lenta. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, applicare l&#39;intera miscela Ni-bead-proteina ad una colonna cromatografica. Lavare la colonna lentamente con ogni 5 CV di 10 mm, 20 mm, e 50 mm buffer imidazolo, a partire da 10 mm, 20 mm e poi le 50 mm (Figura 3A). </li><li> Eluire il MBP-His-P proteina di fusione del dominio utilizzando 250 mm tampone imidazolo (Figura 3A). Durante l&#39;eluizione, controlla l&#39;280nm OD per verificare l&#39;eluizione della proteina di fusione (l&#39;aumento OD 280nm). Continuare fino a quando la eluizione 280nm OD scende a ~ 0.1. Lavare le perline con quantità eccessive di 250 mm tampone imidazolo (almeno 10 CV), seguita da almeno 10 CV di 10 mm tampone imidazolo. Salvare le perline per la seconda fase di purificazione (sezione 4). </li><li> Verificare la presenza della proteina di fusione del dominio MBP-His-P con SDS-PAGE su gel 12% SDS-poliacrilammide (10 x 8 cm) 9 (Figura 3A). Eseguire gel elettroforesi a 45 A e 200 V per 45 min. </li><li> Concentrato (ad esempio, utilizzando un concentratore commerciale) dominio MBP-His-P proteina di fusione eluita ad una concentrazione finale di ~ 3 mg / ml. Cleave la fusione del dominio MBP-His-P con HRV-3C proteasi durante la dialisi contro 2 L di 10 mM di tampone imidazolo (~ 1: 100) notte a 4 ° C (Figura 3A). A seconda del volume finale di proteine ​​concentrate, eseguire la dialisi in una cassetta dialisi o tubo di dialisi. Nota: La quantità di HRV-3C proteasi per le proteineclivaggio viene calcolato secondo la specifica attività della proteasi (2 U / ml, 1 U è sufficiente per fendere 100 mg di proteina) e la quantità di proteina di fusione eluite che varia il livello di espressione e può essere stimata dal risultato SDS-PAGE (3.7 ). </li></ol> 4. 2 ° Fase Purificazione <ol><li> Equilibrare le Ni-perle dal punto 3.6 a 10 tampone imidazolo mm. </li><li> Incubare la proteina dializzata dal punto 3.7 (contenente dominio spaccati P, proteine ​​MBP e HRV-proteasi) con le Ni-perle equilibrate (4.1) per 30 minuti a 4 ° C con rotazione lenta. </li><li> Applicare la miscela Ni-bead a una colonna e raccogliere il flow-through (dominio P spaccati) (Figura 3B). Misurare la concentrazione di proteine ​​come viene fuori la colonna fino alla 280nm OD raggiunge ~ 0.1. Nota: Il MBP-His dovrebbe rimanere legato alle Ni-perline (figura 3b). </li><li> Verificare la presenza di dominio spaccati P mediante SDS-PAGE con un 1Gel 2% come sopra descritto (Figura 3B). Concentrare il dominio P eluita a ~ 3 mg / ml e dializzare notte a 4 ° C contro GFB per successiva purificazione SEC. </li></ol> 5. 3 ° Purificazione Passo <ol><li> Le pompe di lavaggio e tubi del sistema di purificazione HPLC e pre-equilibrare la SEC-colonna (vedi elenco Materials) con GFB. </li><li> Iniettare il dominio P per la colonna ad una portata di 1 ml / min usando un Superloop (fino a 12 ml) o loop (fino a 3 ml), a seconda del volume del campione concentrato. Dopo l&#39;iniezione è terminata, aumentare la portata di 2,5 ml / min. </li><li> Come le OD aumenta e il dominio P si stacca la colonna, raccogliere frazioni di 1,5 ml. Controllare frazioni utilizzando SDS-PAGE con un gel al 12% (Figura 4A e 4B). Pool solo i più puri frazioni e concentrarsi per ~ 3 mg / ml e ~ 8 mg / ml. Nota: dopo ~ 110 ml (volume vuoto) la maggior parte delle impurità vengono eluite da una colonna SEC con un volume di 320 ml letto. Ildominio P è generalmente eluito come dimero. Elution tempo / volume del dimero dominio P dipende dal grado di preparazione (pg) della colonna SEC. </li></ol> 6. Cristallizzazione della P Domain <ol><li> Utilizzare il dominio P a ~ 3 mg / ml e 8 mg / ml per lo screening cristallizzazione iniziale. Preparare almeno 100 ml di dominio P per la concentrazione per gli schermi iniziali con 384 condizioni di screening disponibili in commercio. Eseguire lo screening a 18 ° C in un formato piastra a 96 pozzetti, dove il serbatoio contiene 100 ml di soluzione madre e una goccia è composta da 0,2 soluzione madre microlitri e 0,2 microlitri proteina. </li><li> Ripetere e ottimizzare le condizioni di cristallizzazione di successo. Pertanto, utilizzare piastre 15 pozzetti contenenti 3 righe. Impostare la prima fila con soluzione madre 100%, la seconda fila con soluzione al 90% madre e 10% di acqua, e la terza fila con soluzione madre 80% e 20% di acqua. Utilizzare una dimensione goccia di 2 ml (soluzione madre di proteine ​​+ 1 ml 1 ml) e 50081; l di soluzione madre come volume del serbatoio. </li><li> Utilizzare le condizioni di cristallo ottimizzate per la co-cristallizzare il dominio P con leganti. Preparare piastre come descritto al punto 6.2. Invece di 2 microlitri dimensioni di goccia, impostare gocce contenenti 1 ml soluzione madre, 1 proteine ​​ml e 1 ml di ligando ad una concentrazione di 1 mg / ml. </li><li> Raccogliere set di dati di singoli cristalli utilizzando radiazione di sincrotrone. Eseguire la sostituzione molecolare utilizzando strutture di dominio P pubblicati con una somiglianza alta sequenza iniziale di ricerca del modello 6,10-13. Nota: La presenza di un ligando si presenta come non-modellato blob di densità elettronica. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+noroviruses'+fondness+for+histo-blood+group+antigens.">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li><li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens.">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui, descriviamo un protocollo per l&#39;espressione e la purificazione di domini P norovirus in alta qualità e quantità. Norovirus non sono ben studiati e dati strutturali sono continuamente necessari. A nostra conoscenza, la produzione dominio P utilizzando altri protocolli (ad esempio, domini P GST-tagged) è stato problematico, fino ad ora, e dati strutturali sufficienti interazione norovirus-host sono stati dispersi. Con il metodo qui descritto, abbiamo recentemente contribuito in modo significativo alla...

Norovirus umani sono la principale causa di gastroenterite acuta in tutto il mondo 1. Questi virus appartengono alla famiglia Caliciviridae, di cui ci sono almeno cinque generi, tra cui Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, e Nebovirus. Nonostante il loro elevato impatto sul sistema sanitario e ampia distribuzione, lo studio dei norovirus umani è ostacolata dalla mancanza di un sistema di coltura cellulare robusto. Fino ad oggi, non ci sono vaccini autorizzati o strategie antivirali disponibili. La proteina capside maggiore norovirus, definito VP1, può essere diviso in un guscio (S) e un dominio sporgente (P) del dominio 2. Il dominio P è collegato al dominio S da una regione cerniera flessibile (H). Il dominio S forma una impalcatura attorno alla RNA virale, mentre il dominio P costituisce la parte più esterno del capside virale. Il dominio P assembla in dimeri biologicamente rilevanti quando espresso in batteri. Il P dIMER interagisce con le strutture di carboidrati, denominati antigeni del gruppo isto-sangue (HBGAs) che sono presenti come antigeni solubili nella saliva e trovato su alcune cellule ospiti 3. L&#39;interazione dominio HBGA P è pensato per essere importante per l&#39;infezione 4. Infatti, un recente rapporto ha rivelato l&#39;importanza di HBGAs sintetici o HBGA esprimono batteri per l&#39;infezione da norovirus umano in vitro 5. Gli studi in corso per quanto riguarda l&#39;attaccamento cellula ospite di norovirus sono principalmente eseguiti con particelle virus-simili (VLP) che possono essere espresse in cellule di insetto o con i domini P ricombinanti espressi in Escherichia coli (E. coli). Per capire le interazioni P dominio HBGA a risoluzione atomica, strutture complesse P dominio HBGA possono essere risolti mediante cristallografia a raggi X. Qui, descriviamo un protocollo per l&#39;espressione del dominio P e purificazione che permette la produzione di dominio P in alta quantità e qualità da utilizzare per crystall raggi Xografia. Inoltre, questo metodo può essere applicato per altri domini calicivirus P e proteine ​​non strutturali. Il dominio P è codone-ottimizzato per E. espressione coli e clonato in un vettore di trasferimento standard. Il dominio P viene poi ri-clonato in un vettore di espressione che codifica una polyhistidine tag (His) e una proteina legante mannosio (MBP) che sono seguiti da un sito proteasi clivaggio. Il-His-P MBP proteina di fusione del dominio è espresso in E. coli, seguita da tre fasi di purificazione. La proteina di fusione del dominio MBP-His-P viene purificato mediante cromatografia immobilizzato metallo ionica affinità (IMAC). Successivamente, la proteina di fusione viene scisso con rinovirus umano (HRV) proteasi -3C e il dominio P è separato dal MBP-His da un ulteriore passaggio di purificazione IMAC. Infine, il dominio P viene purificato mediante cromatografia di esclusione dimensionale (SEC). Il dominio P purificato può essere utilizzato per la cristallografia a raggi X. Proiezione delle condizioni di cristallizzazione delle proteine ​​è perfoconfermate con i kit di screening disponibili in commercio che utilizzano differenti concentrazioni di proteine ​​dominio P. crescita dei cristalli si osserva e le condizioni più promettenti sono ottimizzate. Con i metodi qui descritti, è possibile passare dal gene alla proteina di strutturare in meno di quattro settimane. Pertanto, il nostro metodo di espressione P dominio, purificazione e cristallizzazione è adatto per studiare l&#39;interazione norovirus-ospite a livello molecolare e di fornire dati importanti per aiutare nella progettazione e farmaci di screening vaccino up-to-date.

<table><tbody><tr><td>P domain DNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>GeneArt Gene Synthesis</td></tr><tr><td>pMalc2x&amp;nbsp; vector</td><td>On request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column Chromatography Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td>2.5 x 10 cm, possible to use other size</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>various</td><td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&amp;alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C Protease</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>SEC column</td></tr><tr><td>JCSG Core suites</td><td>Qiagen</td><td>various</td><td>4 screens with each 96 wells</td></tr><tr><td>Carbohydrates</td><td>Dextra Laboratories, UK</td><td>various</td><td>Blood group products</td></tr></tbody></table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

Il capside norovirus è composto da una singola proteina strutturale principale, denominato VP1. VP1 è suddiviso in un guscio (S) dominio e un dominio sporgenti (P). Il dominio S forma una impalcatura contigua intorno l&#39;RNA virale, mentre le forme di dominio P picchi virali sul dominio S e contiene determinanti per antigenicità e host-cellule interazioni. Il dominio P lega strutture di carboidrati, ad esempio., Antigeni del gruppo isto-sangue, che si pensa siano importanti per le infezioni norovirus. In questo protocollo, si descrive un metodo per la produzione di domini norovirus P di alta qualità con rese elevate. Queste proteine ​​possono quindi essere utilizzati per la cristallografia a raggi X ed ELISA per studiare antigenicità e host-cellule interazioni. Il dominio P viene prima clonato in un vettore di espressione e quindi espressa in batteri. La proteina è purificata utilizzando tre fasi che coinvolgono immobilizzati metallo-ioni cromatografia di affinità e le dimensioni cromatografia di esclusione. Inlinea di principio, è possibile clonare, espresso, purificare, e cristallizzare le proteine ​​in meno di quattro settimane, il che rende questo protocollo un sistema rapido per l&#39;analisi dei ceppi di norovirus emergenti.

Lo schema del protocollo descritto è illustrato in Figura 1. Il protocollo comprende 6 parti principali che includono la clonazione del gene bersaglio, espressione, una purificazione tre fasi, e la cristallizzazione. Figura 2 illustra il disegno del costrutto di espressione (CE) e caratteristiche del vettore di espressione pMalc2x. La sequenza del sito di clonaggio multiplo (MCS) del vettore pMalc2x mostra restrizione e proteasi siti di taglio. ...

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Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

Produzione di Norovirus umani sporgenti Domini in<em&gt; E. coli</em&gt; Per la cristallografia a raggi X

Qui, descriviamo un metodo per esprimere e purificare norovirus di alta qualità sporgenti (P) domini in E. coli per l&#39;utilizzo in studi di cristallografia a raggi X. Questo metodo può essere applicato ad altri domini calicivirus P, così come le proteine ​​non-strutturali, cioè., Proteina virale genoma-linked (VPG), proteasi, e RNA RNA dipendente polimerasi (RdRp).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

8.6K Views.  University of Heidelberg and the German Cancer Research Center.  Qui, descriviamo un metodo per esprimere e purificare norovirus di alta qualità sporgenti (P) domini in E. coli per l'utilizzo in studi di cristallografia a raggi X. Questo metodo può essere applicato ad altri domini calicivirus P, così come le proteine ​​non-strutturali, cioè., Proteina virale genoma-linked (VPG), proteasi, e RNA RNA dipendente polimerasi (RdRp). 

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Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Ricerca

Biochimica

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Chimica

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

Combinando la cristallografia a raggi x con piccolo angolo x-ray Scattering per modellare le regioni non strutturate di Nsa1 da S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and IKK&#946;. Upon activation, the IKK complex phosphorylates the I&#954;B molecules leading to NF-&#954;B nuclear translocation and activation of target genes. Inhibition of the NEMO/IKK interaction is an attractive therapeutic paradigm for the modulation of NF-&#954;B pathway activity, making NEMO a target for inhibitors design and discovery. To facilitate the process of discovery and optimization of NEMO inhibitors, we engineered an improved construct of the IKK-binding domain of NEMO that would allow for structure determination of the protein in the apo form and while bound to small molecular weight inhibitors. Here, we present the strategy utilized for the design, expression and structural characterization of the IKK-binding domain of NEMO. The protein is expressed in E. coli cells, solubilized under denaturing conditions and purified through three chromatographic steps. We discuss the protocols for obtaining crystals for structure determination and describe data acquisition and analysis strategies. The protocols will find wide applicability to the structure determination of complexes of NEMO and small molecule inhibitors.

We describe protocols for the structure determination of the IKK-binding domain of NEMO by X-ray crystallography. The methods include protein expression, purification and characterization as well as strategies for successful crystal optimization and structure determination of the protein in its unbound form.

Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Bioingegneria

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Immunologia e infezioni

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Imaging del calcio di monostrati di organoidi intestinali umani infetti da virus

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Autore in primo piano: Indagine sull'interruzione virale della segnalazione epiteliale intestinale - Approfondimenti di ricerca e direzioni future 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Produzione di Norovirus umani sporgenti Domini in

Riepilogo

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Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine di membrana

Combinando la cristallografia a raggi x con piccolo angolo x-ray Scattering per modellare le regioni non strutturate di Nsa1 da S. Cerevisiae

Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO

Usando Tomoauto: un protocollo per High-throughput automatizzato Cryo-elettrone Tomografia

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Produzione di Norovirus umani sporgenti Domini in

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Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

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Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO

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Metodi alternativi In Vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale

Quantificare le particelle umane simili al virus Norovirus legandosi ai batteri commensali utilizzando la citometria di flusso

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine di membrana