We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.

1. Fluoreszenzmarkierung von Zellen HINWEIS: Label Glioblastomzelllinien und Mikroglia mit Fluoreszenzfarbstoffen 9. Alternativ erzeugen Zelllinien , die konstitutiv fluoreszierende Proteine wie GFP / RFP ausdrücken , wie in 14 beschrieben. <ol><li> 80% konfluent am Tag der Färbung - Plate Zellen auf einer 6-Well-Platte, so dass sie 70 sein. Für die Maus - Glioblastoma - Zelllinie GL261 und menschliche Glioblastomzelllinie U87, Platte 1 x 10 6 und 1,5 x 10 6 Zellen, die jeweils auf einer 6 cm - Schale 24 Stunden vor der Färbung. </li><li> Bereiten fluoreszierende Zelle Fleck Farbstofflösung in DMSO und mit 5 uM Farbstoff zu Medien, entweder Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) oder Makrophagen-Serum freiem Medium (MSFM), Vortex gut. </li><li> Inkubiere die Zellen mit Farbstoff für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Entfernen Farbstoff enthaltenden Medien und fügen Sie frisches Medium (RPMI oder MSFM) zu den Zellen. </li><li> Inkubiere Zellen für 30 min. Hinweis: Die Zellen sind jetztgebeizt und bereit, in Experiment verwendet werden. </li></ol> 2. Vorbeschichtete Matrix Kammer Cokultur Invasion Assay <ol><li> Differenzieren THP-1 - Zellen unter Verwendung von Phorbolmyristatacetat (PMA) 15. <ol><li> Platte 2 - 3 x 10 5 THP-1 - Zellen in 1,5 ml RPMI / 10% FBS in einer 6 - Well - Kulturplatte. Unmittelbar nach 100 nM PMA bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden hinzufügen Ausplattieren und Inkubieren. HINWEIS: Nach 48 Stunden THP-1-Zellen, die eine Differenzierung erfolgreich durchlaufen haben, werden adhärenten sein und auf eine runde Morphologie auf den Boden des Bohrlochs unter verbreiten. </li><li> Entfernen PMA durch einmal mit 1x PBS gewaschen und ersetzen mit frischem RPMI / 10% FBS. Warten Sie weitere 48 Stunden, bis die Zellen bereit sind, in Assays verwendet werden. </li></ol></li><li> Äquilibrieren Matrix vorbeschichtet Kammern indem sie in einer Vertiefung mit 500 ul Medium allein (kein Serum) Plazieren und Zugabe von 500 &amp; mgr; l Medium allein nach oben. Inkubieren Kammern für 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. <br/&gt; Hinweis: Pre-beschichtete Kammern vom Hersteller bezogen wurden; siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung. </li><li> Um sanft Zellen lösen (fluoreszenzmarkierte Glioblastomzelllinien und die Mikroglia / Makrophagen), entfernen Sie Medien aus Zellen, die durch Aspiration. Wash-Zellen auf Teller mit 2 mM EDTA / PBS. Hinzufügen 500 ul 2 mM EDTA / PBS und Inkubation für 5 - 10 min in einem Zellinkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Die Zellen in 5 ml Medium, enthaltend 0,3% Rinderserumalbumin (BSA). </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 120 x g. </li><li> Absaugen Überstand und Pellet in MSFM / 0,3% BSA Medien (GL261 - Zellen und Mikroglia) oder RPMI / 0,3% BSA (für U87 und THP-1 - Zellen) , so daß die Konzentration der Zellen ist gleich 1 x 10 6 Zellen / ml . Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zellen zu zählen. </li><li> In 500 ul Medium / 0,3% BSA pro Vertiefung von 24-Well-Platte. </li><li> Entfernen Medien von Kammern, die für mindestens 2 Stunden (Schritt 2.2) equilibriert wurden. Platz chambers in gut 500 ul Medium / 0,3% BSA (Schritt 2.7) enthält. </li><li> Wenn Inhibitoren verwendet werden, um ihre Wirkung auf die Makrophagen zu studieren / Mikroglia stimuliert Gliom Invasion, fügen Sie die entsprechende Konzentration sowohl an den unteren und oberen Abschnitte der Kammer. HINWEIS: Die Konzentrationen von CSF-1R eingesetzten Inhibitor vollständig kann 9 in Bezug finden Mikroglia stimuliert GL261 Glioblastom - Invasion zu verhindern. </li><li> In Abhängigkeit von den verwendeten Zelllinien, fügen Sie Zellen in die obere Kammer, wie in den nächsten beiden Schritten beschrieben: Maus Glioblastom (2.10.1) und humanen Glioblastom (2.10.2). <ol><li> Mix 1,5 x 10 5 GL261 (Glioblastom) Zellen (150 &amp; mgr; l) und 5 x 10 4 Maus Mikroglia (50 ul) (siehe Schritt 2.6 für Medien Details). Bringen Volumen auf 500 ul durch Zugabe von 300 &amp; mgr; l MSFM / 0,3% BSA. Hinzufügen Zellmischung in die obere Kammer und inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden. HINWEIS: Murine Mikrogliazellen sind aus neugeborenen Mäusen isoliert, wie ich beschriebenn 1 6. </li></ol></li></ol> Mischungs 7,5 x 10 4 U87 (Glioblastom) Zellen (75 ul) und 2,5 x 10 &amp; sup4 ; THP1 (Makrophagen) Zellen (25 ul). Bringen Volumen in 500 &amp; mgr; l durch Zugabe von 400 &amp; mgr; l RPMI / 0,3% BSA. Fügen Sie das Zellgemisch in die obere Kammer. Inkubiere Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Std. <ol><li> Nach der Inkubation entfernen Zellen von der Oberseite der Kammer, die durch leichtes Ansaugen und fixieren Kammern durch in 3,7% Formaldehyd in PBS platzieren. Erlauben Kammern für 15 min bei Raumtemperatur in Fixativ zu bleiben (oder über Nacht bei 4 ° C). Entfernen Fixiermittel durch leichtes Ansaugen und ersetzen mit 500 ul 1x PBS. Fahren Sie mit Abschnitt 4 für die Bildanalyse. HINWEIS: Experiment kann in 1x PBS in diesem Moment und gespeichert für die Bildgebung pausiert. Fluoreszenzfarbstoff-Signale können für bis zu 2 Wochen nach der Fixierung nachgewiesen werden. </li></ol> 3. Invasion Assay &quot;3D&quot; Embedding Gliom und Makrophagen / Mikroglia in Matrix <ol><li>Thaw Matrix Mischung über Nacht bei 4 ° C. Führen Sie alle weiteren Manipulationen unter Verwendung von Matrix auf Eis in der Haube. </li><li> Herstellung von 10 mg / ml Konzentration von Matrix in Medien (MSFM oder RPMI) mit 0,3% BSA auf Eis. HINWEIS: Auf Konzentration von Matrix ist typischerweise bei etwa 15 mg / ml. </li><li> Zur Herstellung von Zellen (mit der Bezeichnung in Schritt 1) ​​für die Aufhängung in der Matrix, entfernen Sie Medien aus Zellen, die durch Aspiration. Wash-Zellen auf Teller mit 2 mM EDTA / PBS. Hinzufügen 500 ul 2 mM EDTA / PBS zu den Zellen und inkubiere für 5 - 10 min in Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Die Zellen in 5 ml Medium, enthaltend 0,3% BSA. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 120 x g. </li><li> Absaugen Überstand von Pellets. Pellet in Medium / 0,3% BSA , so dass die Konzentration der Zellen auf 1 × 10 6 Zellen / ml entspricht. Verwenden Sie ein Hämozytometer die Zellen zu zählen. </li><li> Hinzufügen 1,5 x 10 5 GL261 - Zellen (in 150 &amp; mgr; l) + 5 × 10 4 Mikroglia - Zellen (in 50 &amp; mgr; l) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie 2 x 10 5 GL261 - Zellen (200 ul) in einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Die GL261-Zellen allein ohne Mikroglia dient als Kontrolle. </li><li> Spin-Zellen in Mikrofuge für 5 min bei 120 x g. </li><li> Die Zellen in 200 ul kalten Matrix auf dem Eis. </li><li> Tafel 50 &amp; mgr; l (50.000 Zellen) auf die Mitte des oberen Abteil von 8 um Porengröße Raumeinsatz. </li><li> bei 37 ° C inkubieren 30 min für die Polymerisation stattfindet. </li><li> Mit 200 &amp; mgr; l serumfreiem Medium in die obere Kammer und 700 &amp; mgr; l Serum, das Zellwachstumsmedium mit dem unteren gut. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 für 48 Stunden. </li><li> Nach der Inkubation entfernen Zellen von der Oberseite der Kammer, die durch leichtes Ansaugen und fixieren Kammern durch in 3,7% Formaldehyd in PBS platzieren. Erlauben Kammern für 15 min bei Raumtemperatur in Fixativ zu bleiben (oder über Nacht bei 4 ° C). Entfernen Fixiermittel durch leichtes Ansaugen und ersetzen mit 500 ul 1x PBS. Fahren Sie mit Abschnitt 4 for Bildanalyse. </li></ol> 4. Imaging-Assays <ol><li> Entfernen Kammern von 3,7% Formaldehyd und waschen in gut frisch 500 ul 1x PBS enthält. HINWEIS: Verwenden Sie Kammern nicht trocknen lassen. </li><li> Mit einem Wattestäbchen reinigen sanft die nicht-invasive Zellen aus dem oberen Teil des Filters (Seite die Innenseite der Kammer zugewandt ist) durch die Filteroberfläche kratzen. Beginnen Sie sanft und erhöhen den Druck nach. Tun Sie dies mindestens 3 mal pro Kammer. </li><li> Legen Kammern entweder in einem Glasbodenschale oder lassen in einer 24-Well-Platte. </li><li> Legen Sie Probe auf der Bühne eines Epifluoreszenz oder konfokalen Laser-Fluoreszenz - Mikroskop mit Kamera und Bildaufnahmesoftware 9,10. </li><li> Nehmen Sie mehrere 10X oder 20X Bilder von repräsentativen Bereichen. </li><li> Verwendung einer Bildanalysesoftware, wie ImageJ, zählen die Anzahl der Glioblastom - Zellen , die den Filter an der Unterseite 9,10 überschritten haben. </li><li> Wenn die Abbildung der &quot;3D. &quot;Invasionstest (beschrieben in Abschnitt 3), eine Z - Stack Serie erzeugen ein fluoreszierendes Laser konfokalen Mikroskop 5-6 Verwendung Um das Bild der invasiven Zellpopulation an der Unterseite des Filters, folgen Sie dem Protokoll die Schritte 4,2-4,6 oben beschrieben. </li></ol>

<ol>
	<li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+tumors.">Central nervous system tumors.</a> Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).</li><li>Furnari, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+astrocytic+glioma:+genetics,+biology,+and+paths+to+treatment.">Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.</a> Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).</li><li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+microenvironment.">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. 60 (3), 502-514 (2012).</li><li>Li, W., Graeber, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+profile+of+microglia+under+the+influence+of+glioma.">The molecular profile of microglia under the influence of glioma.</a> Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).</li><li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+function+in+brain+tumors.">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li><li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophages+promote+glioma+progression.">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li><li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+promote+glioma+migration.">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li><li>Wesolowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-derived+TGF-beta+as+an+important+regulator+of+glioblastoma+invasion:+an+inhibition+of+TGF-beta-dependent+effects+by+shRNA+against+human+TGF-beta+type+II+receptor.">Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor.</a> Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).</li><li>Coniglio, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+stimulation+of+glioblastoma+invasion+involves+epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+and+colony+stimulating+factor+1+receptor+(CSF-1R)+signaling.">Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling.</a> Mol Med. 18, 519-527 (2012).</li><li>Miller, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semapimod+sensitizes+glioblastoma+tumors+to+ionizing+radiation+by+targeting+microglia.">Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li><li>Goswami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+promote+the+invasion+of+breast+carcinoma+cells+via+a+colony-stimulating+factor-1/epidermal+growth+factor+paracrine+loop.">Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop.</a> Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).</li><li>House, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+functional+S100A4+monomers+are+necessary+for+regulating+nonmuscle+myosin-IIA+and+HCT116+cell+invasion.">Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion.</a> Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activity+status+of+cofilin+is+directly+related+to+invasion,+intravasation,+and+metastasis+of+mammary+tumors.">The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors.</a> J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).</li><li>Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+immunohistochemistry+as+a+novel+experimental+tool+for+the+detection+of+glioma+cell+invasion+in+vivo.">Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo.</a> Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).</li><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Dobrenis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+cell+culture+and+in+transplantation+therapy+for+central+nervous+system+disease.">Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease.</a> Methods. 16 (3), 320-344 (1998).</li><li>Coniglio, S. J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+microglia+stimulated+glioblastoma+invasion.">Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion.</a> Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).</li><li>See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+regulatory+T+cells+and+microglia+in+glioblastoma-associated+immunosuppression.">The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression.</a> J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die hoch invasive Art von hoher Astrozytomen und Glioblastomen machen diese Hirntumoren sehr tödlich. Es ist daher von größter Wichtigkeit, die molekularen und zellulären Mechanismen der Glioblastom-Invasion zu verstehen. Es wurde viel über den Prozess der Glioblastom - Invasion bereits gelernt , 17. Unter Verwendung der Testformate in diesem Dokument detailliert, unser Labor hat in Maus und Mensch-Modelle gezeigt, die damit verbundenen Tumor Makrophagen Gliom Zellinvasion durch 5 stimulieren - das 10-fa...

Glioblastoma multiforme ist eine aggressive menschliche Gehirn Krebs mit einer medianen Überlebenszeit von ca. 12 Monaten ab dem Zeitpunkt der Diagnose 1,2. Das Glioblastom ist eine der tödlichsten und klinisch herausfordernden Krebserkrankungen, wie es zu einer Standard-Chemotherapie und chirurgische Resektion resistent ist. Die diffuse Natur des Glioblastoms ermöglicht es Tumorzellen während der gesamten normalen Gehirn so dass die fortgeschrittenen Tumor praktisch unmöglich, chirurgisch reseziert vollständig zu verbreiten. Diese hochinvasive Aspekt ist ein Markenzeichen Merkmal von Glioblastomen und anderen fortgeschrittenen Astrozytome. Daher hat sich der Schwerpunkt von viel Forschung war auf dem molekularen Mechanismus der Glioblastomzellinvasion. Das Glioblastom Tumor - Mikroumgebung spielt eine wichtige Rolle bei der Malignität Festlegung 3-6. Tumor - assoziierte Makrophagen / Mikroglia wurden für die Förderung von Glioblastom - Invasion 7,8 verantwortlich sein gezeigt. Die meisten dieser Studien gemessen jedoch die Wirkung von Makrophagen / Mikroglia VerwendungAssays, die physisch von den Glioblastomzellen zu trennen. Unser Labor hat sich vorgenommen, verbesserte Tests zu erzeugen, die es uns erlauben, zu untersuchen, wie Glioblastom-Invasion auf Makrophagen / Mikroglia in Co-Kulturen abhängig ist und es uns ermöglichen, die dem Bild mit der physischen Interaktion zwischen ihnen während Invasion. Klassische Assays Zellinvasion sind die &quot;Standard&quot; Boyden-Kammer-Chemotaxis und Chemoinvasion Formate zu messen. Hier werden die Zellen untersucht werden sollen, werden in einer Kunststoffkammer plattiert, die ein Polycarbonat-Filter auf der Unterseite enthält, die Poren einer bestimmten Größe (in der Regel zwischen 0,4 und 8 um im Durchmesser) aufweist. Der Prozess der Zellinvasion beinhaltet eine physikalische Barriere, in der Regel von extrazellulärem Matrix-Protein zusammengesetzt ist. In der Chemoinvasion Assay verwendet die bevorzugte Matrix ist Matrigel (nachstehend als &quot;Matrix&quot;), eine extrazelluläre Matrixmischung Protein sezerniert von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) -Zellen der Maus Sarkom und besteht weitgehend aus colLag Typ IV und Laminin. Die Kammern werden dann in einer Gewebekulturvertiefung gelegt, die mit oder ohne Wachstumsfaktoren Zellkulturmedien enthält, die im Verdacht stehen, Invasion zu stimulieren. Zellen, die eine höhere invasive Kapazität haben wird bei einer höheren Frequenz durch die extrazelluläre Matrix beschichtete Filter einzudringen und an der Unterseite des Filters anhaften. Wir haben diesen Test modifiziert, um die Rolle der Mikroglia und Tumor-assoziierten Makrophagen auf Glioblastomzellinvasion zu beurteilen. Wir konnten in diesem Papier beschrieben unter Verwendung von Co - Kultur - Assays zu bestimmen , der die Mikroglia die Invasion von zwei Glioblastomzelllinien stimulieren kann von 5 bis 10 - fach 9,10. Dies spiegelt wider, was in Tiermodellen von Glioblastom beobachtet wird. Ferner entwickelten wir eine dreidimensionale Invasionsassay, wo die Wechselwirkungen zwischen Glioblastom-Zellen und Makrophagen / Mikroglia mehr direkt untersucht werden können. Das Ausmaß der Glioblastomzellinvasion durch macropha stimuliertges / Mikroglia im 3D-Test ist vergleichbar, was die Matrix beschichtete Kammer Ansatz gesehen verwendet. Ähnliche Tests wurden bisher entwickelten während Invasion 11-13 Mammakarzinoms Interaktionen mit Makrophagen zu untersuchen. Beide Methoden in diesem Dokument beschrieben werden, sollten in der Fähigkeit unterstützen, den molekularen Mechanismus (e) von Makrophagen / Mikroglia-stimulierten Invasion von Glioblastomzellen zu sezieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning/Fisher Scientific</td>
			<td>Cat: 354481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12065-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red CMTPX Dye</td>
			<td>Life Technologies/Molecular Probes</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA Dye</td>
			<td>Life Technologies/Molecular Probes</td>
			<td>C2925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL261 cell line</td>
			<td>National Cancer Institute (NCI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U87 cell line</td>
			<td>American Tissue Type Culture Collection</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP-1 cell line</td>
			<td>American Tissue Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (500 ml)</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 &#181;M pore) 48 per pack.</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3445-005-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Cat: 10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture assays to study macrophage and microglia stimulation of glioblastoma invasion

Glioblastoma multiforme (Grad IV Gliom) ist eine sehr aggressive Krebs beim Menschen mit einem medianen Überleben von 1 Jahr nach der Diagnose. Trotz der erhöhten Verständnis der molekularen Ereignisse, die Anlass zu Glioblastomen geben, bleibt dieser Krebs immer noch sehr resistent gegen herkömmliche Behandlung. Die chirurgische Resektion von hochgradigen Hirntumoren ist selten vollständig aufgrund der stark infiltrative Art von Glioblastomzellen. Therapeutische Ansätze, die daher Glioblastomzellinvasion zu dämpfen ist eine attraktive Option. Unser Labor und andere haben gezeigt, dass Tumor-assoziierten Makrophagen und Mikroglia (resident Gehirn Makrophagen) gezeigt stark Glioblastom-Invasion zu stimulieren. Das Protokoll in diesem Dokument beschrieben wird , verwendet Glioblastom-Makrophagen / Mikroglia Interaktion zu modellieren mit in - vitro - Kultur - Assays. Dieser Ansatz kann die Entwicklung und / oder Entdeckung von Medikamenten erheblich erleichtern, die die Kommunikation mit den Makrophagen zu stören, dass diese bösartige behav ermöglichtIOR. Wir haben zwei robuste Kokultur Invasionsassays eingesetzt, wo eine Mikroglia / Makrophagen Gliom Zellinvasion durch 5 stimulieren - das 10-fache. Glioblastoma-Zellen mit einem fluoreszierenden Marker markiert oder konstitutiv ein fluoreszierendes Protein exprimieren, werden ohne und mit Makrophagen / Mikroglia auf matrix-beschichteten Polycarbonat Kammer Einsätze überzogen oder in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet. Zellinvasion durch Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie Bild bewertet und nur invasive Zellen auf der Unterseite des Filter zählen. Unter Verwendung dieser Assays mehrere pharmakologische Inhibitoren (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib und Semapimod) identifiziert wurden, die Makrophagen blockieren / stimuliert Mikroglia Glioblastom-Invasion.

Mit den Methoden, die hier skizziert haben wir gezeigt, dass Mikroglia und Makrophagen im Wesentlichen Glioblastomzellinvasion stimulieren kann. Zwei verschiedene Invasionsassays eingesetzt werden und sind in Abbildung 1 dargestellt. In 2 GL261 - Zellen , die konstitutiv das fluoreszierende Protein exprimieren mCherry ausplattiert wurden auf vorbeschichteten Kammern mit und ohne Mikroglia für 48 Stunden. GL261-Zellen wurden minimal invasive auf ihre eig...

Watch this Scientific Journal Video about Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion at JoVE.com

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

coculture-assays-to-study-macrophage-microglia-stimulation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

13.9K Aufrufe.  Kean University. Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

Serie: Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

Azelluläre und zellulären Lunge Modell Tumor Metastasen zu studieren

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Forschung

Krebsforschung

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% with current standard of care. Tumors often recur within 9 months following initial surgery, radiation and chemotherapy, at which point treatment options become limited. This highlights the pressing need for the development of better therapeutics to prolong survival and increase the quality of life for these patients.
Tumor Treating Fields (TTFields) therapy was developed to take advantage of the effect of low frequency alternating electrical fields on cells for cancer therapy. TTFields have been demonstrated to disrupt cells during mitosis and slow tumor growth. There is also growing evidence that they act through stimulating immune responses within exposed tumors. The advantages of TTFields therapy include its noninvasive approach and increased quality of life compared to other treatment modalities such as cytotoxic chemotherapies. The Food and Drug Administration approved TTFields therapy for the treatment of recurrent glioblastoma in 2011 and for newly diagnosed glioblastoma in 2015. We report on the effects of TTFields during mitosis, the results of electric fields modeling, and proper transducer array placement. Our protocol outlines the clinical application of TTFields on a patient post-surgery, using the second-generation device.

Glioblastoma is the most common and aggressive primary brain malignancy in adults, with most tumors recurring after initial treatment. Tumor Treating Fields (TTFields) therapy is the newest treatment modality for glioblastoma. Here, we describe the proper application of TTFields-transducer arrays on patients and discuss theory and aspects of treatment.

Die klinische Anwendung des Tumors, die Behandlung von Feldern Therapie bei Glioblastom

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions contribute to tissue architectural changes observed during tumorigenesis remains challenging due to the lack of appropriate models. In this protocol, we describe the generation of a 3D coculture model using a LUSC primary cell culture known as TUM622. TUM622 cells were established from a LUSC patient-derived xenograft (PDX) and have the unique property to form acinar-like structures when seeded in a basement membrane matrix. We demonstrate that TUM622 acini in 3D coculture recapitulate key features of tissue architecture during LUSC progression as well as the dynamic interactions between LUSC cells and components of the tumor microenvironment (TME), including the extracellular matrix (ECM) and cancer-associated fibroblasts (CAFs). We further adapt our principal 3D culturing protocol to demonstrate how this system could be utilized for various downstream analyses. Overall, this organoid model creates a biologically rich and adaptable platform that enables one to gain insight into the cell-intrinsic and extrinsic mechanisms that promote the disruption of epithelial architectures during carcinoma progression and will aid the search for new therapeutic targets and diagnostic markers.

An in vitro model system was developed to capture tissue architectural changes during lung squamous carcinoma (LUSC) progression in a 3-dimensional (3D) co-culture with cancer-associated fibroblasts (CAFs). This organoid system provides a unique platform to investigate the roles of diverse tumor cell-intrinsic and extrinsic changes that modulate the tumor phenotype.

Multidimensionales Cokultursystem zur Modellierung der Fortschreitender Karzinomprogression der Lunge

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These acquired abnormalities in complex, multilayered molecular signaling networks induce aberrant cell proliferation and survival, extracellular matrix degradation, and metastasis to distant organs. Approximately 90% of cancer-related deaths are estimated to be caused by the direct or indirect effects of metastatic dissemination. Therefore, it is important to establish a highly reliable, comprehensive system to characterize cancer cell behaviors upon genetic and environmental manipulations. Such a system can give a clear understanding of the molecular regulation of cancer metastasis and the opportunity for successful development of stratified, precise therapeutic strategies. Hence, accurate determination of cancer cell behaviors such as migration and invasion with gain or loss of function of gene(s) allows assessment of the aggressive nature of cancer cells. The real-time measurement system based on cell impedance enables researchers to continually acquire data during a whole experiment and instantly compare and quantify the results under various experimental conditions. Unlike conventional methods, this method does not require fixation, staining, and sample processing to analyze cells that migrate or invade. This method paper emphasizes detailed procedures for real-time determination of migration and invasion of glioblastoma cancer cells.

Cancer is a lethal disease due to its ability to metastasize to different organs. Determining the ability of cancer cells to migrate and invade under various treatment conditions is crucial to assessing therapeutic strategies. This protocol presents a method to assess the real-time metastatic abilities of a glioblastoma cancer cell line.&#160;

Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite significant advances in the genetics of these tumors, how GBM cells invade the healthy brain parenchyma is not well understood. Notably, it has been shown that GBM cells invade the peritumoral space via different routes; the main interest of this paper is the route along white matter tracts (WMTs). The interactions of tumor cells with the peritumoral nervous cell components are not well characterized. Herein, a method has been described that evaluates the impact of neurons on GBM cell invasion. This paper presents an advanced co-culture in vitro assay that mimics WMT invasion by analyzing the migration of GBM stem-like cells on neurons. The behavior of GBM cells in the presence of neurons is monitored by using an automated tracking procedure with open-source and free-access software. This method is useful for many applications, in particular, for functional and mechanistic studies as well as for analyzing the effects of pharmacological agents that can block GBM cell migration on neurons.

Here, we present an easy-to-use co-culture assay to analyze glioblastoma (GBM) migration on patterned neurons. We developed a macro in FiJi software for easy quantification of GBM cell migration on neurons, and observed that neurons modify GBM cell invasive capacity.

Co-Kultur von Glioblastom-Stammzellen auf gemusterten Neuronen zur Untersuchung von Migration und zellulären Interaktionen

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

The major cause of cancer-related deaths is metastasis formation (i.e., when cancer cells spread from the primary tumor to distant organs and form secondary tumors). Delamination, defined as the degradation of the basal lamina and basement membrane, is the initial process that facilitates the transmigration and spread of cancer cells to other tissues and organs. Scoring the delamination capacity of cancer cells would indicate the metastatic potential of these cells.
We have developed a standardized method, the ex ovo CAM-Delam assay, to visualize and quantify the ability of cancer cells to delaminate and invade, thereby being able to assess metastatic aggressiveness. Briefly, the CAM-Delam method includes seeding cancer cells in silicone rings on the chick chorioallantoic membrane (CAM) at embryonic day 10, followed by incubation from hours to a few days. The CAM-Delam assay includes the use of an internal humidified chamber during chick embryo incubation. This novel approach increased embryo survival from 10%-50% to 80%-90%, which resolved previous technical problems with low embryo survival rates in different CAM assays.
Next, the CAM samples with associated cancer cell clusters were isolated, fixed, and frozen. Finally, cryostat-sectioned samples were visualized and analyzed for basement membrane damage and cancer cell invasion using immunohistochemistry. By evaluating various known metastatic and non-metastatic cancer cell lines designed to express green fluorescent protein (GFP), the CAM-Delam quantitative results showed that the delamination capacity patterns reflect metastatic aggressiveness and can be scored into four categories. Future use of this assay, apart from quantifying delamination capacity as an indication of metastatic aggressiveness, is to unravel the molecular mechanisms that control delamination, invasion, the formation of micrometastases, and changes in the tumor microenvironment.

The CAM-Delam assay to evaluate the metastatic capacity of cancer cells is relatively fast, easy, and cheap. The method can be used for unraveling the molecular mechanisms regulating metastasis formation and for drug screening. An optimized assay for analyzing human tumor samples could be a clinical method for personalized cancer treatment.