Diese Transwell-Co-Kultur-Methode wird verwendet, um Parakrin-Signalisierung von Tumorzellen verwendet, um die Immunantwort zu unterdrücken. Diese Methode kann verwendet werden, um neue sezernierte Liganden zu entdecken, sowie die mechanistischen Grundlagen ihrer immunsuppressiven Wirkung. Wir haben diese Methode bereits verwendet, um zu zeigen, wie tumorsekretierte Faktoren die makrophagenpro-inflammatorische Gentranskription dämpfen können.
Wir glauben, dass dieses Tool weitreichende Implikationen in der Studie der tumorabgeleiteten Immunsuppression hat. Einer der Hauptvorteile dieser Technik ist, dass es verwendet werden kann, um parakrine Signalisierung zwischen Tumorzellen und Immunzellen zu studieren, ohne die potenziell verwirrende Variable des Zell-zu-Zell-Kontakts. Diese Plattform ist auch für eine Vielzahl molekularbiologischer Verfahren für nachgelagerte Analysen zugänglich.
Nach der Ernte peritonealmakrophagen, platte sie direkt in die oberen Kammern einer 0,4 Mikrometer Polyestermembran einfügen Co-Kultur Sechs-Well-Platte. Dann hinzugefügt dmEM hinzugefügt, um den Brunnen so, dass die obere Kammer enthält einen Milliliter und die untere Kammer enthält 1,5 Milliliter. Drei Tage bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren.
Erstens, Kultur kommerziell erhältlich Tumorzellen in ihrem jeweiligen Medium, nach ATCC empfohlen Gewebekultur Methoden. Als nächstes waschen Sie die anhaftenden Tumorzellen einmal mit PBS. Fügen Sie 0,05% Trypsin in EDTA hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius, bis sich die Zellen lösen.
Setzen Sie dann die Zellen in Medien, die FBS enthalten, erneut aus. Verwenden Sie ein Hämozytometer oder einen Zellzähler, um die Gesamtzahl der Zellen und Zentrifugen bei 220 mal G für fünf Minuten zu quantifizieren. Während der Zentrifugation das Medium aus den oberen und unteren Kammern des Makrophagens ansaugen, das durchlässige Membranträgerplatten enthält, und durch frisches Medium ersetzen.
Für die unteren Kammern, in denen Tumorzellen plattiert werden, füllen Sie mit einem Milliliter Medium statt 1,5 Milliliter, um genügend Volumen für die Zellzugabe zu hinterlassen. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, saugen Sie das Medium aus den pelletierten Tumorzellen und setzen Sie die Zellen in ergänztem DMEM mit einer Konzentration von 300.000 Zellen pro Milliliter wieder auf. Fügen Sie 0,5 Milliliter dieser Zellsuspension in die untere Kammer der gewünschten Brunnen.
Um die pro-inflammatorische Genexpression von Makrophagen zu induzieren, behandeln Sie singly oder co-cultured Makrophagen, indem Sie Interferon-Gamma in einer Konzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter und LPS in einer Konzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter hinzufügen. Variieren Sie die Dauer der Behandlungszeiten in der Kultur nach Bedarf. Die Makrophagenaktivierung erfolgt innerhalb von zwei Stunden, und einige tumorvermittelte Unterdrückung erfolgt um acht Stunden.
Die Co-Kultur für 24 Stunden führt zu einer robusten und konsistenten Tumorunterdrückung. Als negativer Kontrolle, Kultur Makrophagen singly und lassen unbehandelt. Behandeln Sie als positiv zu behandelnde, singly-cultured Makrophagen mit Interferon-Gamma und LPS in den gleichen Konzentrationen, die für die Proben verwendet werden.
Nachdem die gewünschte Inkubationszeit abgelaufen ist, isolieren Sie je nach Testbedarf das Zelllysat- oder Konditionskulturmedium nach Belieben. Um das Zelllysat für die quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse zu isolieren, saugen Sie das Medium aus beiden Kammern des Brunnens an und waschen Sie einmal mit zwei MilliliterPBS. Tragen Sie den RNA-Lysepuffer auf die obere Kammer auf, die die Makrophagen enthält.
Danach kratzen Sie die Membran vorsichtig, um das Zelllysat freizusetzen, und übertragen Sie es zur Weiterverarbeitung gemäß dem Herstellerprotokoll des RNA-Isolationskits in ein Sammelrohr. Die hier beschriebene Co-Kultur-Methode beinhaltet die Kultur von Makrophagen und Tumorzellen ohne physischen Kontakt. Peritoneale Makrophagen, die in Abwesenheit von Tumorzellen kultiviert werden, werden als negative und positive Kontrollen verwendet.
Peritoneale Makrophagen, die in Gegenwart von B16F10-Tumorzellen mitkultiviert werden, aber ohne aktivierungsstarke Reize die Expression von pro-inflammatorischen assoziierten Genen nicht erhöhen. Dies impliziert, dass tumorsekrete Liganden entweder nicht ausreichen, um die pro-inflammatorische Genexpression selbst zu induzieren, oder wenn es eine Immunaktivierung durch Tumorsekrete gibt, sind parakrine Liganden ausreichend, um sie auf ihre nativen Ebenen zu unterdrücken. Diese Co-Kultur-Methode veranschaulicht, dass, wenn Makrophagen, die durch Interferon-Gamma und LPS polarisiert werden, in Gegenwart von Tumorzellen kultiviert werden, die Unterdrückung der entzündungsassoziierten Genexpression um bis zu 60% reduziert wurde Ein vergleichbares Niveau der Makrophagen-Pro-Entzündlichen Gensuppression wird beobachtet, wenn die murine Makrophagenzelllinie J774 durch peritoneale Makrophagen ersetzt wird.
Frühere Arbeiten haben Protein S als tumorsekretierten Faktor identifiziert, der die Makrophagenaktivierung hemmen kann, so dass das durchlässige Membranunterstützungs-Cokulturmodell in Verbindung mit einem LysA verwendet wird, um die Konzentration von Protein S in konditionierten Medien nach 24 Stunden zu assieren. In konditionierten Medien aus Interferongamma- und LPS-behandelten B16F10-Melanomzellen wird Protein S in einer Konzentration von etwa 475 Nanogramm pro Milliliter exprimiert. Peritoneale Makrophagen, die unter den gleichen Bedingungen behandelt wurden, exprimierte das Protein S mit etwa 61 Nanogramm pro Milliliter.
Interessanterweise betrug die Konzentration von Protein S im Interferon-Gamma und im LPS-behandelten Brunnen bei einer Kokulturierung etwa 86 Nanogramm pro Milliliter. Dies deutet darauf hin, dass entweder Makrophagen tumorsekretiertes Protein S aufnehmen oder dass die Menge an Protein S, das von B16F10-Zellen abgesondert wird, in Gegenwart von Makrophagen erheblich verringert wird. Diese Ergebnisse zeigen tiefgreifende Veränderungen der Makrophagenaktivierung und parakrinen Signalisierung, wenn Makrophagen mit Tumorzellen kokultiviert werden.
Die Transwell Co-Culture-Methode kann eine Vielzahl von Fragen im Zusammenhang mit Parakrin-Signalisierung beantworten. Western Blot Analyse könnte durchgeführt werden, um zu bestimmen, wie tumor-sezernierte Proteine verschiedene Signalwege in Makrophagen verändern.
