Tumorassoziierte Makrophagen spielen eine wichtige Rolle in der Tumormikroumgebung. Verstehen, wie unterschiedliche genetische Mutationen in den Tumorzellen die Rekrutierung von Makrophagen beeinflussen, ist entscheidend für die Entwicklung einer personalisierten Behandlung für Krebspatienten. Dieser Assay bietet eine einfache und robuste Möglichkeit, die Wechselwirkung zwischen Tumorzellen und Makrophagen in vitro zu bewerten.
Dieser Test kann modifiziert werden, um die Wechselwirkungen zwischen den Tumorzellen und anderen Immunzellen in vitro zu bewerten. Um dieses Verfahren zu beginnen, erwärmen Sie das serumfreie Stammzellmedium, indem Sie es 20 Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius legen. Sprühen Sie die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie die besprühte Oberfläche mit Papiertüchern ab.
Als nächstes die Flaschen der Medium- und Zellablösungslösung mit 70% Ethanol besprühen und mit Papiertüchern abwischen. Übertragen Sie die gereinigten Flaschen in die Gewebekulturhaube. Holen Sie die Tumorzelle ab und übertragen Sie sie in die Gewebekulturhaube.
Das Medium ansaugen und die Zellen mit 10 MilliliterPBS waschen. Fügen Sie dann zwei Milliliter Zellablösung in den Kolben. Stellen Sie den Kolben in die Kapuze und überprüfen Sie jede Minute, ob die Tumorzellen aufgerundet sind.
Sobald sich die Tumorzellen aufrunden, tippen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um den Zellen zu helfen, sich zu lösen. Danach pipette acht Milliliter serumfreies Zellmedium in den Kolben und Pipette auf und ab dreimal zu mischen. Diese Zellsuspension bei 200 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge geben.
Aspirieren Sie den Überstand. Dann waschen Sie die Zellen in 10 Milliliter PBS, um sicherzustellen, dass Pipette auf und ab drei bis fünf Mal zu mischen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in 10 Milliliter serumfreies Medium. Pipette auf und ab drei bis fünf Mal zu mischen. Mischen Sie 10 Mikroliter dieser Zellsuspension mit 10 Mikroliter Trypan Blue Lösung.
Nächste Pipette 10 Mikroliter der Trypan Blue und Zellmischung in einem Zählschlitten, und verwenden Sie einen automatischen Zellzähler, um die lebende Zellzahl zu quantifizieren. Verwenden Sie das serumfreie Zellmedium, um die Zelldichte auf 2,5-mal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter anzupassen. Dann säen Sie zwei Milliliter der Zellen in jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Kulturplatte.
Gleichzeitig sechs Brunnen mit nur zwei Milliliters serumfreiem Stammzellmedium zubereiten. Danach die Sechs-Brunnen-Platten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubieren. Sprühen Sie zunächst die Gewebekultur-Kapuzenoberfläche mit 70% Ethanol und wischen Sie die besprühte Oberfläche mit Papiertüchern ab.
Als nächstes die Flaschen der Medium- und Zellablösungslösung mit 70% Ethanol besprühen und mit Papiertüchern abwischen. Übertragen Sie die gereinigten Flaschen in die Gewebekulturhaube. Danach holen Sie die Sechs-Well-Platten aus dem Inkubator.
Die konditionierten Medien vorsichtig in 15 Milliliter sterile Zentrifugenrohre zerlegen und die Rohre auf Eis legen. Fügen Sie 0,5 Milliliter Zellablösung in jeden Brunnen der Sechs-Brunnen-Platten, und überprüfen Sie jede Minute, ob die Tumorzellen aufgerundet haben. Sobald sich die Tumorzellen aufrunden, tippen Sie vorsichtig auf die Seite der Platte, um die Zellen zu lösen.
Nächste Pipette 2,5 Milliliter Tumorzellerhaltung semedium in den Brunnen und Pipette auf und ab dreimal zu mischen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 Milliliter steriles Zentrifugenrohr. Mischen Sie 10 Mikroliter Zellen mit 10 Mikroliter Trypan Blue Lösung, und übertragen Sie 10 Mikroliter dieser Mischung in den Zählschlitten.
Verwenden Sie einen automatischen Zellzähler, um die Anzahl der lebenden Zellen zu quantifizieren, und verwenden Sie das serumfreie Stammzellmedium, das über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert wurde, um die Lautstärke der konditionierten Medien an die Zellzahl anzupassen. Filtern Sie die konditionierten Medien durch 0,45 Mikrometer-Filter und legen Sie die konditionierten Medien auf Eis. Zunächst das IMDM-Medium in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten aufwärmen.
Reinigen Sie die Gewebekulturhaube mit 70% Ethanol und reinigen Sie die Flasche des Mediums und transportieren Sie sie wie zuvor beschrieben in die Haube. Als nächstes übertragen Sie den Kolben der MV-4-11-Zellen in die Haube. Pipette 10 Milliliter Zellen in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr.
Verwenden Sie Trypan Blue und einen automatischen Zellenzähler, um die Anzahl der lebenden Zellen wie zuvor beschrieben zu quantifizieren. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter PBS.
Zentrifugieren Sie wieder bei 200 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in IMDM Medium bei einer endgültigen Zelldichte von einer Million Zellen pro Milliliter wieder aus. Bringen Sie zuerst die notwendigen Materialien auf Raumtemperatur.
Fügen Sie 250 Mikroliter der vorbereiteten MV-4-11-Zellen zu jedem Einsatz hinzu. Als nächstes fügen Sie 400 Mikroliter entweder des konditionierten Mediums oder Mediums nur zu den unteren Kammern der 24-Well-Platte hinzu, um sicherzustellen, dass die Proben in dreifacher Ausfertigung hinzugefügt werden. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für vier Stunden inkubieren.
Tippen Sie dann vorsichtig auf den Einsatz an der Innenwand desselben Brunnens und entsorgen Sie den Einsatz. Die Zellen in den Brunnen drei mal sanft nach oben und unten pipette, um sie zu mischen. Übertragen Sie 225 Mikroliter dieser Zellsuspension in die Brunnen einer schwarzwandigen 96-Well-Platte, die für die Fluoreszenzmessung geeignet ist.
Anschließend den CyQUANT-Farbstoff mit 4x Lysepuffer im Verhältnis eins zu 75 verdünnen. Wirbel kurz und drehen Sie die Lösung. Übertragen Sie 75 Mikroliter dieser Lösung auf jeden Brunnen der 96-Well-Platte und brüten bei Raumtemperatur für 15 Minuten.
Lesen Sie mit einem Fluoreszenzplattenleser die Fluoreszenz und analysieren Sie die im Textprotokoll beschriebenen Daten. In dieser Studie wird ein In-vitro-Assay verwendet, um die Tumormakrophagen-Wechselwirkung zu untersuchen. Proben mit hohen Fluoreszenzwerten deuten darauf hin, dass die konditionierten Medien eine hohe Kapazität zur Rekrutierung von Makrophagen haben.
Je nach experimentellem Bedarf können zusätzliche Kontrollen einbezogen werden. Zum Beispiel kann man neutralisierende Antikörper verwenden, um die konditionierten Medien zu behandeln, um die Makrophagen-Chemotaxis abzuschaffen und die gleiche Weise durchzuführen. Man kann auch zusätzliche Chemokine zu den konditionierten Medien hinzufügen, die als positive Kontrolle dienen.
Es ist wichtig, Zellzahlenunterschiede für diesen Test zu steuern, da verschiedene Zelltypen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wachsen können. In vivo Bestätigung der In-vitro-Ergebnisse sind entscheidend. Man kann Tumorzellen in Mäuse injizieren und die Tumoren mit Durchflusszytometrie, Immunostainierung und CyTOF analysieren, um die Ergebnisse zu bestätigen.
