We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).

1. Polymer und Agarose Vorbereitung Hinweis: Handschuhe und Laborkittel sollte während dieses Protokoll jederzeit getragen werden. Schutzbrille sind ebenfalls bei der Arbeit mit einem beliebigen organischen Lösungsmittel oder einem Schritt mit möglichen Spritzwasser erforderlich. <ol><li> Eine 5 mg / ml Lösung von Polymer in Chloroform. 1 ml Chloroform und 5 mg festes Poly (ethylenoxid) - b- Poly (butadien) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) Diblockcopolymer in einem Glasfläschchen und Drall vollständig aufzulösen. Führen Sie alle Schritte Chloroform in einer chemischen Abzugshaube verwenden. </li><li> Mischen in einem fluoreszenzmarkierten Lipids (erworben bereits in Chloroform gelöst) in einem 0,5 Mol-% Endkonzentration in 99,5 mol% unmarkiertem Polymer. <ol><li> Beispielsweise Pipetten ~ 12 &amp; mgr; l einer 1 mg / ml fluoreszenzmarkierten Lipids in Chloroform in 997,58 ul PEO-PBD, EO 22 -BD 37 Polymer in Chloroform (mit einem Molekulargewicht von 2.950 Daltons) für eine Endkonzentration von 0.5 Mol-% markiertes Lipid gemischt und 99,5 mol% Polymer. </li><li> Store-Lösung in einer luftdichten Phiole mit einem Chloroform beständigen Deckel bei -20 ° C. Wickeln Sie Klempner Band auf dem Fläschchen Rand, wo die Deckelschrauben auf das Fläschchen und sichern Sie den Deckel auf dem Fläschchen. Wickeln ein weiteres Stück plumbers Band auf der Außenseite des Deckels und schließlich wickeln Parafilm auf der Außenseite des Bandes minimal Verdampfung zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Machen Sie eine 1% w / v Agarose-Lösung von in 50 ml Wasser 0,5 mg Standard-Agarose-Mischung (oder 50 ml 100 mM Saccharose) in einem 250 ml Erlenmeyerkolben. Kochen Sie die Agarose-Lösung in einem Standard-Mikrowelle für ca. 1 min (oder bis zur vollständigen Auflösung, wie durch die Räumung der Lösung angegeben). Anmerkung: Die Agarose-Lösung kann nach wenigen Minuten der Abkühlung verwendet werden oder erstarren gelassen, gespeichert und erneut geschmolzen, um die gleiche Prozedur. </li></ol> 2. Agarose Film Vorbereitung <ol><li> Schneiden Sie das Ende aus einer 1000 ul Pipettenspitze zu einer Verstopfung zu verhindern. Mit Hilfe der Schnitt Spitze, Pipette 300 &amp; mgr; l geschmolzener Agarose Lösung auf eine 25 mm im Quadrat Deckglas direkt vom Hersteller. </li><li> Lassen die Agarose abkühlen zu ~ 65-75 ° C vor der Abscheidung. Wenn die Agarose zu kühl ist, wird sie beginnen an der Oberfläche während des Streuprozesses zum Verklumpen. Umgekehrt, wenn die Agarose zu heiß ist, wird es verbreitet erfordern die Agarose zu der Oberfläche zu haften. </li><li> Halten Sie nur den Rand des Deckglases mit behandschuhten Fingern und verwenden Sie die lange Kante eines anderen 1000 ul Pipettenspitze die Agarose gleichmäßig über die Oberfläche des Deckglases zu verbreiten. Bewegen Sie die Pipettenspitze hin und her über das Deckglas, bis die Agarose vollständig haftet und deckt das Deckglas. </li><li> Legen Sie die Agarose-beschichtete Deckglas auf ein Stück Parafilm mit der Agarose nach oben zeigt. Sobald die gewünschte Anzahl von Deckgläser beschichtet sind, legen Sie den Parafilm mit den Deckgläschen in einer 37 C-Inkubator ° der Agarose auf die Oberfläche für mindestens 1 h zu dehydratisieren. Hinweis: Dehydrationwird durch das Verschwinden der sichtbaren Schicht aus Agarose bestimmt; das Deckglas flach aussehen und klar sollte. Sobald die Filme vollständig dehydriert sind, Deckgläser Speicher mit der Agarose-Oberfläche in einem Einweg-Kunststoff-Petrischale nach oben zeigt. </li></ol> 3. Polymerfilmbildung <ol><li> Pipette 30 ul hergestellten Polymerlösung auf dem Agarose-Film. </li><li> Halten Sie nur den Rand des Deckglases mit behandschuhten Fingern und verwenden Sie die lange Kante einer 18 G-Nadel, die Lösung für die Agarose-Filme zu verbreiten eine kreisförmige Ausbreitung Bewegung. Weiter verbreitet, bis die Lösung verdampft wird. Hinweis: Seien Sie der scharfen Ende der Nadel vorsichtig. </li><li> Platzieren Sie die Polymerfilme in einer Kunststoff-Petrischale Polymerseite nach oben und setzen die Petrischale in eine Standard-Haus Vakuumexsikkator in Aluminiumfolie abgedeckt (um zu verhindern Photobleichen des markierten Lipids) für mindestens 1 Stunde vollständig jegliches restliche Lösungsmittel zu entfernen. </li></ol> 4. Bildung von Polymersomes <ol><li> Halten Sie eine coverwell, entweder ein hausgemachtes Polydimethylsiloxan (PDMS) gut (ein ~ 0,5 cm dicken Block aus gehärteten PDMS mit ~ 1 cm Durchmesser der Mitte gestanzt) oder eine im Handel erhältliche gut an das Deckglas mit dem Polymerfilm beschichtet. Drücken der coverwell vorsichtig auf die polymerbeschichteten Deckgläschen mit dem Polymer nach oben, bis eine enge Abdichtung zwischen dem coverwell und dem Deckglas ausgebildet. Achten Sie darauf, nicht zu schwer zu drücken und das Deckglas brechen. </li><li> Hinzufügen 200-500 ul Rehydratationslösung (Wasser ist gut, aber eine Reihe von Puffern oder Medien funktioniert auch) in die Kammer (Rehydratisierung Volumen ist abhängig von der Größe des coverwell geklebt). </li><li> Erstellen Sie eine Feuchtigkeitskammer Verdampfen des Rehydrationslösung zu verringern. Legen Sie eine gerollt, nass Kimwipe entlang der Ränder einer Glaspetrischale. Platzieren Sie den Polymerfilm mit der beklebten coverwell in die Feuchtigkeitskammer und Deckel mit einem Deckel. Decken Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie zu Photobleichens minimieren. Ortdie Petrischale auf einer Heizplatte für mindestens 30 min auf 40 ° C eingestellt. </li><li> Die Temperatur der heißen Platte während der Rehydratisierung 24-70 ° C einzustellen , die Größe der Vesikel gebildet (Figur 5). 70 ° C ist in der Nähe der T m der Agarose so Vorsicht verwendet werden sollte , wenn über dieser Temperatur fortfahren. </li></ol> 5. Charakterisierung von Polymersome durch Frap (FRAP) <ol><li> Bewegen Sie das Deckglas mit der beklebten coverwell direkt an einem inversen Mikroskop für die Bildgebung. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden Filtersatz basierend auf dem fluoreszierenden Lipids in der Polymerlösung enthalten. Für Rhodamin-markierte Lipide in den Polymerlösungen dotiert ist, verwenden Sie ein 560/25 nm Anregungsfilter und ein 607/36 nm Emissionsfilter oder vergleichbare Filtersätze. </li><li> Verwenden Sie ein 100X Öl-Objektiv auf der Oberseite des Deckglases zu konzentrieren, in denen die Polyersomen wird eingehalten werden. Wenn die Polyersomen sind besondersgroß (&gt; 20 um) oder wenn der Polymerfilm zu dick ist, eine geringere Leistungsziel (beispielsweise 40X) sollten besser genutzt werden , um die Polymers visualisieren. </li><li> Identifizieren Sie die Polyersomen mittels Fluoreszenzmikroskopie. Identifizieren Polyersomen durch die charakteristische hohle, kugelförmige Vesikel mit einem Durchmesser von&gt; 5 &amp; mgr; m. </li><li> Charakterisieren Membranfluidität Fluorescence Recovery unter Verwendung von nach Photobleaching (FRAP) auf einem Fluoreszenzmikroskop einen einstellbaren Kondensator enthält. Aufgrund der adhärenten Natur und dichte Packung von Polyersomen auf den Substraten wird die natürliche Bewegung der Polyersomen begrenzt, FRAP Abbildungsqualität zu erhöhen. <ol><li> Konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Polymerosom von Interesse. Schließen Sie den Kondensator auf einen kleinen Bereich und sicherzustellen, dass der Rand eines Polymerosom innerhalb der Abbildungsregion von Interesse ist. </li><li> Erhöhen Sie die Kamera Belichtung und sicherzustellen, dass alle Neutralfilter entfernt werden, um wirksam die Region von Interesse photobleach. Lassen Sie die Membran fl<html> uorescence Intensität für 30-60 Sekunden oder bis die Fluoreszenzintensität zu photobleach signifikant verringert. </li><li> Schalten Sie die Lampe ausgeschaltet und vollständig in den Kondensator öffnen. Verringern Sie die Belichtung wieder auf die Starteinstellungen und beginnen sofort Bilder alle 30 Sekunden für 3 min zu erfassen. </li><li> Berechnen Membrandiffusionskoeffizienten unter Verwendung von Standardverfahren 12. Wenn der gebleichten Bereich der Fluoreszenzintensität innerhalb des 3-5 min zurückgewinnt, zeigt dies an, daß die Membran Fluid ist. </li></ol></li></ol> 6. Charakterisierung von Polymerosom Größe <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" /> Abbildung 6. Verfahren zur Größenanalyse von Polyersomen Imaging - Software. Schritt- für -Schritt - Anleitung, wie man den Durchmesser der Vesikel gebildet zu messen. Der Benutzer muss wissen, um die Kalibrierungseinheiten in Pixel / &amp; mgr; m des Mikroskops verwendet.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <ol><li> Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder von Polyersomen in der Bildanalyse - Software 13. </li><li> Stellen Sie den Maßstab für das Bild, indem Sie auf den Dropdown-Feld zu analysieren und das Klicken &quot;Set-Skala&quot;. <ol><li> Kalibrieren Sie den Maßstab für das Mikroskop mit Standardverfahren (dh ein Mikrometer). </li><li> Füllen Sie die Kalibrierung Einheiten und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Klicken Sie auf die Linie Werkzeugkasten und ziehen Sie eine Linie überspannt den Durchmesser eines Vesikel. </li><li> Sammeln Sie die Längenmessungen durch Klicken auf das Dropdown-Feld zu analysieren und klicken Sie auf &quot;Messen&quot;. </li><li> Weiterhin einzelne Vesikel nach dem oben beschriebenen Verfahren zu messen und jede neue Messung mit den Messungen Datenfenster hinzugefügt werden. </li><li> Drücken Sie &quot;Strg + D&quot; nach jeder Zeile Zeichnen und Messen der Länge der Linie auf die gezogene einzuprägenBild wodurch es einfacher zu verfolgen, welche Vesikel wurden analysiert. </li></ol>

<ol>
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Sandia National Laboratories is a multi-program laboratory managed and operated by Sandia Corporation, a wholly owned subsidiary of Lockheed Martin Corporation, for the U.S. Department of Energy's National Nuclear Security Administration under contract DE-AC04-94AL85000.

Polyersomen werden immer als biologische Membran ahmt weit erforscht. Die robusten und vielseitigen Eigenschaften von Polymeren machen sie weit attraktiv für Studien erfordern Membran Funktionalisierung, Langlebigkeit und abgestimmt Ansprechverhalten. Traditionelle Verfahren zur Bildung von Gigantismus Polyersomen 9,10 (&gt; 4 &amp; mgr; m) sind arbeitsintensiv und erfordern teure und spezielle Ausrüstung. Hier präsentieren wir zum ersten Mal, eine schnelle, flexible und robuste Methode zur Bildung von riesigen Größe Polyersomen mit kostengünstigen Standard-Laborreagenzien und Ausrüstung. Verwendung von Gel-assisted Rehydratation kann unilamellar Polymers gebildet werden rasch (&lt;30 min), in einer Vielzahl von Rehydratationslösungen (einschließlich Zellkulturmedien), und mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Polymeren (Daten nicht gezeigt). Die Bildung von multilamellaren Vesikeln oder asymmetrischen nicht mit dieser Technik beobachtet. Während dieser Arbeit verwendeten wir Poly (ethylenoxid) - b- Poly (Butadien) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) neutral Diblockcopolymer. Viele verschiedene Polymerzusammensetzungen (einschließlich geladene Diblockcopolymere) arbeiten mit gut diese Methode (nicht dargestellt). Jedoch einige kommerziell erhältliche Triblock-Copolymere und höhermolekulare Diblockcopolymere (~&gt; 5.000 Daltons) bilden keine deutliche Polymers. Für alle Experimente in diesem Manuskript wurde eine niedrige Konzentration an markiertem Lipid in die Polymerlösungen dotiert nur für Visualisierungszwecke. Andere Verfahren zur Visualisierung, einschließlich Polymere direkt mit einem fluoreszierenden Farbstoff funktionalisiert, können ebenfalls verwendet werden. Polyersomen kann ebenfalls mit Hellfeldmikroskopie abgebildet werden, obwohl die Fluoreszenzmikroskopie eine höhere Auflösung bietet. Die meisten geringfügige Änderungen an dem Protokoll der Regel nicht verändern Ergebnisse. Beispielsweise Lösung kleine Unterschiede in der Konzentration des Polymers auf die Deckgläser verteilt verändern nicht die Bildung des Polymers film gebildet. Während die vollständige Konzentrationsbereich nicht bestimmt wurde, wird die Polymerosom Bildung erfolgreich mit einer großen Palette von Polymerfilm Konzentrationen (zB 1-10 mg / ml) auftreten. Es gibt jedoch einige Protokoll Veränderungen, die sich negativ auf die Polymerosom Bildung beeinflussen. Das bemerkenswerteste ist, dass die runden Glasplättchen (statt quadratisch) Ergebnis in einem sehr schlechten Bildung von Polyersomen. Wir führen dies auf die extrem gleichmäßige Schicht von Agarose auf dem Glas, die tatsächlich die Bildung von Polyersomen behindert. Eine der wichtigsten Herausforderungen dieser Technik ist die Fähigkeit, die Polymers von der Oberfläche mit einer hohen Ausbeute zu gewinnen. Es gibt bestimmte Fälle, in denen die Polymers von der ursprünglichen Oberfläche entfernt von Vorteil sein kann. Aufgrund der hohen Hintergrundfluoreszenz aus dem entwässerten Polymerfilm, individuelle Polymers entfernen und anhaftenden ihnen Deckgläser zu reinigen werden Bildqualität und Charakterisierung (parti erhöhensonders bei FRAP-Analyse). Um dies zu tun, vorsichtiges Pipettieren mit einer Pipettenspitze in der das Ende geschnitten wurde ausgeschaltet wird die Polyersomen von der Oberfläche desorbieren (obwohl die Anzahl der gewonnenen Vesikel ist deutlich niedriger als die ursprünglich gebildet wird). Polymers kann dann auf modifizierten Deckflächen angeordnet werden, so dass der Polymerosom mit dem neuen Deckglas zu interagieren. Typischerweise für neutrale PEO-PBD Polyersomen, Deck mit Ozon behandelt für 15 min die Polyersomen erlauben für die Bildgebung an die Oberfläche zu fallen. Unterschiedliche Oberflächenmodifikation für verschiedene Polymerosom Zusammensetzungen erforderlich (zB negativ oder positiv Polymere geladen). Die meisten Materialien in diesem Protokoll verwendet werden für Tage bis Wochen erfolgreich gespeichert und verwendet. Die erstarrte Agarose kann aufgekocht und wieder verwendet werden, bis die Agarose-Aggregate haben, auch nach dem Kochen beginnt, oder die erstarrte Agarose beginnt zu trocknen. Die Deckgläser mit getrockneten Agarose-Filme können gespeichert und Verwendung werdend auf unbestimmte Zeit (zB Monate). Das Polymer in Chloroform gelöst kann für mehrere Monate bei -20 ° C gelagert werden. Sobald der Polymerfilm auf der Agarose Filmen getrocknet wird, jedoch müssen die Filme innerhalb von zwei Wochen (längerfristige Lagerung wurde nicht direkt bestimmt unter Hausvakuum gespeichert und verwendet werden, aber es gibt deutliche Unterschiede in Polymers von Polymerfilmen gebildet älter als zwei Wochen). Mit Hilfe der Gel-unterstützte Rehydrierung Protokoll hier vorgestellten, Hunderte von gleichmäßig förmigen Polyersomen gebildet werden schnell mit nur wenigen Stunden der Arbeit mit Standard-Ausrüstung und kostengünstige Laborreagenzien. Weiterhin kann Polymers in einer Vielzahl von physiologischen Pufferlösungen und von verschiedenen Polymerzusammensetzungen (nicht gezeigt). Geringfügige Änderungen an dem Verfahren gebildet werden , nicht negativ auf die Bildung von Polymers verändern, Gel-assisted Rehydratation ein vielseitiges und leicht zugängliche Technik Wissenschaftler Rendering mit unterschiedlichen technischen eXpertise. Die Fähigkeit, leicht Riese Polyersomen auf der Größenskala von Zellen schaffen ist wichtig für den Aufbau von künstlichen zellähnlichen Systemen. Die einfache Handhabung und Vielseitigkeit der Gel-unterstützte Rehydrierung diese Polyersomen zu machen bietet eine enorme Fortschritt in der biomimetischen Feld für die Erstellung robuster Zellmembran imitiert. Beispielsweise unter Verwendung dieser Technik, Strategien für die Verkapselung von verschiedenen intrazellulären Komponenten, die Funktionalisierung des Polymers mit Zell-Membranproteinen und Inkorporation von Membrantransportproteinen, um nur einige zu nennen, können entworfen werden Polymerosom basierte künstliche Zellen zu bauen.

Schaffung von synthetischen zellgroßen, giant unilamellaren Vesikeln (GUV) ist ein zunehmendes Interesse an der in vitro Rekonstruktion verschiedener zellulärer Prozesse ein Rahmen für die Erzeugung einer künstlichen Zelle artigen Systems 1,2 aufzubauen. Während GUVs von Lipidmembranen bestehen ausgezeichnete Mimetika von natürlichen, biologischen Membranen sind, sind sie nicht stabil gegenüber Umweltschwankungen und haben eine ziemlich kurze Haltbarkeit. Aufgrund dieser Einschränkungen sind amphiphile Blockcopolymere als Lipid-Mimetika verwendet Polymer-Vesikel zu bilden, oder Polymers. In diesem Zusammenhang sind Polyersomen bei der Entwicklung von biomimetischen Zellsystemen vorteilhaft aufgrund ihrer erhöhten Stabilität 3, chemische Vielseitigkeit 4,5 und modifizierbar körperliche Merkmale 6 - 8. Aktuelle Methoden Gigantismus Polyersomen Elektroformation 9 und Templat Rehydrierung 10, die beide w umfassen zu bildenhich sind zeitaufwändig, arbeitsintensiv, erfordern spezielle Ausrüstung und produzieren geringe Ausbeuten an intakten riesigen Polyersomen. Eine einfache Gel-assisted Rehydratation Verfahren wurde zur Herstellung von Lipid GUVs 11 kürzlich entwickelt. Hier beschreiben wir eine Anpassung der Gel-unterstützte Rehydrierung Technik bis hin zu riesigen Polyersomen mit unterschiedlichen Polymerzusammensetzungen, kontrollierte Größe und in verschiedenen Pufferzusammensetzungen erstellen. Kurz gesagt, 1% w / v Standard-DNA-Gelelektrophorese Agarose Filme werden auf ein Deckglas dehydratisiert. Polymerlösungen in Chloroform hergestellt werden dann über die dehydratisierte Agarose Film ausgebreitet und verdampfen. Nach vollständiger Entfernung des Lösungsmittels, Polymerfilme werden in dem Puffer der Wahl bei mäßiger Erwärmung (40-70 ° C) und Riesen (&gt; 4 &amp; mgr; m) Größe Polymers innerhalb von 30 min gebildet werden rehydratisiert. Dieses Verfahren erzeugt schnell Hunderte von völlig intakt, wohlgeformte Polyersomen unter Verwendung von Standardlaborgeräten und reagents bei minimalen Kosten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Gel-unterstützte Rehydrierung Methode. Riesen Polyersomen eines Diblockcopolymers bestehen nach ~ 30 min Rehydratisierungsgeschwindigkeit gebildet. Der hydrophile Block wird in Magenta und der hydrophobe Block bezeichnet wird grün gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 guage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD-305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm square coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>A standard agarose for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>288306-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commerical coverwell</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70336</td>
			<td>Press-to-Seal Silicone Isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Download: http://fiji.sc/Fiji&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial with Teflon Lid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66009-556</td>
			<td>1.9mL capacity, case of 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liss-rhodamine B PE Lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150C</td>
			<td>1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>10.2 cm x 38.1 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940)</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P2904-BdEO</td>
			<td><a href="http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastic Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>300001-057</td>
			<td>1/2&#34; width</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forming giant-sized polymersomes using gel-assisted rehydration

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (&gt; 4 &#181;m) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (&gt;4 &#181;m) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (&gt;100 &#181;m).

Polyersomen wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren (Abbildung 1) und die gemeinsame Laborgeräte in Abbildung 2 gezeigt skizzierte gebildet. Polyersomen wurden mit VE - Wasser (Abbildung 3) rehydratisiert und auf einem inversen Mikroskop in Epifluoreszenz- abgebildet , um eine 100X Öl - Objektiv verwendet wird . Beachten Sie, dass, wenn Polyersomen nicht sichtbar sind, können sie in Größen gebildet haben, zu groß und mit einem 100X Öl Ziel zu erfassen; eine geringere Leistung Ziel stattdessen werden müssen verwendet werden. Einer der Vorteile von Gel-assisted Rehydratisierung unter Verwendung ist die Vielseitigkeit der Polymers in einer Vielzahl von Rehydratationslösungen bilden. Polymers wurden in deionisiertem Wasser, eine vollständige Säugetierzellkulturmedium, Saccharoselösungen und zwei physiologisch relevanten Pufferlösungen (Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) oder Tris-gepufferter Salzlösung (TBS)), wie in 4 gezeigt. Unter Standardbedingungen erfolgreich gebildet (Rehydrierungmit Wasser bei 40 ° C für 1 h), größer als ~ 70 Polymers werden typischerweise pro 40 x 40 &amp; mgr; m 2 Sichtfeld gefunden. Während die Oberfläche Herstellung von Polymersome nicht homogen ist, gibt es Dutzende von Sichtfeldern mit diesem repräsentativen Ertrag. Weiterhin Polymers waren stabil in Lösung für mindestens 24 Stunden. Polyersomen Größe wurde leicht durch Rehydratisieren Polymerfilme bei unterschiedlichen Temperaturen abgestimmt. Polymers in deionisiertem Wasser bei RT gebildet hatten einen mittleren Durchmesser von 2,9 ± 0,7 um. Wenn die Temperatur steigt während der Rehydration, steigt die durchschnittliche Größe der Polymers auch (Tabelle 1). Bei hohen Temperaturen (&gt; 60 ° C), gebildet Polymers mit Größen sogar größer als 100 um (Abbildung 5). Alle Bildverarbeitung wurde Open-Source - Bildbearbeitungssoftware (Abbildung 6) abgeschlossen werden.Bilder gesammelt wurden in der Software-Programm geöffnet. Die kalibrierte Pixelgröße wurde in Set Maßstab Feld eingegeben. Mit Hilfe der Zeilenwerkzeug wurden Linien über die Durchmesser gezogen. Nach jeder einzelnen Linie gezogen wurde, wurde die kalibrierte Länge gemessen und dem Ergebnisfeld hinzugefügt. Die Daten können dann in der mathematischen Software der Wahl aufgetragen werden (zB Excel, Prism, Herkunft, etc.) <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" /> . Abbildung 2. Abbildung der gemeinsamen und kostengünstige Labormaterialien für die Bildung von Polyersomen erforderlich Die Artikel sind: Parafilm, ein 18,5 G - Nadel, Polymer in Chloroform oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel, einem 1000 ul Pipettenspitze, einen Erlenmeyerkolben, Pinzette, Agarose, 25 mm im Quadrat Deck, PDMS - Bildgebung Brunnen und eine Glaspetrischale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">um</a> diesehen eine größere Version dieser Figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bilder des Gels unterstützten Rehydrierung Verfahren. Gelöste Agarose wird auf einer 25 mm im Quadrat Deckglas , bis sich eine sogar die gesamte Deckfilmüberzüge. Deckgläser werden dann in eine 37 ° C-Inkubator gestellt und Film dehydratisiert. Eine Polymerlösung wird auf die dehydrierte Agarose Film aufgebracht und verteilt eine Nadel in einer kreisförmigen Bewegung. Das Deckglas wird dann in einen Exsikkator O / N vollständig alle Lösungsmittelreste zu verdampfen. Schließlich wird und Imaging - Kammer an dem Substrat haftet und Polymere werden mit der Lösung der Wahl rehydriert und in eine Petrischale gegeben , bei 40 ° C für mindestens 25 min zur Bildung von Polyersomen zu ermöglichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen Zahl.</a> </p<html> &gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" /> Abbildung 4. Polymersome können in einer Vielzahl von verschiedenen Puffern bilden. PEO-PBD Polymerfilme wurden mit den angegebenen Puffer rehydratisiert bei 40 ° C für 1 Stunde. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" /> Abbildung 5. Die Erhöhung der Temperatur während der Rehydrierung erhöht die Größe der Polyersomen. Repräsentative Epifluoreszenz- Bilder von Polyersomen in Wasser bei den angegebenen Rehydrierung Temperaturen gebildet. Bei steigender Temperatur zu größeren Polyersomen. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m._blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Temperatur (° C) </td><td> Durchschnittliche Größe (um) </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 2,93 ± 0,7 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 5,76 ± 2,5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 6,65 ± 2,4 </td></tr><tr><td> 60 </td><td> 11.46 ± 5.8 </td></tr><tr><td> 70 </td><td> 14.04 ± 7.0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Die Erhöhung der Temperatur während der Rehydrierung führt zu einer erhöhten Polymerosom Größe. Die mittleren Durchmesser für mehr als 100 Polyersomen in Wasser pro unterschiedlichen Temperaturbedingungen wurden berechnet und sind hier dargestellt. Fehler ist die Standardabweichung.

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Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Forming Gigantismus Polymersome Mit Gel-unterstützte Rehydrierung

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K Aufrufe.  Sandia National Laboratories. We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Forschung

Biotechnik

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

Glutamin Flux Imaging Verwendung genetisch codierten Sensoren

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Pattern-based Search of Epigenomic Data Using GeNemo

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and other functional genomic data are very limited. GeNemo is the first online search tool that accomplishes this goal. Users input their functional genomic data in the Browser Extensible Data (BED), Peaks, and bigWig formats, and may search for data in any of the three formats. Users may specify which types of datasets to search against, choosing from a variety of online datasets, with the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) representing different epigenomic marks, transcriptional factor binding sites, and chromatin hypersensitivities or accessibilities in specific cell types, and developmental stages or species (mouse or human). GeNemo returns a list of genomic regions with matching patterns to the input data, which may be viewed in the browser as well as downloaded in the BED file format. The upgraded GeNemo has improved graphical display, has more robust interface, and is no longer prone to errors due to changes in the University of California, Santa Cruz (UCSC) genome browser. Troubleshooting steps for common problems are discussed. As the amount of functional genomic data is expanding exponentially, there is a critical need to develop and refine new bioinformatic tools such as GeNemo for data analyses and interpretation.

Unlike DNA sequence data, epigenomic data are not readily subjected to text-based searches. Presented here are the procedures to use an upgraded version of GeNemo, a web-based bioinformatics tool, to conduct pattern-based searches for similarities in epigenomic data comparing available online databases including Encyclopedia of DNA Elements with user&#39;s data.

Pattern-basierte Suche nach epigenomischen Daten mit GeNemo

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Hochauflösende gemustert Biofilm Abscheidung mittels pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Einfache, erschwingliche und modulare Musterung von Zellen mit DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...