We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).

1. Polimer ve agaroz hazırlanması Not: Eldiven ve bir laboratuvar önlüğü, bu protokol boyunca her zaman giyilmelidir. Koruyucu gözlük aynı şekilde herhangi bir organik çözücü veya olası sıçramasına ile herhangi bir adımla çalışması sırasında ihtiyaç vardır. <ol><li> kloroform içinde polimerin 5 mg / ml çözelti hazırlayın. B poli (bütadien) (PEO-PBD EO 22 -bd 37) tam olarak çözülmesi için bir cam şişe ve girdap diblok kopolimer - katı poli (etilen oksit) 5 mg kloroform 1 ml ilave edilir. Bir kimyasal davlumbaz kloroform kullanılarak tüm adımları uygulayın. </li><li> 99.5 mol% &#39;si etiketlenmemiş polimerin bir% 0.5 mol nihai konsantrasyonda, bir flüoresan işaretli sfingosin (satın önce kloroform içinde çözülmüş) ilave edin. <ol><li> Örneğin, pipet 0 ° nihai konsantrasyonu için 997,58 ul PEO-PBD, EO (2.950 Dalton&#39;luk bir molekül ağırlığına sahip), kloroform içinde 22 -bd 37 polimer içine kloroform içinde bir 1 mg / ml floresan işaretli sfingosin 12 ul.İşaretli sfmgosin karıştırılır% 5 mol ve 99.5 mol% &#39;si polimeri. </li><li> -20 ° C&#39;de, bir kloroform-dirençli kapak ile hava geçirmez bir şişe içinde mağazası çözeltisi. Şişe kenarında tesisatçı bandı sarın nerede flakon üzerine kapak vidaları ve flakon kapağı sabitleyin. Kapağın dış tesisatçı bant başka bir parça sarın ve nihayet en az buharlaşma sağlamak için bant dışına Parafilm sarın. </li></ol></li><li> 250 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içinde 50 ml su (ya da 50 mi, 100 mM sükroz) içinde 0.5 mg, standart agaroz karıştırılarak bir% 1 w / v agaroz çözeltisi olun. Yaklaşık 1 dakika boyunca, standart mikrodalga agaroz kaynatıp (çözeltinin temizleme tarafından belirtildiği gibi ya da tamamen çözünene kadar). Not: Agaroz çözeltinin soğutulması bir kaç dakika sonra veya kullanılmış katılaşmaya bırakılır, depolanır ve aynı yöntem kullanılarak, erimiş tekrar edilebilir. </li></ol> 2. Agaroz Film Hazırlanması <ol><li> tıkanmasını önlemek için 1000 ul pipet kapalı ucunu kesin. kesme ucu kullanarak, pipet 3doğrudan üreticiden 25 mm kare cam lamel üzerine eritilmiş agaroz çözüm 00 ul. </li><li> Agaroz ~ 65-75 ° C öncesinde çökelmeye soğumaya izin ver. Agaroz çok serin ise, yayılma sürecinde yüzeyde gelme başlayacaktır. Agaroz çok sıcak ise tersine, yüzeye agaroz uyması yayılıyor fazla gerektirecektir. </li><li> eldivenli parmakları ile lamel sadece kenarından tutun ve eşit lamel yüzeyi boyunca agaroz yaymak için bir 1000 ul pipet uzun kenarını kullanın. Agaroz tamamen yapışır ve lamel kapakları kadar ileri ve geri lamel üzerinde pipet hareket ettirin. </li><li> Agaroz yukarı bakacak şekilde Parafilm bir parça üzerine agaroz kaplı lamel yerleştirin. lamelleri istenen sayıda kaplanmış sonra en az 1 saat süre ile yüzeyi üzerine agaroz kurutmak için 37 ° C inkübatör içine lamelleri ile Parafilm yerleştirin. Not: DehidrasyonAgaroz görebilir tabakası ortadan kaybolması ile belirlenir; lamel düz ve net görünmelidir. filmler tamamen susuz olduğunda, mağaza agaroz yüzeyi tek kullanımlık plastik Petri kabındaki yukarı bakacak şekilde lamelleri. </li></ol> 3. Polimer film formasyonu <ol><li> Pipet 30 ul agaroz film üzerine polimer çözeltisi hazırlanır. </li><li> eldivenli parmakları ile lamel sadece kenarından tutun ve dairesel yayma hareketi kullanılarak agaroz filmler arasında çözüm yaymak için bir 18 G iğne uzun kenarını kullanın. Çözelti buharlaştırıldı kadar yayılan devam edin. Not: iğnenin keskin ucunun dikkatli olun. </li><li> yukarı bakacak şekilde, bir plastik Petri tabağı polimer tarafında polimer filmleri yerleştirin ve alüminyum folyo ile kaplı bir standart bir ev vakum desikatörde petri tabak koyun tam olarak herhangi bir kalan solventin çıkması için en az 1 saat boyunca (işaretli sfingosin photobleaching önlemek için). </li></ol> Pol 4. oluşumuymersomes <ol><li> Bir coverwell uyun ya ev yapımı polidimetilsiloksan (PDMS) de (orta ± 1 cm çaplı tedavi PDMS bir ~ 0.5 cm kalınlığında bir blok zımbalanarak) ya da bir polimer film ile kaplı lamel de ticari olarak temin edilebilir. sıkı bir mühür coverwell ve kapak arasında oluşana kadar yukarı bakacak şekilde polimer ile polimer kaplı lamel üzerine hafifçe coverwell basın. çok fazla bastırmayın ve lamel kırmak için dikkatli olun. </li><li> odası için 200-500 ul rehidratasyon çözüm (su iyi, ama tamponlar veya medya içeren bir dizi de çalışır) ekleyin (rehidrasyon hacminin yapışık coverwell boyutuna bağlıdır). </li><li> rehidrasyon solüsyonu buharlaşmasını azaltmak için bir rutubet gözünün oluşturun. cam bir Petri tabağına kenarları boyunca bir rulo ıslak Kimwipe yerleştirin. nem odası içine yapıştırılmış coverwell polimer filmi koyun ve bir kapak ile kapatın. photobleaching en aza indirmek için alüminyum folyo ile Petri kabı örtün. yersıcak bir plaka üzerinde Petri kabı, en az 30 dakika boyunca 40 ° C olarak ayarlandı. </li><li> Ayarlamak için 24-70 ° C arasında oluşan veziküllerin (Şekil 5) büyüklüğü rehidrasyon boyunca sıcak plaka sıcaklığı ayarlayın. Dikkatli kullanılması gerektiğini, böylece bu sıcaklıkta ötesine geçmeden zaman 70 ° C agaroz Tm yakındır. </li></ol> Photobleaching sonra Floresan Kurtarma tarafından Polymersomes 5. Karakterizasyonu (sıkı bağlamak) <ol><li> görüntüleme için bir ters mikroskop coverwell doğrudan yapıştırılmış olan lamel hareket ettirin. </li><li> Polimer çözümü dahil floresan lipid dayalı uygun filtre kümesi seçin. Rodamin etiketli lipitlerin polimer çözeltileri halinde katkılı, bir 560/25 nm uyarılma filtreli ve 607/36 nm emisyon filtre veya benzer filtre kümesi kullanın. </li><li> polymersomes yapıştırılacağı lamel üst yüzeyi üzerinde odaklanmak için 100X yağ amacı kullanın. polymersomes özellikle isenizbüyük (&gt; 20 mm) ya da bir polimer film çok kalın ise, düşük bir güç hedef (örneğin, 40X) daha polymersomes görselleştirmek için kullanılmalıdır. </li><li> floresan mikroskobu kullanarak polymersomes tanımlayın. çapı&gt; 5 mikron ile karakteristik içi boş, küresel vezikül tarafından polymersomes belirleyin. </li><li> ayarlanabilir bir kondenser içeren bir floresan mikroskop (sıkı bağlamak) photobleaching sonra floresan kurtarma kullanarak membran akışkanlığını karakterize eder. Nedeniyle yapışık doğa ve yüzeylerde polymersomes sıkı ambalaj, polymersomes doğal hareket sıkı bağlamak görüntüleme kalitesini artırmak, sınırlıdır. <ol><li> ilgi polymersome üzerinde mikroskop odaklanın. küçük bir bölgeye kondansatör kapatıp polymersome kenar ilgi görüntüleme bölgesi içinde olduğundan emin olun. </li><li> Kamera artırmak ve tüm nötral yoğunluk filtreleri etkili bir ilgi bölgeyi photobleach kaldırılır emin olun. Membran fl izin<html> 30-60 saniye ya da floresan yoğunluğu önemli ölçüde azalmıştır kadar photobleach için yoğunluk uorescence. </li><li> Lambayı kapatın ve tam kondansatörü açın. Başlangıç ​​ayarlarına geri poz azaltmak ve 3 dakika boyunca görüntüleri her 30 saniyede yakalayan hemen başlar. </li><li> Standart yöntemler 12 kullanılarak membran difüzyon katsayılarını hesaplayın. ağartılmış bölgesi 3-5 dakika içinde flüoresan yoğunluğu kavuşur, bu membran sıvı olduğunu göstermektedir. </li></ol></li></ol> Polymersome Boyutu 6. karakterizasyonu <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" /> . Görüntüleme yazılımı kullanılarak polymersomes boyutu analizi için 6. Süreci Şekil Adım-adım oluşturduğu veziküllerin çapını ölçmek yönergeler. Kullanıcı kullanılan mikroskop piksel / mikron kalibrasyon birimlerini bilmeniz gerekir.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <ol><li> Görüntü analiz yazılımı 13 polymersomes kazanılmış görüntüleri açın. </li><li> açılır her analiz kutusu ve tıklayarak &quot;Set skalası&quot; üzerine tıklayarak resmin ölçeği ayarlayın. <ol><li> Standart yöntemler kullanılarak mikroskop (yani, bir mikrometre) için ölçek kalibre. </li><li> Kalibrasyon birimlerinde doldurun ve &quot;Tamam&quot; a tıklayın. </li></ol></li><li> hat alet kutusuna tıklayın ve bir kesecik çapını kapsayan bir çizgi çizin. </li><li> açılan her analiz kutuya tıklayarak ve &quot;ölçü&quot; tıklayarak uzunluk ölçümleri toplayın. </li><li> Yukarıdaki prosedür ve ölçümler veri penceresine eklenecek her yeni ölçüm aşağıdaki bireysel veziküller ölçme devam edin. </li><li> Her satırı çizim ve üzerine çizilen çizgiyi diziye uzunluğu ölçüldükten sonra &quot;Ctrl + D&quot;Görüntü daha kolay veziküller analiz edildiği izlemek için yapım. </li></ol>

<ol>
	<li>Streicher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+reconstituted+in+GUVs:+A+biomimetic+system+to+study+initial+steps+of+cell+spreading.">Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).</li><li>Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Assembly+of+Polymer+Nanotube+Networks+via+Kinesin+Powered+Microtubule+Filaments.">Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments.</a> Nanoscale. , (2015).</li><li>Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a., Bates, F. S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+weight+dependence+of+polymersome+membrane+structure,+elasticity,+and+stability.">Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability.</a> Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).</li><li>Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+polymersome+surfaces:+functionalization+with+dendritic+groups.">Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups.</a> Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).</li><li>Egli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+functionalization+of+polymersome+surfaces:+A+new+approach+to+surface+immobilization+and+cell+targeting+using+polymersomes.">Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).</li><li>Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymersome+nanoreactor+with+controllable+permeability+induced+by+stimuli-responsive+block+copolymers.">A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers.</a> Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).</li><li>Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxide+ion+flux+and+pH-gradient+driven+ester+hydrolysis+in+polymer+vesicle+reactors.">Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors.</a> Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).</li><li>Henderson, I. M., Paxton, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salt,+shake,+fuse+-+Giant+hybrid+polymer/lipid+vesicles+through+mechanically+activated+fusion.">Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).</li><li>Discher, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes:+Tough+Vesicles+Made+from+Diblock+Copolymers.">Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers.</a> Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).</li><li>Howse, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Templated+formation+of+giant+polymer+vesicles+with+controlled+size+distributions.">Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions.</a> Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).</li><li>Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in+Solutions+of+Physiologic+Ionic+Strength+Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in+Solutions+of+Physiologic+Ionic+Strength.">Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength.</a> J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).</li><li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li></ol>

Sandia National Laboratories is a multi-program laboratory managed and operated by Sandia Corporation, a wholly owned subsidiary of Lockheed Martin Corporation, for the U.S. Department of Energy's National Nuclear Security Administration under contract DE-AC04-94AL85000.

Polymersomes yaygın biyolojik zar taklit olarak ele hale gelmektedir. polimerlerin sağlam ve çok yönlü özellikler membran fonksiyonelleşmesine, uzun ömür ve ayarlı yanıt gerektiren çalışmalar için onları yaygın çekici hale getiriyor. Dev boyutlu polymersomes 9,10 (&gt; 4 mm) oluşturulması için geleneksel yöntemler, emek yoğun ve pahalı ve özel ekipman gerektirmektedir. Burada, ilk kez, standart ucuz laboratuvar reaktifler ve ekipman kullanılarak dev boyutlu polymersomes oluşturulması için hızlı, çok yönlü ve sağlam yöntem sunuyoruz. Jel destekli rehidrasyon kullanılarak, tek katmanlı polymersomes hızlı oluşturulabilir (&lt;30 dakika), (hücre kültür ortamı da dahil olmak üzere), rehidrasyon çözümleri çeşitli ve farklı polimerlerin çeşitli (veriler gösterilmemiştir). çok katmanlı veya asimetrik kesecikler bu teknik kullanılarak gözlenmedi. B poli (- Bu çalışma boyunca, poli (etilen oksit) kullanılırbütadien) (PEO-PBD EO 22 -bd 37) nötr iki bloklu kopolimer. (Yüklü diblok kopolimerler de dahil olmak üzere), çok sayıda, farklı polimer bileşimleri de bu yöntemi (gösterilmemiştir) ile çalışır. Bununla birlikte, bazı ticari olarak temin edilebilen üç-bloklu kopolimerleri ve yüksek molekül ağırlıklı iki bloklu kopolimerler (~&gt; 5000 Dalton) farklı polymersomes oluşturmazlar. Bu yazının deney tüm etiketli lipid konsantrasyonu düşük görselleştirme amaçlı polimer çözeltileri içine katkılı edildi. doğrudan bir floresan boya ile işlevselleştirilmiş polimerler dahil olmak üzere, görüntüleme için diğer yöntemler de kullanılabilir. floresan mikroskopi daha fazla çözünürlük sağlar olsa Polymersomes aynı şekilde, parlak bir alan mikroskobu ile görüntülenebilir. protokole en küçük değişiklikler genellikle sonuçları değiştirmez. Örneğin, kapak slipleri üzerine yayılır polimer çözeltisinin konsantrasyonu küçük farklar, polimer f oluşumunu değiştirmeyenilm kurdu. Tam konsantrasyon aralığı saptanabilir değildi, polymersome oluşumu başarılı polimer film konsantrasyonları (örneğin, 1-10 mg / ml) geniş bir yelpazesi ile ortaya çıkar. Ancak, olumsuz polymersome oluşumunu etkiler bazı protokol değişiklikler vardır. En önemli polymersomes çok kötü oluşumunda sonucu (yerine kare) o yuvarlak cam lamelleri olduğunu. Biz aslında polymersomes oluşumunu engelleyen camına agaroz son derece bile kaplamak için bu bağlıyorlar. Bu yöntemin en önemli güçlüklerden biri, yüksek bir verimle yüzeyinden polymersomes yeniden değerlendirilmesi performansını sağlamasıdır. Orijinal yüzeyinden polymersomes kaldırarak avantajlı olabilir ki belirli durumlar vardır. Nedeniyle susuz polimer filmden yüksek eşiğe, bireysel polymersomes kaldırarak ve görüntüleme kalitesi ve karakterizasyonu artıracak lamelleri temizlemek için onları yapışan (parti için) Sıkı bağlamak analiz sırasında tamamen uzun ömürlü. (Geri kazanılan veziküllerin, ilk olarak oluşan önemli ölçüde daha düşük olmasına rağmen) uç yüzeyinden polymersomes desorbe olacak kesilmiş olduğu bir pipet ile bu nazik pipetleme yapmak için. Polymersomes sonra polymersome yeni lamel ile etkileşim sağlayan, Modifiye edilmiş lamel yüzeylerine yerleştirilebilir. 15 dakika polymersomes görüntüleme için yüzeye aşağı düşmesine izin için Tipik olarak, nötr PEO-PBD polymersomes için, ozon ile tedavi lamelleri. Farklı yüzey modifikasyonu, farklı polymersome bileşimlerinde (örneğin, negatif ya da pozitif polimerleri yüklü) için gereklidir. Bu protokolde kullanılan birçok malzeme başarılı bir şekilde depolanır ve günler, haftalar boyunca kullanılır. katılaşmış agaroz yeniden kaynatılan ve agaroz bile kaynadıktan sonra agrega yaşamaya başlar, ya da katılaşmış agaroz kurumaya başlayana kadar tekrar edilebilir. kurutulmuş agaroz filmler ile lamelleri saklanabilir ve kullanım edilebilir(örneğin, ay) süresiz d. Kloroform içinde çözülmüş bir polimer birkaç ay boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. polimer film agaroz filmler üzerinde kurutulur sonra, ancak, filmler iki hafta içinde (daha uzun süreli depolama doğrudan belirlenir etmediğini ev tipi vakum altında saklanır ve kullanılması gerekir, ancak polimer filmler üzerinden iki oluşan polymersomes göze çarpan bir fark vardır hafta). Burada sunulan jel destekli rehidrasyon protokolünü kullanarak, muntazam şekilli polymersomes yüzlerce standart donanım ve ucuz laboratuvar reaktifleri kullanılarak emeğin sadece birkaç saat hızla oluşur. Ayrıca, polymersomes fizyolojik tampon çözeltilerin çeşitli ve farklı polimer bileşimleri (şekilde gösterilmemiştir) oluşturulabilir. Yönteme küçük değişiklikler ile negatif bir bilim jel destekli tekrar nemlendirme çok yönlü ve erişilebilir teknik işleme, polymersomes oluşumunu değiştirmeyen teknik e değişenXPERTISE. Kolayca hücrelerinin boyutu ölçekte dev polymersomes oluşturma yeteneği yapay hücre benzeri sistemler oluşturmak için gereklidir. Bu polymersomes yapmak için jel destekli rehidrasyon kullanımı ve çok yönlülük kolaylığı sağlam hücre zarı taklit oluşturulması için biomimetic alanında büyük bir ilerleme vardır. Örneğin, bu teknik kullanılarak, farklı hücre içi bileşenleri, hücre zar proteinleri ve membran taşıma proteinlerinin dahil edilmesi ile polimerin işlevsellik, kapsüllenmesi için stratejiler sadece birkaç isim polymersome bazlı yapay hücreleri oluşturmak için tasarlanabilir.

Sentetik hücre büyüklüğünde, dev tek katmanlı veziküller (GUVs) oluşturulması yapay hücre gibi sistem 1,2 nesil için bir çerçeve oluşturmak için farklı hücresel süreçleri in vitro yeniden ilgi artmaktadır. lipid zarlar oluşan GUVs doğal biyolojik zarların çok taklit olsa da, çevresel dalgalanmalara karşı stabil değildir ve oldukça kısa bir raf ömrüne sahiptir. Bu sınırlamalar nedeniyle, amfifilik blok kopolimerleri polimer kesecikler veya polymersomes oluşturulması için yağ taklit olarak kullanılmıştır. 8 - Bu kapsamda, polymersomes nedeniyle artan istikrar 3, kimyasal yönlülük 4,5 ve değiştirilebilir fiziksel özellikleri 6 biomimetic hücre sistemlerinin geliştirilmesi avantajlıdır. Mevcut yöntemler, dev-ebatlı polymersomes electroformation 9 ve şablonu rehidrasyon 10 w iki meydana getirmek üzerehich zaman alıcı, emek-yoğun, uzman gerektiren ekipman ve bozulmamış dev polymersomes düşük verim üretmek. Basit bir jel destekli rehidrasyon yöntemi son zamanlarda lipit GUVs 11 üretimi için geliştirilmiştir. Burada, dev değişen polimer bileşimleri ile polymersomes, kontrollü boyutu ve çeşitli tampon kompozisyonlar oluşturmak için jel destekli rehidrasyon tekniğinin bir uyarlamasını açıklar. Kısaca, standart DNA jel elektroforezi agaroz filmleri ağırlık / hacim% 1, bir cam lamel üzerine kurutulur. kloroform içinde hazırlanan polimer çözeltiler, daha sonra susuz agaroz film boyunca yayılmış ve buharlaşmaya bırakılır. Tam çözücü çıkarıldıktan sonra, polimer filmler boyutlu polymersomes 30 dakika içinde oluşturulmuş orta derecede ısıtma (40-70 ° C) ve dev (&gt; 4 mm) ile seçim tampon maddesi içinde yeniden ıslatılmıştır. Bu yöntem hızla standart laboratuar ekipmanları ve REAGEN kullanarak tamamen sağlam, iyi biçimlendirilmiş polymersomes yüzlerce üretirasgari maliyetle ts. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" /> Jel destekli rehidrasyon yöntemi gösteren Şekil 1 şematik. Bir diblok kopolimer oluşan Dev polymersomes rehidrasyon ~ 30 dakika sonra oluşturulur. Hidrofil blok macenta olarak gösterilir ve hidrofobik blok yeşil gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 guage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD-305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm square coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>A standard agarose for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>288306-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commerical coverwell</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70336</td>
			<td>Press-to-Seal Silicone Isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Download: http://fiji.sc/Fiji&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial with Teflon Lid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66009-556</td>
			<td>1.9mL capacity, case of 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liss-rhodamine B PE Lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150C</td>
			<td>1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>10.2 cm x 38.1 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940)</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P2904-BdEO</td>
			<td><a href="http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastic Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>300001-057</td>
			<td>1/2&#34; width</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forming giant-sized polymersomes using gel-assisted rehydration

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (&gt; 4 &#181;m) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (&gt;4 &#181;m) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (&gt;100 &#181;m).

Polymersomes (Şekil 1) ve Şekil 2 &#39;de gösterilen genel laboratuar ekipmanı, yukarıdaki prosedür izlenerek oluşturuldu. Polymersomes iyonu giderilmiş su (Şekil 3) ile yeniden ıslatılmıştır ve 100X yağ objektif kullanarak Epifloresans bir ters mikroskop görüntülenmiştir. polymersomes görünür değilse, bir 100X petrol amacı ile yakalamak için çok büyük boyutlarda oluşmuş olabileceğini unutmayın; Daha düşük güç hedefi yerine kullanılacak gerekebilir. Jel destekli rehidrasyon kullanılarak avantajlarından biri rehidrasyon çözümleri çeşitli polymersomes oluşturabilirler yönlülük olup. Polymersomes başarılı iyonu giderilmiş su, tam bir memeli hücre kültürü ortamı, Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, şeker çözeltisinin iki fizyolojik olarak ilgili tampon çözeltileri (fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ya da Tris-tamponlu tuzlu su (TBS)) olarak oluşturulmuştur., Standart koşullar altında, (rehidrasyon1 saat boyunca 40 ° C) su ile, daha büyük 70 ° den polymersomes tipik bakış 40 x 40 um 2. alan başına bulunur. polymersomes yüzey üretimi homojen olmasa da, bu temsilci verimi görüş alanlarının düzinelerce vardır. Ayrıca, polymersomes en az 24 saat boyunca çözelti içinde stabil idi. Polymersomes boyutu kolayca değişen sıcaklıklarda polimer filmler rehidrasyon ile ayarlandı. Oda sıcaklığında deiyonize su içinde oluşturulan Polymersomes 2.9 ± 0.7 um arasında bir ortalama çapa sahiptir. Rehidrasyon sırasında sıcaklık arttıkça, polymersomes ortalama boyutu (Tablo 1) artar. Yüksek sıcaklıklarda (&gt; 60 ° C), boyutları ile oluşturulan polymersomes da daha büyük 100 um (Şekil 5). Tüm görüntü işleme açık kaynak görüntüleme yazılımı (Şekil 6) kullanılarak tamamlanmıştır.Toplanan Görüntüler yazılım programında açılmıştır. kalibre piksel boyutu ayarlamak ölçek kutusu içine girildi. satırı aracını kullanarak, çizgiler çapları arasında çizildi. Her bir çizgi çizilir sonra, kalibre uzunluğu ölçülmüş ve sonuçlar kutusuna eklendi. Veriler daha sonra seçim (örneğin, Excel, Prizma, Origin, vb) matematiksel yazılımda çizilebilir <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" /> . Polymersomes oluşumu için gerekli olan istenen ürün yaygın ve ucuz bir laboratuar malzeme Şekil 2. Şekil şunlardır: Parafilm, kloroform veya başka bir uygun çözücü içinde bir 18.5 G iğne, polimer, 1,000 ul pipet, bir Erlenmeyer şişesi, cımbız, agaroz, 25 mm kare lamelleri, PDMS görüntüleme kuyuları ve cam Petri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">için tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" /> Jel destekli rehidrasyon yönteminin Şekil 3. Resimler. Agaroz Çözünmüş eşit filmi kat tüm lamel kadar 25 mm kare lamel yayılır. Lameller, sonra 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir ve film kurutulmuştur. Bir polimer çözeltisi susuz agaroz film üzerine yatırılır ve dairesel hareketlerle bir iğne kullanılarak yayılır. Lamel sonra bir kurutucu O&#39;da / N tamamen herhangi bir çözücü artıkları buharlaşmaya yer almaktadır. Son olarak, ve görüntüleme odası yüzeye yapıştırılır ve polimerler 40 ° C polymersomes oluşumuna izin vermek için en az 25 dk seçim solüsyonu ile rehidrate ve bir Petri kabı içine yerleştirilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">Bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam.</a> </p<html> &gt; <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" /> Şekil 4. Polymersomes farklı tamponlar, çeşitli meydana gelebilir. PEO-PBD polimer filmler, 1 saat boyunca 40 ° C &#39;de gösterilen tampon maddesi ile rehidre edildi. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" /> Rehidrasyon boyunca sıcaklığı arttırmak Şekil 5. polymersomes boyutunu artırır. Belirtilen rehidrasyon sıcaklıklarda su içinde oluşturulan polymersomes temsili epifluorışıma ve görüntüler. Daha büyük polymersomes sıcaklık sonucu artırılması. Ölçek çubuğu 10 mikron =.&quot;_blank&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sıcaklık (° C) </td><td> Ortalama Boy (um) </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 2.93 ± 0.7 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 5.76 ± 2.5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 6.65 ± 2.4 </td></tr><tr><td> 60 </td><td> 11.46 ± 5.8 </td></tr><tr><td> 70 </td><td> 14.04 ± 7.0 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. hesaplandı farklı sıcaklık koşulu başına su içinde 100&#39;den büyük polymersomes için. Ortalama çapları artmış polymersome boyutu rehidrasyon sonuçları sırasında sıcaklığının artırılması ve burada tasvir edilmektedir. Hata standart sapmadır.

Watch this Scientific Journal Video about Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration at JoVE.com

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Jel destekli rehidrasyon kullanma Dev boyutlu Polymersomes Şekillendirme

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

forming-giant-sized-polymersomes-using-gel-assisted-rehydration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K Görüntüleme.  Sandia National Laboratories. We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Video: Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Biyomühendislik

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

Genetiği Kodlanmış Sensörleri kullanarak glutamin Akı Görüntüleme

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D Kağıt mikroakışkan Cihazlar Construct Yapışkan Desenlendirme kullanma

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Pattern-based Search of Epigenomic Data Using GeNemo

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and other functional genomic data are very limited. GeNemo is the first online search tool that accomplishes this goal. Users input their functional genomic data in the Browser Extensible Data (BED), Peaks, and bigWig formats, and may search for data in any of the three formats. Users may specify which types of datasets to search against, choosing from a variety of online datasets, with the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) representing different epigenomic marks, transcriptional factor binding sites, and chromatin hypersensitivities or accessibilities in specific cell types, and developmental stages or species (mouse or human). GeNemo returns a list of genomic regions with matching patterns to the input data, which may be viewed in the browser as well as downloaded in the BED file format. The upgraded GeNemo has improved graphical display, has more robust interface, and is no longer prone to errors due to changes in the University of California, Santa Cruz (UCSC) genome browser. Troubleshooting steps for common problems are discussed. As the amount of functional genomic data is expanding exponentially, there is a critical need to develop and refine new bioinformatic tools such as GeNemo for data analyses and interpretation.

Unlike DNA sequence data, epigenomic data are not readily subjected to text-based searches. Presented here are the procedures to use an upgraded version of GeNemo, a web-based bioinformatics tool, to conduct pattern-based searches for similarities in epigenomic data comparing available online databases including Encyclopedia of DNA Elements with user&#39;s data.

Desen tabanlı arama Epigenomic verileri GeNemo kullanarak

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Termal Nanoimprinting teknik ve insan endotel hücreleri koloni oluşturan yanıt testi ile taranması degrade Nanopattern imalatı

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Yüksek çözünürlüklü desenli biyofilm ifade kullanarak pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

DNA Kullanarak Hücrelerin Basit, Uygun Fiyatlı ve Modüler Deseni

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...