We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).

1. Polímeros y Agarosa Preparación Nota: Los guantes y una bata de laboratorio se debe usar en todo momento a lo largo de este protocolo. Las gafas de seguridad son igualmente necesarios durante el trabajo con cualquier disolvente orgánico o en cualquier fase con posibles salpicaduras. <ol><li> Preparar una solución de 5 mg / ml de polímero en cloroformo. Añadir 1 ml de cloroformo a 5 mg de poli sólido (óxido de etileno) - poli b- (butadieno) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) de copolímero de dibloque en un vial de vidrio y agitar para disolver completamente. Realizar todos los pasos utilizando cloroformo en una campana de humos química. </li><li> Mezclar en un lípido marcado con fluorescencia (comprado ya disuelto en cloroformo) a una concentración final de 0,5% en moles de polímero sin marcar 99,5% en moles. <ol><li> Por ejemplo, la pipeta ~ 12 l de un lípido 1 mg / ml marcado con fluorescencia en cloroformo en 997,58 l PEO-PBD, EO 22 -BD 37 de polímero en cloroformo (con un peso molecular de 2.950 Daltons) para una concentración final de 0.5% en moles esfingosina marcada mezcla y 99.5% de polímero mol. </li><li> Conserve la solución en un frasco hermético con una tapa cloroformo resistente a -20 ° C. Envuelva la cinta fontaneros en el borde del vial, donde los tornillos de la tapa sobre el vial y asegurar la tapa en el frasco. Envolver otro trozo de cinta fontaneros en el exterior de la tapa y, finalmente, envolver Parafilm en el exterior de la cinta para asegurar una evaporación mínima. </li></ol></li><li> Hacer una solución de agarosa al 1% w / v mediante la mezcla de 0,5 mg de agarosa estándar en 50 ml de agua (o 50 ml 100 mM de sacarosa) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Hervir la solución de agarosa en un microondas estándar para ~ 1 min (o hasta que esté completamente disuelto como se ha señalado por el desmonte de la solución). Nota: La solución de agarosa se puede utilizar después de unos minutos de enfriamiento o se deja solidificar, almacenada y re-fundidos usando el mismo procedimiento. </li></ol> 2. Preparación de película de agarosa <ol><li> Corte el extremo de una punta de pipeta de 1.000 l para evitar la obstrucción. Con la punta de corte, 3 pipeta00 l de solución de agarosa fundida sobre un cuadrado de 25 mm cubreobjetos de cristal directamente desde el fabricante. </li><li> Permitir que la agarosa se enfríe a ~ 65-75 ° C antes de la deposición. Si la agarosa es demasiado frío, comenzará a acumularse en la superficie durante el proceso de difusión. Por el contrario, si la agarosa es demasiado caliente, se requerirá más difusión para adherir la agarosa a la superficie. </li><li> Almacenar casi el borde del cubreobjetos con los dedos enguantados y utilizar el borde largo de la otra punta de la pipeta de 1.000 l para difundir la agarosa de manera uniforme en toda la superficie del cubreobjetos. Mueva la punta de la pipeta de ida y vuelta a través del cubreobjetos hasta que la agarosa se adhiere por completo a y cubre el cubreobjetos. </li><li> Coloque el cubreobjetos de agarosa-revestido sobre un trozo de Parafilm con la agarosa hacia arriba. Una vez se recubren el número deseado de cubreobjetos, coloque el Parafilm con los cubreobjetos en una incubadora a 37 ° para deshidratar la agarosa sobre la superficie durante al menos 1 hr. Nota: La deshidrataciónse determina por la desaparición de la capa visible de agarosa; el cubreobjetos debe tener aspecto liso y claro. Una vez que las películas son totalmente deshidratado, tienda de cubreobjetos con la superficie de agarosa hacia arriba en una placa de Petri de plástico desechable. </li></ol> 3. Formación de película de polímero <ol><li> Pipeta 30 l preparados solución de polímero sobre la película de agarosa. </li><li> Almacenar casi el borde del cubreobjetos con los dedos enguantados y utilizar el borde largo de una aguja de 18 G para extender la solución a través de las películas de agarosa utilizando un movimiento circular de difusión. Continuar la difusión hasta que se evaporó la solución. Nota: Tenga cuidado de la punta de la aguja. </li><li> Colocar las películas de polímero en un lado de polímero placa de Petri de plástico hacia arriba y poner la placa de Petri en un desecador de vacío de la casa estándar cubierto con papel de aluminio (para evitar photobleaching de la esfingosina marcada) durante al menos 1 h para eliminar totalmente cualquier disolvente residual. </li></ol> 4. Formación de Polymersomes <ol><li> Adherir una coverwell, ya sea un polidimetilsiloxano hecho en casa (PDMS) bien (a ~ 0,5 cm de espesor de bloques de PDMS curado con ~ 1 cm de diámetro de la parte media troquelan) o una disponible en el mercado, así que el cubreobjetos recubierto con la película de polímero. Pulse el coverwell suavemente sobre el cubreobjetos recubierto con polímero con el polímero hacia arriba hasta que se forma un sello hermético entre la coverwell y el cubreobjetos. Tenga cuidado de no presionar demasiado y romper el cubreobjetos. </li><li> Añadir la solución de rehidratación 200-500 l (agua está muy bien, pero una serie de tampones o medios de comunicación también funciona) a la cámara (volumen de rehidratación depende del tamaño de la coverwell adherido). </li><li> Crear una cámara de humedad para disminuir la evaporación de la solución de rehidratación. Coloque un Kimwipe laminado, húmedo a lo largo de los bordes de una placa de Petri de vidrio. Coloque la película de polímero con el coverwell adherido a la cámara de humedad y cubrir con una tapa. Cubrir la placa de Petri con papel de aluminio para reducir al mínimo photobleaching. Lugarla placa de Petri sobre una placa caliente ajustada a 40 ° C durante al menos 30 min. </li><li> Ajuste la temperatura de la placa caliente durante la rehidratación a partir 24-70 ° C para ajustar el tamaño de las vesículas formadas (Figura 5). 70 ° C es cerca de la Tm de la agarosa por lo que se debe tener precaución cuando se avanza más allá de esta temperatura. </li></ol> 5. Caracterización de polímerosomas de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) <ol><li> Mueva el cubreobjetos con el adherido coverwell directamente a un microscopio invertido para la imagen. </li><li> Seleccione el conjunto de filtro adecuado en función de los lípidos fluorescente incluido en la solución de polímero. Para lípidos marcados con rodamina dopados en las soluciones de polímeros, utilizar un filtro de 560/25 nm de excitación y un filtro de 607/36 nm de emisión, o conjuntos de filtros comparables. </li><li> Utilice un objetivo de aceite 100X para concentrarse en la superficie superior del cubreobjetos en la que se adhieren los polímerosomas. Si los polímerosomas son especialmentegrandes (&gt; 20 micras) o si la película de polímero es demasiado gruesa, un objetivo de potencia más bajo (por ejemplo, 40X) se debe utilizar para visualizar mejor los polímerosomas. </li><li> Identificar los polímerosomas utilizando microscopía de fluorescencia. Identificar polímerosomas por la vesícula característica hueco, esférica con un diámetro&gt; 5 micras. </li><li> Caracterizar fluidez de la membrana mediante la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) en un microscopio de fluorescencia que contiene un condensador ajustable. Debido a la naturaleza adherente y apretado embalaje de polímerosomas sobre los sustratos, el movimiento natural de los polímerosomas está limitado, el aumento de la calidad de imagen FRAP. <ol><li> Enfocar el microscopio en el polimersoma de interés. Cierre el condensador a una pequeña región y asegurar que el borde de una polimersoma es dentro de la región de imagen de interés. </li><li> Aumentar la exposición de la cámara y asegurar todos los filtros de densidad neutra se retiran para photobleach efectivamente la región de interés. Permitir que la membrana fl<html> fluorescencia intensidad para photobleach durante 30-60 seg o hasta que la intensidad de la fluorescencia disminuye significativamente. </li><li> Apagar la lámpara y abra completamente el condensador. Disminuir la exposición a los valores de partida y comenzar de inmediato la captura de imágenes cada 30 segundos durante 3 minutos. </li><li> Calcular los coeficientes de difusión de membrana utilizando métodos estándar 12. Si la región blanqueada recupera la intensidad de fluorescencia dentro del 3-5 min, esto indica que la membrana es fluido. </li></ol></li></ol> 6. Caracterización de polimersoma Tamaño <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" /> Figura 6. Proceso para el análisis del tamaño de polímerosomas utilizando software de imagen. Paso a paso las instrucciones sobre cómo medir el diámetro de las vesículas formadas. El usuario debe conocer las unidades de calibración en píxeles / m del microscopio usado.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <ol><li> Abrir las imágenes adquiridas de polímerosomas en el software de análisis de imagen 13. </li><li> Establecer la escala de la imagen haciendo clic en el cuadro desplegable y analice la &quot;escala de conjunto&quot; clic. <ol><li> Calibrar la báscula para el microscopio utilizando métodos estándar (es decir, un micrómetro). </li><li> Rellenar las unidades de calibración y haga clic en &quot;ok&quot;. </li></ol></li><li> Haga clic en la caja de herramientas de línea y dibujar una línea que atraviesa el diámetro de una vesícula. </li><li> Recoge las mediciones de longitud haciendo clic en el cuadro analice desplegable y haciendo clic en &quot;medida&quot;. </li><li> Continuar midiendo las vesículas individuales siguiendo el procedimiento anterior y se añadirá a la ventana de mediciones de datos cada nueva medición. </li><li> Pulse la tecla &quot;Ctrl + D&quot; después de dibujar cada línea y la medición de la longitud para imprimir la línea trazada en elimagen por lo que es fácil el seguimiento de los cuales han sido analizados vesículas. </li></ol>

<ol>
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Sandia National Laboratories is a multi-program laboratory managed and operated by Sandia Corporation, a wholly owned subsidiary of Lockheed Martin Corporation, for the U.S. Department of Energy's National Nuclear Security Administration under contract DE-AC04-94AL85000.

Polímerosomas están llegando a ser ampliamente explorados como miméticos de membrana biológica. Las propiedades robustas y versátiles de polímeros los hace muy atractivos para los estudios que requieren funcionalización membrana, longevidad y capacidad de respuesta sintonizado. Los métodos tradicionales para la formación de polímerosomas de tamaño gigante 9,10 (&gt; 4 micras) son mano de obra intensiva y requieren equipos costosos y especializados. A continuación, presentamos por primera vez, un método rápido, versátil y robusto para la formación de polímerosomas de tamaño gigante que utilizan reactivos de laboratorio de bajo costo estándar y el equipo. El uso de la rehidratación en gel asistida, polímerosomas unilamelares se pueden formar rápidamente (&lt;30 min), en una variedad de soluciones de rehidratación (incluyendo medios de cultivo celular) y con una variedad de diferentes polímeros (datos no mostrados). No se observó la formación de vesículas multilamelares o asimétricos utilizando esta técnica. A lo largo de este trabajo, se utilizó poli (óxido de etileno) - poli b- (butadieno) (PEO-PBD, EO 22 -BD 37) copolímero de dibloques neutro. Muchas composiciones de polímeros diferentes (incluyendo copolímeros de dos bloques cargados) funcionan bien con este método (que no se muestra). Sin embargo, algunos copolímeros de tres bloques disponibles en el mercado y copolímeros de bloque doble de peso molecular más alto (~&gt; 5.000 Dalton) no forman polímerosomas distintas. Para todos los experimentos en este manuscrito, una baja concentración de lípido marcado se dopado en las soluciones de polímeros sólo para fines de visualización. Otros métodos para la visualización, incluyendo polímeros funcionalizados directamente con un colorante fluorescente también se pueden utilizar. Polímerosomas mismo modo se pueden obtener imágenes con microscopía de campo claro, aunque microscopía de fluorescencia proporciona una mayor resolución. La mayoría de las modificaciones menores en el protocolo normalmente no alteran los resultados. Por ejemplo, pequeñas diferencias en la concentración de la solución de polímero extiende sobre los cubreobjetos no alteran la formación del polímero fILM formado. Aunque no se determinó el intervalo de concentración completa, la formación polimersoma se producirá con éxito con una amplia gama de concentraciones de película de polímero (por ejemplo, 1 a 10 mg / ml). Sin embargo, hay algunas alteraciones de protocolo que no afectan negativamente a la formación de polimersoma. El más notable es que los cubreobjetos de vidrio redondos (en lugar de cuadrada) en consecuencia muy pobre formación de polímerosomas. Atribuimos esto a la capa extremadamente uniforme de agarosa en el cristal que en realidad impide la formación de polímerosomas. Uno de los desafíos más notables de esta técnica es la capacidad de recuperar los polímerosomas de la superficie con un alto rendimiento. Hay ciertos casos en los que la eliminación de los polímerosomas de la superficie original puede ser ventajosa. Debido a la alta fluorescencia de fondo de la película de polímero deshidratado, eliminando polímerosomas individuales y adherirse a limpiar cubreobjetos aumentará la calidad de imagen y caracterización (particialmente durante el análisis FRAP). Para ello, pipeteado suave con una punta de pipeta en la que al final se ha cortado se desorber los polímerosomas de la superficie (aunque el número de vesículas recuperados es significativamente menor que las formadas originalmente). Polímerosomas entonces se pueden colocar en las superficies cubreobjetos modificados, lo que permite la polimersoma para interactuar con el nuevo cubreobjetos. Típicamente, para neutros polímerosomas PEO-PBD, cubreobjetos tratados con ozono durante 15 min permiten que los polímerosomas a caer a la superficie de formación de imágenes. Se requiere modificación de la superficie diferente para diferentes composiciones polimersoma (por ejemplo, negativa o positivamente cargado polímeros). La mayoría de los materiales utilizados en este protocolo son almacenados y utilizados con éxito durante días o semanas. La agarosa solidificada se puede recalienta y volver a utilizar hasta que la agarosa comienza a tener agregados incluso después de la ebullición, o de la agarosa solidificada comienza a secarse. Los cubreobjetos con películas de agarosa secos se pueden almacenar y usodía indefinidamente (por ejemplo, meses). El polímero disuelto en cloroformo se puede almacenar a -20 ° C durante varios meses. Una vez que la película de polímero se seca en las películas de agarosa, sin embargo, las películas necesitan ser almacenados bajo vacío y se utiliza dentro de las dos semanas (no se determinó directamente almacenamiento a largo plazo, pero hay diferencias notables en polímerosomas formadas a partir de películas de polímero mayor que dos semanas). Utilizando el protocolo de rehidratación en gel asistida que aquí se presenta, cientos de polímerosomas forma uniforme-se forman rápidamente con sólo unas pocas horas de trabajo de parto usando equipo estándar de laboratorio y reactivos de bajo costo. Además, polímerosomas se pueden formar en una variedad de soluciones tampón fisiológicas y de composiciones de polímero diferentes (no se muestra). Pequeñas alteraciones en el método no alteran negativamente la formación de polímerosomas, haciendo que la rehidratación en gel con ayuda de una técnica versátil y accesible para los científicos variando de correo técnicaXpertise. La posibilidad de crear fácilmente polímerosomas gigantes en la escala de tamaño de las células es esencial para la construcción de sistemas similares a células artificiales. La facilidad de uso y la versatilidad de la rehidratación en gel asistida para hacer estos polímerosomas ofrece un gran avance en el campo biomimético para la creación de sólidos imita de la membrana celular. Por ejemplo, usando esta técnica, las estrategias para la encapsulación de los diferentes componentes intracelulares, la funcionalización del polímero con las proteínas y la incorporación de proteínas de transporte de membrana de la membrana celular, sólo para nombrar unos pocos, puede ser diseñado para construir células artificiales a base de polimersoma.

Creación de vesículas sintéticas, de tamaño de células gigantes unilamelares (GUVs) es de creciente interés en la reconstrucción in vitro de diferentes procesos celulares para construir un marco para la generación de un sistema de célula de 1,2 como artificial. Mientras GUVs compuestas de membranas lipídicas son excelentes imitadores de membranas naturales, biológicos, que son inestables frente a las fluctuaciones ambientales y tienen una vida útil bastante corta. Debido a estas limitaciones, los copolímeros de bloques anfifílicos se han utilizado como imita de lípidos para formar vesículas de polímero, o polímerosomas. Dentro de este contexto, polímerosomas son ventajosos en el desarrollo de sistemas de células biomiméticos debido a su mayor estabilidad 3, versatilidad química 4,5 y rasgos físicos modificables 6 - 8. Los métodos actuales para formar polímerosomas de tamaño gigante incluyen electroformation 9 y rehidratación con plantilla de 10, ambos de which consumen mucho tiempo, los equipos de trabajo intensivo, requieren competencias específicas y producir bajos rendimientos de polímerosomas gigantes intactas. Un método de rehidratación gel asistida sencilla fue desarrollado recientemente para la producción de lípidos GUVs 11. A continuación, describimos una adaptación de la técnica de rehidratación en gel asistida para crear polímerosomas gigantes con composiciones de polímeros diferentes, tamaño controlado, y en diversas composiciones de amortiguamiento. En pocas palabras, el 1% w / v películas estándar electroforesis en gel de agarosa de ADN se deshidrató en un cubreobjetos de vidrio. soluciones de polímero preparado en cloroformo continuación, se extienden a través de la película de agarosa deshidratado y se dejó evaporar. Después de la eliminación completa del disolvente, las películas de polímero se rehidratan en el tampón de elección con un calentamiento moderado (40-70 ° C) y el gigante (&gt; 4 micras) polímerosomas tamaño se forman dentro de 30 min. Este método produce rápidamente cientos de polímerosomas totalmente intactos y bien formadas utilizando equipos de laboratorio estándar y reagents a un costo mínimo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema que representa el método de rehidratación en gel asistida. Polímerosomas gigantes compuestas de un copolímero de dos bloques se forman después de ~ 30 minutos de rehidratación. El bloque hidrófilo se denota en magenta y el bloque hidrófobo se denota en verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 guage needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD-305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm square coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>A standard agarose for DNA gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>288306-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commerical coverwell</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70336</td>
			<td>Press-to-Seal Silicone Isolators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Free Download: http://fiji.sc/Fiji&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vial with Teflon Lid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66009-556</td>
			<td>1.9mL capacity, case of 144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liss-rhodamine B PE Lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150C</td>
			<td>1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td>10.2 cm x 38.1 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940)</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P2904-BdEO</td>
			<td><a href="http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pastic Petri Dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon tape</td>
			<td>VWR</td>
			<td>300001-057</td>
			<td>1/2&#34; width</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forming giant-sized polymersomes using gel-assisted rehydration

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (&gt; 4 &#181;m) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (&gt;4 &#181;m) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (&gt;100 &#181;m).

Polímerosomas se formaron mediante el procedimiento descrito anteriormente (Figura 1) y el equipo de laboratorio común se muestra en la Figura 2. Polímerosomas se rehidrataron con agua desionizada (Figura 3) y captación de imagen sobre un microscopio invertido de epifluorescencia en el uso de un objetivo de aceite 100X. Tenga en cuenta que si polímerosomas no son visibles, podrían haber formado en tallas más grandes para capturar con un objetivo de aceite de 100X; puede necesitar ser utilizado en lugar de un objetivo de potencia inferior. Una de las ventajas del uso de la rehidratación en gel asistida es la versatilidad de formar polímerosomas en una variedad de soluciones de rehidratación. Polímerosomas se formaron con éxito en agua desionizada, un medio de mamífero completo de cultivo de células, las soluciones de sacarosa y dos soluciones tampón fisiológicamente relevantes (solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina tamponada con Tris (TBS)), como se muestra en la Figura 4. En condiciones estándar (rehidratacióncon agua a 40 ° C durante 1 hora), mayor que 70 ~ polímerosomas se encuentran típicamente por 40 x 40 m 2 campo de visión. Mientras que la producción de superficie de polímerosomas no es homogénea, hay docenas de campos de visión con este rendimiento representativo docenas. Además, polímerosomas eran estables en solución durante al menos 24 h. tamaño polímerosomas se sintoniza fácilmente mediante rehidratación películas de polímero a temperaturas variables. Polímerosomas formados en agua desionizada a RT tenían un diámetro medio de 2,9 ± 0,7 m. Como la temperatura aumenta durante la rehidratación, el tamaño medio de las polimersomas también aumenta (Tabla 1). A altas temperaturas (&gt; 60 ° C), polímerosomas formadas con tamaños incluso mayores que 100 micras (Figura 5). Todo el procesamiento de la imagen se completó con software de imágenes de código abierto (Figura 6).Imágenes recogidas fueron abiertos en el programa de software. El tamaño de píxel calibrado se ha introducido en la caja de escala establecida. Usando la herramienta de línea, las líneas se dibujan en todos los diámetros. Tras la extracción de cada línea individual, la longitud calibrada se midió y se agrega al cuadro de resultados. A continuación, los datos se pueden trazar en el software matemático de elección (por ejemplo, Excel, Prisma, origen, etc.) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" /> . Figura 2. Cuadro de los materiales de laboratorio comunes y económicos necesarios para la formación de polímerosomas Los elementos necesarios son: Parafilm, un 18,5 g de agujas, de polímero en cloroformo u otro disolvente apropiado, una punta de pipeta de 1.000 l, un matraz Erlenmeyer, pinzas, agarosa, 25 mm cubreobjetos cuadrados, pozos de imagen PDMS y una placa de Petri de vidrio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para</a>ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" /> Figura 3. Imágenes del método de rehidratación gel asistida. Disuelto agarosa se ​​extiende sobre un cubreobjetos cuadrado 25 mm hasta una aún capas de película todo el cubreobjetos. Los cubreobjetos se ponen entonces en una incubadora a 37 ° y la película es deshidratado. Una solución de polímero se deposita sobre la película de agarosa deshidrata y se extendió el uso de una aguja en un movimiento circular. El cubreobjetos se coloca a continuación en un desecador O / N se evapore totalmente cualquier residuo de disolvente. Por último, y cámara de imágenes se adhiere al sustrato y polímeros se rehidratan con solución de elección y se coloca en una placa de Petri a 40 ° C durante por lo menos 25 minutos para permitir la formación de polímerosomas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </p<html> &gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" /> Figura 4. polímerosomas pueden formar en una variedad de diferentes tampones. Películas de polímero PEO-PBD se rehidrataron con el tampón indicado a 40 ° C durante 1 hr. Barra de escala = 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" /> Figura 5. El aumento de la temperatura durante la rehidratación aumenta el tamaño de las polimersomas. Imágenes de epifluorescencia representativos de polímerosomas formados en agua a las temperaturas de rehidratación indicados. El aumento de temperatura produce polímerosomas más grandes. Barra de escala = 10 micras._blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Temperatura (° C) </td><td> Tamaño promedio (m) </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 2,93 ± 0,7 </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 5,76 ± 2,5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 6,65 ± 2,4 </td></tr><tr><td> 60 </td><td> 11,46 ± 5,8 </td></tr><tr><td> 70 </td><td> 14.04 ± 7.0 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. El aumento de la temperatura durante la rehidratación resultados en el aumento de tamaño polimersoma. Los diámetros medios de más de 100 polímerosomas en agua por diferentes condiciones de temperatura se calcularon y se representan aquí. El error es la desviación estándar.

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Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Formando polímerosomas de tamaño gigante Uso de rehidratación asistida-Gel

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.3K vistas.  Sandia National Laboratories. We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Investigación

Bioingeniería

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Glutamine Flux Imaging Using Genetically Encoded Sensors

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for biological molecules became available in the past 15 years, some of which became indispensable tools that are used routinely in many laboratories.
One of the exciting applications of genetically encoded sensors is the use of these sensors in investigating cellular transport processes. Properties of transporters such as kinetics and substrate specificities can be investigated at a cellular level, providing possibilities for cell-type specific analyses of transport activities. In this article, we will demonstrate how transporter dynamics can be observed using genetically encoded glutamine sensor as an example. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed.

This article will demonstrate how to monitor glutamine dynamics in live cells using FRET. Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. Experimental design, technical details of the experimental settings, and considerations for post-experimental analyses will be discussed for genetically encoded glutamine sensors.

Glutamina Flux Imaging utilizando sensores codificados genéticamente

Genetically encoded sensors allow real-time monitoring of biological molecules at a subcellular resolution. A tremendous variety of such sensors for ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

El uso de adhesivo Patrones para construir dispositivos de microfluidos de papel 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Pattern-based Search of Epigenomic Data Using GeNemo

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and other functional genomic data are very limited. GeNemo is the first online search tool that accomplishes this goal. Users input their functional genomic data in the Browser Extensible Data (BED), Peaks, and bigWig formats, and may search for data in any of the three formats. Users may specify which types of datasets to search against, choosing from a variety of online datasets, with the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) representing different epigenomic marks, transcriptional factor binding sites, and chromatin hypersensitivities or accessibilities in specific cell types, and developmental stages or species (mouse or human). GeNemo returns a list of genomic regions with matching patterns to the input data, which may be viewed in the browser as well as downloaded in the BED file format. The upgraded GeNemo has improved graphical display, has more robust interface, and is no longer prone to errors due to changes in the University of California, Santa Cruz (UCSC) genome browser. Troubleshooting steps for common problems are discussed. As the amount of functional genomic data is expanding exponentially, there is a critical need to develop and refine new bioinformatic tools such as GeNemo for data analyses and interpretation.

Unlike DNA sequence data, epigenomic data are not readily subjected to text-based searches. Presented here are the procedures to use an upgraded version of GeNemo, a web-based bioinformatics tool, to conduct pattern-based searches for similarities in epigenomic data comparing available online databases including Encyclopedia of DNA Elements with user&#39;s data.

Búsqueda basada en el patrón de datos epigenómica GeNemo

Compared with the robust text-based search tools for genomic or RNA sequencing data, current methodologies for pattern-based searches of epigenomic and ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Fabricación de Nanopattern gradiente térmico Nanoimprinting técnica y proyección de la respuesta de células formadoras de colonias endoteliales humanas

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

Alta resolución con motivos Biofilm deposición utilizando pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies for the detection of CTCs include flow cytometry, microfluidic devices, and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Despite recent advances, methods for the detection of early ovarian cancer metastasis still lack the sensitivity and specificity required for clinical translation. Here, a novel method is presented for the detection of ovarian circulating tumor cells by photoacoustic flow cytometry (PAFC) utilizing a custom three dimensional (3D) printed system, including a flow chamber and syringe pump. This method utilizes folic acid-capped copper sulfide nanoparticles (FA-CuS NPs) to target SKOV-3 ovarian cancer cells by PAFC. This work demonstrates the affinity of these contrast agents for ovarian cancer cells. The results show NP characterization, PAFC detection, and NP uptake by fluorescence microscopy, thus demonstrating the potential of this novel system to detect ovarian CTCs at physiologically relevant concentrations.

A protocol is presented to detect circulating ovarian tumor cells utilizing a custom-made photoacoustic flow system and targeted folic acid-capped copper sulfide nanoparticles.

Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Patrones simples, asequibles y modulares de células utilizando ADN

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...