Diese Forschung wurde von der Grundlagenforschung Forschungsprogramm durch die National Research Foundation of Korea (NRF) vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (2013068067) finanziert unterstützt; von Brain Korea 21 Graduiertenprogramm des koreanischen Ministeriums für Bildung, Wissenschaft und Technologie, Seoul National University Hospital, der koreanischen Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (Nr. 3420130290) und der National Natural Science Foundation of China (NSFC 31.460.265; NSFC 81.260.035).

Das Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die UN-National Institutes of Health veröffentlicht (NIH Publication No. 85-23, überarbeitet 1996). Es wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Seoul National University (IACUC Zulassung Nr .: SNU-101213-1) zugelassen. 1. Puffer Vorbereitung (Tabelle Materialien und Geräte) <ol><li> Bereiten 300 ml frisches Isolationslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl 2 3,5; Glucose, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; Taurin, 20; pH 7,4 mit NaOH). </li><li> Herstellung von 100 ml frischem Aufbewahrungslösung am Tag des Experiments (in mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO 4 5; CaCl 2 0,2; Natrium-Pyruvat 5; 5,5 Glucose; Taurin 20; HEPES 10; Mannit 29; pH 7,4 mit NaOH). </li><li> Bereiten 1L Perfusionslösung (in mM: NaCl, 141,4; KCl, 4; NaH 2 PO 4, 0,33; MgCl 2, 1; HEPES, 10; Glucose, 5,5; CaCl 2, 1,8; Mannit, 14.5; pH 7,4 mit NaOH). </li><li> Herstellung von 30 ml Kollagenase - Lösung 1 durch Kollagenase - Zugabe (1 mg / ml), Protease (0,1 mg / ml), Rinderserumalbumin (BSA, 1.67mg / ml) und Ca 2+ (0,05 mM) 25 ml Isolations Lösung. </li><li> Es werden 20 ml Kollagenase - Lösung 2 durch Kollagenase Zugabe (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml) und Ca 2+ (0,05 mM) zu 16,7 ml Isolierungslösung. </li><li> Vorbereitung 40 ml BSA-Lösung durch Zugabe von 0,4 g BSA zu 40 ml Isolationslösung. Separate 10 ml und 30 ml in zwei Bechern. Hinzufügen Ca 2+ zu 30 ml BSA - Lösung so , dass die endgültige Ca 2+ -Konzentration in der BSA - Lösung beträgt 1 mM. </li></ol> 2. Vorbereitung für die Isolierung der linksventrikulären (LV) Myozyten <ol><li> Übertragen 8-12 Wochen alte, männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten in sauberen Transportkäfigen aus dem Tier Anlage zur Herstellung und Isolierung Raum. </li><li> Hessen zwei Wasserbäder bis 37 o C. Hinweis: Verwenden Sie ein Wasserbad für das Wasser - ummantelten Reservoir und den Perfusionsschläuche des Langendorff-Perfusionssystem. Verwenden Sie die anderen Wasserbad Myokardgewebe Stämme, um zu agitieren einzelnen Myozyten zu trennen. </li><li> 5 ml und 3,3 ml BSA - Lösung (ohne Ca 2+) zu 25 ml Kollagenase - Lösung 1 und 16,7 ml Kollagenase - Lösung 2 , um das Volumen auf 30 ml zu begrenzen und 20 ml. </li><li> Hinzufügen Isolationslösung (100 ml) und Kollagenase - Lösung 1 (30 ml) zu Spalte 1 (Col. 1) und der Spalte 2 (Col. 2) in der Langendorff - Perfusionssystem, bzw. (1A). </li><li> Oxydieren das Isolationslösung und Kollagenase - Lösung 1 in Spalte 1 und Spalte 2 über das Sauerstoffverbindungsrohr in der Langendorff - Perfusionssystem (1A). In ähnlicher Weise oxygenate Kollagenase - Lösung 2 und die BSA - Lösung im Schüttelwasserbad mit 100% O 2 über dieSauerstoff Verbindungsrohr. </li></ol> 3. Isolierung von LV Myozyten <ol><li> Anesthetize eine SD - Ratte über intraperitoneale Injektion von Natriumpentobarbital (30 mg / kg) und das Anästhetikum Status durch Zeh bestätigen Kneifen und der Mangel an Rückzug Reflexion. </li><li> Bewegen Sie die Ratte auf eine Dissektion Fach. In der Rückenlage, sichern Sie die vier Beine an den Seiten des Körpers mit Klebeband. </li><li> Bewerben Brust-Mitte axiale Einschnitte mit chirurgischen Schere, um die Truhe zu öffnen, um sicherzustellen, das Herz nicht zu beschädigen. Verwenden Sie ein anderes Paar saubere Schere , um das Herz von den Verbindungsgefäße zu sezieren (zB obere und untere Hohlvene, Lungengefäße und Aorta) und Perikardmembran 13. </li><li> Lassen Sie einen Teil der Aorta eine ausreichende Länge (5-8 mm), klemmen die Aorta mit einer feinen Pinzette, und montieren Sie schnell die Kanüle des Langendorff - Perfusionssystem innerhalb von 1 min (1A). Binden Sie Nähfaden 4/0 dicht über der Aorta. </li><li&gt; Schalten Sie das Ventil auf Spalte 1 und das isolierte Herz mit vorgewärmten und mit Sauerstoff angereicherten Isolationslösung für 10 min (Perfusions-Rate: 12-14 ml / min) perfuse. Schalten Sie das Ventil auf Spalte 1, schalten Sie das Ventil auf Spalte 2 und perfuse das Herz mit Kollagenase-Lösung 1 für 8 - 10 min. </li><li> Abmontieren verdaut Herz durch die Aorta schneiden und übertragen es durch Halten der Aorta mit einer Pinzette in den Kolben mit frischen Isolationslösung (Abbildung 1Bi). Verwenden einer feinen Schere und Pinzette die meisten der LV freien Wand zu schneiden (einschließlich des Septum) in kleinere Stücke (~ 22 mm, Abbildung 1Bii). </li><li> Übertragen Sie die Stücke in einen Kolben vorgewärmte und mit Sauerstoff angereicherte frische Kollagenase - Lösung 2 (Abbildung 1Biii) enthält. Schütteln für 10 min. Halten Sie sich an die myocyte haltigen Kollagenase-Lösung 2 liefert Sauerstoff. </li><li> Bewegen Sie den myocyte - Suspension auf eine 10 ml Zentrifugenröhrchen Tropfer mit einem Saugball mit und fügen Ca 2+ - enthält BSA - Lösung (1: 1 in Volumen). Zentrifuge bei 30 g für 2 min und den Überstand verwerfen. Resuspendieren des Pellets Myozyten in 5 ml BSA-Lösung. Zentrifuge und den Überstand verwerfen. </li><li> Disperse die myocyte Pellets und halten Myozyten in 10 ml vorge mit Sauerstoff angereicherte Speicherlösung bei RT (Abbildung 1Biv-vi). </li><li> Wiederholen Sie die Verfahren (Schritte 3,7-3,9) mit dem restlichen LV Gewebe in den Kolben. Hinweis: Bewahren Sie die Verfahren zu wiederholen (Schritte 3,7 bis 3,9) erneut, bis die meisten der LV Gewebe verschwindet eine gute Ausbeute an Myozyten zu erhalten. </li><li> Halten Sie die Myozyten in Speicherlösung für 6-8 Stunden bei RT bis zum Ende der Experimente. </li></ol> 4. Gleichzeitige Messungen intrazellulärer Ca 2+ Transienten und Muskelzellen Kontraktions <ol><li> Last LV Myozyten mit dem Acetoxymethylester Fura-2 AM (2 uM). Hinweis: Führen Sie alle Ladevorgänge und Experimente mit geladenen Myozyten in einem dunklen Rohr (Abbildung 1Bvii). <ol><li> Centrifuge die Myozyten-Suspension (1 ml) bei 2.000 xg für 10 sec. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren die myocyte Pellet in 1 ml Tyrode - Lösung mit einer niedrigen Ca 2+ Konzentration (250 &amp; mgr; M, Tisch Materialien und Geräte). </li><li> In Fura-02.00 und Poloxamer 407 (2 ul), sanft die myocyte Suspension zu dispergieren, und halten Sie die Mischung bei RT (20 bis 24 ° C) für 15 Minuten (Abbildung 1Bvii). </li><li> Zentrifuge die Mischung für 5 Sekunden, um den Überstand verwerfen und die Myozyten - Pellet in 1 ml Perfusionslösung 2+ , enthaltend 500 uM Ca dispergieren. Nach 10 min Zentrifugation der Mischung für 5 Sekunden und den Überstand verwerfen. </li><li> In frischen Perfusions - Lösung (500 &amp; mgr; M Ca 2+, 1 ml) und halten Sie die Fura-02.00 - geladen myocyte Pellet in dieser Lösung für Aufnahmen. </li></ol></li><li> Messung des LV Myozyten Kontraktion und intrazellulären Ca 2+ <ol><li> Vor der Aufnahme, füllen Sie das Perfusions-Schlauch, der durch eine läuftWassermantel mit der Tyrode - Lösung, die auf 36 o C vorgewärmt ist </li><li> Legen Sie ein paar Tropfen des Fura 02.00 - geladen LV myocyte Suspension auf die Kammer eines invertierten Fluoreszenzmikroskop 5 - 8 min. perfuse langsam die Tyrode-Lösung (2,2 ml / min). </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche &quot;Start&quot; auf der Frontplatte des digitalen Stimulator Feldstimulation (2 Hz) starten. Hinweis: Die Ausgangsspannung (10 V, 5 msec Dauer) wird in der Kammer durch Platindrähte mit den Myozyten aufgebracht auf jeder Seite der Kammer positioniert ist. <ol><li> Wählen Sie Myozyten stabil, dass Vertrag (nicht diejenigen, die Anzeige Hyper- oder Hypo-Kontraktion) für die Aufnahme. </li></ol></li><li> Stellen Sie die myocyte der Wahl in der horizontalen Position des videobasierten Sarkomers Detektionssystem und stellen Sie den Fokus des Mikroskops optimale Bilder von Sarkomere zu erhalten. Positionieren Sie den lila rechteckigen Kasten auf dem Gebiet, in dem klar Sarkomere klar, bis die durchschnittliche beobachtet werdenvon Sarkomers Längen (rot Peak) zeigt eine singuläre scharfe Spitze (2A, unteres Bild). </li><li> Aufzeichnen der Änderungen der Sarkomerlänge in Reaktion auf Feldstimulation (2A und B). Hinweis: Verwenden Sie die geladenen Myozyten in 1 - 2 Stunden. </li><li> Stellen Sie die Blende der Kamera so , dass das Feld in der videobasierten Sarkomers Detektionssystem ist die Größe der Myozyten (2A). Stimulieren die Myozyten mit einer Anregung bei 360 nm / 380 nm und Emission bei 510 nm (Erfassungsfrequenz 1000 Hz). Nehmen Sie Sarkomerverkürzung und die Fura2 AM Verhältnis mit Feldstimulation (2B). </li></ol></li></ol> 5. Bewertung der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit <ol><li> Der Mittelwert der Sarkomers Längen und Ca 2+ Transienten im Steady-State (10 - 20 Spuren) , und zeichnen Sie die Phase-Ebene Schleife des Fura-2 - Verhältnis vs. Sarkomerlänge des gleichen myocyte (beide mit Messwerts und Deltaänderungen; 2C). </li><li> In jedem Plot definieren Fura -2 - Verhältnis bei 50% Relaxation (EC 50, 2C). Vergleichen Sie sowohl die Schleife und EC 50 von jeder Intervention. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Hier beschreiben wir die Protokolle Änderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in einzelnen isolierten Kardiomyozyten zu bewerten und betonen die Bedeutung der Messung dieser Parameter neben elektrophysiologischen Eigenschaften, die intrazelluläre Ca2 + Transienten und myofilament Dynamik. Dies liegt daran, die Aufnahmen von einem oder zwei der Parameter können die Mechanismen zugrunde liegenden Herzkontraktion und Entspannung nicht expliziert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren , di...

Kardiale Erregungs Kontraktion (EC) Kopplung ist das Grundschema für die mechanischen Eigenschaften des Myokards Analyse, dh die kontraktile Funktion des Herzens 1,2. EC Kopplung durch Membrandepolarisation sekundär zu den Aktivitäten von sarkolemmalen Ionenkanäle (beispielsweise die spannungsabhängigen Na + Kanal, der durch Patch-Clamp - Techniken gemessen werden kann) eingeleitet wird. Nachfolgende Aktivierung von spannungsabhängigen L-Typ - Ca 2+ -Kanälen (LTCC) und Ca 2+ -Einstrom durch LTCCs den Großteil der Ca 2+ -Freisetzung durch Ryanodin - Rezeptoren (RyRs) auslösen, die cytosolische Ca 2+ -Konzentration von nanomolaren Erhöhung (nM ) (uM) Ebene mikromolar. Eine solche Erhöhung der cytosolischen Ca 2+ Ca 2+ fördert die Bindung an Troponin C (TnC) in dünnen Fäden und entlockt Konformationsänderungen des Filaments Komplex die Actin-Myosin - Wechselwirkung zu erleichtern , und erreicht myocardial Kontraktion 3. Umgekehrt wird die cytosolische Ca 2+ erneut uptaken zurück in das sarkoplasmatische Retikulum (SR) durch die Ca 2+ -ATPase in SR (SERCA2a) oder aus dem Myozyten über das Na + / Ca 2+ -Austauscher und dem Plasmalemma extrudiert Ca 2+ ATPase 1,2. Folglich stiftet der Rückgang der cytosolischen Ca 2+ Konformationsänderungen von dünnen Fäden wieder in den ursprünglichen Zustand, was zur Dissoziation von Aktin-Myosin und myocyte Entspannung 1-3. In diesem Schema wird die Aktivität von SERCA2a allgemein als die Geschwindigkeit der myokardialen Entspannung zu bestimmen , weil es für die 70 - Konten - 90% der cytosolischen Ca 2+ Entfernung in den meisten Säugetierherzzellen 1. Als solche anormalen Handhabung Ca 2+ von LTCC, RyR und SERCA2a usw. hat die primären Mechanismen für beeinträchtigte Kontraktilität und Entspannung in das kranke Herz 1-4 betrachtet. 2+ , die Funktionen als der Bote in der EG - Kopplung entfallen rund 1% der gesamten intrazellulären Ca 2+ und die Mehrheit der Ca 2+ gebunden ist , an intrazelluläre Ca2 + Puffer 5,6. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass verschiedene Ca 2+ Puffer in Herzmyocyten reichlich vorhanden sind, beispielsweise Membran - Phospholipiden, ATP, Phosphokreatin, Calmodulin, Parvalbumin, Myofibrille TnC, Myosin, SERCA2a und Calsequestrin in der SR. 5,6,7. Unter ihnen sind SERCA2a und TnC die vorherrschenden Ca2 + Puffer 5,6,7. Weiterhin 2+ Ca seiner Bindungspuffern während twitch ein dynamischer Prozess ist (beispielsweise 30-50% der Ca 2+ bindet an TnC und distanzieren von ihm während Ca 2+ Transienten 7) und die Änderung in Ca 2+ Bindungs ​​Ursache zusätzlicher &quot;Freigabe&quot; von freiem Ca 2+ in das Cytosol führt zu den Veränderungen der intrazellulären Ca 2+ concentration. Folglich Störung der intrazellulären Ca 2+ Ebene induziert abnorme myofilament Bewegungen, die die Vorläufer der Kontraktions Dysfunktion und Arrhythmien 8,9. Viele Faktoren (sowohl physiologische und pathologische) können die Quellen der post-transkriptionalen Modifikationen myofilament Proteine ​​sein, die myofilament Ca 2+ Pufferung und myofilament 2+ 8-10 Empfindlichkeit Ca beeinflussen. Vor kurzem wurde berichtet , dass Mutationen in myofilament Proteine ​​, die die Ca 2+ erhöhen Bindungsaffinität und die intrazelluläre Ca2 + Handhabung, die Auslösung Pause abhängige Potenzierung von Ca 2+ Transienten, abnormal Ca 2+ Freisetzung und Arrhythmien 8. Im Einklang mit diesem Konzept haben wir auch , dass myofilament Ca 2+ Desensibilisierung bei hypertensiven Rattenherzen sekundär auf die Hochregulation der neuronalen Stickstoffmonoxid-Synthase mit erhöhten systolischen und diastolischen Ca 2+ Ebenen zugeordnet gezeigt11, die wiederum 12 die Anfälligkeit der LTCC auf Ca 2+ -abhängigen Inaktivierung erhöht. Daher ist myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit ein &quot;aktives&quot; Regulator der intrazellulären Ca 2+ Homöostase und Myozyten kontraktilen Funktion. Es ist notwendig geworden , Wechselwirkungen zwischen myofilament und Ca 2+ zu analysieren Proteine ​​für die gründliche Untersuchung von myocyte EG - Kopplung und die Herzfunktion Handhabung. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das die Veränderungen der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in isolierten Kardiomyozyten bewertet. Umfassende Analyse der intrazellulären Ca 2+ Profil, myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit und Kontraktion werden neuartige Mechanismen der myokardialen Mechanik raben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1136">
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">Sprague Dawley rat</td>
			<td style="width:131px;">Koatech</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;">8-12 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:315px;">Pentobarbital Sodium</td>
			<td style="width:131px;">Hanlim Pharmaceutical (Korea)</td>
			<td style="width:125px;">AHN901</td>
			<td style="width:565px;">Insurance code:645301220</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">NaCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S9625</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4504</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S8282</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H3375</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Glucose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G8270</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">MgCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">M2001</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mannitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M4125</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:315px;">MgSO4</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M5921</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P2256</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Taurine</td>
			<td style="width:131px;">Merck</td>
			<td style="width:125px;">8.08616.1000</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">71649</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Bovine Fetal Albumin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">A7906</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Collagenase Type 2</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:125px;">LS004177</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Protease</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P6911</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fura-2 (AM)</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:125px;">F1221</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Pluronic F127 20% solution in DMSO</td>
			<td style="width:131px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">P3000MP</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Shaking Water Bath</td>
			<td style="width:131px;">Chang Shin Scientific</td>
			<td style="width:125px;">Model: C-108</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:315px;">IonWizard Softwae Suite</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix Ltd</td>
			<td style="width:125px;">Experimental Builder</td>
			<td style="width:565px;">Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:315px;">Myocyte Calcium &#38; Contractility Recording System</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix Ltd</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Circulating Water Bath</td>
			<td style="width:131px;">BS-Tech</td>
			<td style="width:125px;">BW2-8</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:315px;">Myocyte Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Nikon</td>
			<td style="width:125px;">DIATPHOTO 200</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:315px;">MyoCam-S Power</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="119" rowspan="3" style="height:119px;width:315px;">Fluorescence &#38; Video Detection</td>
			<td rowspan="3" style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;">MyoCam-S</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:125px;">CFA300</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:125px;">PMT400</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:315px;">Fluorescence &#38; System Interface</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;">FSI700</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:315px;">Excitation Light Source</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;">mSTEP</td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:315px;">High intensity ARC Lamp Power supply</td>
			<td style="width:131px;">Cairn Reseach</td>
			<td></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:315px;">Filter wheel controller</td>
			<td style="width:131px;">IonOptix</td>
			<td style="width:125px;">GB/MUS200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;">Digital Stimulator</td>
			<td style="width:131px;">Medical Systems Corportion</td>
			<td>S-98 Mutimode</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compositions of Experimental Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Name</td>
			<td style="width:131px;">Company</td>
			<td style="width:125px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:565px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:315px;">Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">NaCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S9625</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 135</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4504</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5.4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H3375</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Glucose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G8270</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">MgCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">M2001</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 3.5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Taurine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">CB2742654</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 20</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">71649</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.4</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">NaCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S9625</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 120</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4504</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5.4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H3375</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 10</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Glucose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G8270</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5.5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.2</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Mannitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M4125</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 29</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">MgSO4</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M5921</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P2256</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Taurine</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">CB2742654</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 20</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:315px;">Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">NaCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S9625</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 141.4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">KCl</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4504</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 4</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">S8282</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.33</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">HEPES</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H3375</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 10</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Glucose</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G8270</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 5.5</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td>Concentration (mmol) 1.8&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">MgCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">M2001</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Mannitol</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">M4125</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 14.5</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Collangenase Solution 1</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Isolation Solution (30mL)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Collagenase Type 2</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:125px;">LS004177</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Protease</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P6911</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.05 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Collangenase Solution 2</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Isolation Solution (20mL)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Collagenase Type 2</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:125px;">LS004177</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 0.05 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">BSA solution</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:315px;">Isolation Solution (40mL)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:565px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">Bovine Fetal Albumin</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">A7906</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 400 mg</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:315px;">CaCl2</td>
			<td style="width:131px;">Biosesang</td>
			<td style="width:125px;">C2002</td>
			<td style="width:565px;">Concentration (mmol) 1mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of myofilament ca2+ sensitivity underlying cardiac excitation-contraction coupling

Herzinsuffizienz und Herzrhythmusstörungen sind die häufigsten Ursachen für Mortalität und Morbidität weltweit. Jedoch bleibt der Mechanismus der Pathogenese und myokardialen Funktionsstörung in dem erkrankten Herzen vollständig geklärt werden. Recent zwingenden Beweis zeigt , daß Änderungen in der myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit beeinflussen intrazellulärem Ca 2+ Homöostase und Ionenkanalaktivitäten in Kardiomyozyten, die wesentlichen Mechanismen , die für die kardialen Aktionspotentials und Kontraktion in gesunden und kranken Herzen. Tatsächlich Aktivitäten von Ionenkanälen und Transportern Herzaktionspotentiale zugrunde liegen (zB Na +, Ca 2+ und K + -Kanäle und der Na + -Ca 2+ Exchanger) und die intrazelluläre Ca 2+ Umgang mit Proteinen (z. B. Ryanodinrezeptoren und Ca 2+ -ATPase in Retikulum (SERCA2a) oder Phospholamban und seine Phosphorylierung) werden üblicherweise auf Evalu gemessenaßen die grundlegenden Mechanismen von Herz Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung. Beide elektrischen Aktivitäten in der Membran und die intrazelluläre Ca 2+ Veränderungen sind die Triggersignale von EC - Kopplung, wohingegen myofilament die Funktionseinheit der Kontraktion und Entspannung, und myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit ist zwingend notwendig , bei der Umsetzung von Myofibrillen Leistung. Dennoch wenige Studien inkorporieren myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in die funktionelle Analyse des Myokards , wenn es im Mittelpunkt der Studie. Hier beschreiben wir ein Protokoll , das Sarkomerverkürzung / re-Verlängerung und der intrazellulären Ca 2+ Ebene mit Fura-2 AM (ratiometrisch Erkennung) und bewerten die Veränderungen von myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit in Herzmuskelzellen aus Rattenherzen misst. Das Hauptziel ist , dass myofilament betonen Ca 2+ Empfindlichkeit sollte für mechanistische Analyse in Betracht EG Kupplung genommen werden. Umfassende Untersuchung von iauf den Kanälen, Ionentransporter, intrazellulärer Ca 2+ Handhabung und myofilament Ca 2+ Empfindlichkeit , die myocyte Kontraktilität in gesunden und kranken Herzen zu Grunde liegen wird für die Gestaltung wirksamer Strategien der translationalen und therapeutischen Wert wertvolle Informationen liefern.

LV Myozyten werden aus normalen und hypertensiven Rattenherzen isoliert. Stabförmige Myozyten mit klaren Riefen (die Sarkomere) und stabile Kontraktionen in Reaktion auf Feldstimulation werden als die optimale Myozyten zu sein und sind für die Aufnahmen (2A) ausgewählt. In dem Beispiel in F ild 2A gezeigt ist , -beladene a Fura 02.00 LV Myozyten ist horizontal und die Blende der Kamera positioniert ist , so eingestellt, dass die Myozyten der größte ...

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Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

Beurteilung der myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Empfindlichkeit Basiswert Cardiac elektromechanischen Kopplung

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

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Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

9.4K Aufrufe.  Seoul National University College of Medicine. This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts. 

Serie: Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Forschung

Biologie

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

Die Untersuchung der immunologischen Mechanismen Organtransplantatabstoßung

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Bildsequenzen

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Mess räumliche und zeitliche Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Beurteilung der myofilament Ca

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Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Die Untersuchung der immunologischen Mechanismen Organtransplantatabstoßung

Focal Ca^{2 +} Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Techniques for Imaging Ca^{2 +} Signaling in menschlichen Spermien

Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

Visualization of Vascular Ca^{2 +} Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

Automatisierte Analyse von dynamischen Ca

Mess räumliche und zeitliche Ca

Imaging Lokale Ca