Name: assessment of myofilament ca2+ sensitivity underlying cardiac excitation-contraction coupling
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
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この研究は教育科学技術省（2013068067）から資金提供を受け、韓国の国立研究財団（NRF）を介して基礎科学研究開発プログラムによってサポートされていました。脳韓国21大学院教育の韓国省の計画、科学技術、ソウル国立大学病院、高血圧の韓国学会（2013）、SKテレコム研究基金（なし。3420130290）と中国の国家自然科学基金からのことで（NSFC 31460265; NSFC 81260035）。

プロトコルは健康の国連国立研究所によって公開実験動物の管理と使用に関する指針に従っている（NIH公開番号85-23、1996年改訂）。これは、ソウル大学（IACUC承認番号：SNU-101213から1）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.バッファーの調製（表材料および装置） <ol><li> NaCl、135;のKCl、5.4;のMgCl 2、3.5;グルコース、5; HEPES、5;のNa 2 HPO 4、0.4;タウリン、20; pH値：MMにおける実験（当日に新鮮な分離溶液300mlを準備7.4 NaOHで）。 </li><li> CaCl 2 0.2; MgSO 4を5;のKCl 5.4、NaClを120ナトリウム-ピルビン酸5; 5.5グルコース、タウリン20; HEPES 10;マンニトール29; pHは7.4：MMにおける実験（当日に新鮮なストレージソリューションの100ミリリットルを準備）NaOHで。 </li><li> ;のKCl、4;のNaH 2 PO 4、0.33;上記MgCのNaCl、141.4：mMの中の灌流液の1Lを（準備L 2は、1。 HEPES、10;グルコース、5.5; CaCl 2、1.8;マンニトール、14.5; NaOHでpHを7.4）。 </li><li>分離を25 mlのコラゲナーゼ（1 mg / mlで）、プロテアーゼ（0.1 mg / mlで）、ウシ血清アルブミン（BSA、1.67mg / mlで）、およびCa 2+（0.05ミリモル）を添加することによって、コラゲナーゼ溶液1を30mlの調製溶液。 </li><li>分離溶液16.7 mlに、BSA（1.67 mg / mlで）、およびCa 2+（0.05ミリモル）を、コラゲナーゼ（1mg / ml）を添加することによって、コラゲナーゼ溶液2を20ミリリットルを準備します。 </li><li>分離溶液40mlにBSAを0.4gを添加することにより、BSA溶液40mlを調製します。 2ビーカーに10ミリリットルと30ミリリットルを区切ります。 BSA溶液中の最終Ca 2+濃度を1mMになるようにBSA溶液を30mlまでのCa 2+を加えます。 </li></ol>左心室（LV）筋細胞の単離2.準備<ol><li>調製および単離の部屋に動物施設からクリーンな輸送ケージに8-12週齢、雄のSprague-Dawley（SD）ラットを転送します。 </li><li> H37℃。に2水浴を食べます 注：水のいずれかを使用水浴 - ジャケット付きリザーバとランゲンドルフ灌流システムの灌流チューブを。単一の筋細胞を分離するために、心筋組織のトランクを攪拌する他の水浴を使用してください。 </li><li>それぞれ、30ミリリットルと20ミリリットルにボリュームを補うために5ミリリットル及びコラゲナーゼ溶液1と16.7ミリリットルコラゲナーゼ溶液2の25ミリリットルに（のCa 2+なし）BSA溶液の3.3ミリリットルを追加します。 </li><li>それぞれ、ランゲンドルフ灌流システムにおける分離溶液（100ml）およびコラゲナーゼ溶液1（30mL）でカラム1（コロ1）および列2（コロ2）を追加する（ 図1A）。 </li><li>ランゲンドルフ灌流システム（ 図1A）中の酸素接続管を介して、大佐1とCol.2で分離ソリューションおよびコラゲナーゼ溶液1に酸素。同様に、含酸素コラゲナーゼ溶液2とを経由して 100％のO 2との振盪水浴中のBSA溶液酸素接続チューブ。 </li></ol> LV筋細胞の3分離<ol><li>ペントバルビタールナトリウム（30mg / kg）の腹腔内注射を介して、SDラットを麻酔し、ピンチつま先と撤退反射の欠如によって麻酔状態を確認。 </li><li>解剖トレイにラットを移動します。仰臥位では、テープで本体の側面に4脚を固定します。 </li><li>心を傷つけないように確実に、胸を開くために手術用ハサミで胸部半ば軸切開を適用します。接続血管（ 例えば、スーペリア、下大静脈、肺血管、および大動脈）と心膜膜13から心臓を解剖するためにきれいなハサミの別のペアを使用してください。 </li><li>細かい鉗子で大動脈をクランプ、 - （8ミリメートル5）、および急速に1分（ 図1A）内ランゲンドルフ灌流システムのカニューレを取り付けるのに十分な長さの大動脈の一部を残します。大動脈の上にしっかりと縫合糸4/0を接続します。 </li><li&gt;は大佐1のバルブの電源をオンにし、10分間予熱したと酸素分離液（灌流速度：12〜14ミリリットル/分）で分離された心臓を灌流。 、大佐1のバルブをオフにし大佐2のバルブをオンにして、8のためのコラゲナーゼ溶液1で心臓を潅流 - 10分。 </li><li>大動脈を切断することにより、消化心のマウントを解除し、新鮮な分離溶液（ 図1Bi）を含むフラスコに鉗子で大動脈を保持することによって、それを転送します。小さ ​​な断片（〜22ミリメートル、 図1Bii）に（中隔を含む）、LV自由壁の大部分をカットする細かいハサミやピンセットを使用してください。 </li><li>予熱したと酸素新鮮なコラゲナーゼ溶液2（ 図1Biii）を含むフラスコにピースを転送します。 10分間振ります。筋細胞を含むコラゲナーゼ溶液2に酸素を提供してください。 </li><li>吸引電球でドロッパーを用いて10 mlの遠心チューブにサスペンションおよびCa 2+を追加- -筋細胞を移動（BSA溶液を含みます1：ボリューム内の1）。 2分間の30グラムで遠心分離し、上清を捨てます。 BSA溶液5ml中の筋細胞ペレットを再懸濁します。上清を遠心分離し、廃棄します。 </li><li>筋細胞ペレットを分散し、RT（ 図1Biv-VI）で予備酸素ストレージソリューションの10ミリリットルで筋細胞を維持します。 </li><li>フラスコ内の残りのLV組織と - （3.9 3.7ステップ）の手順を繰り返します。 LV組織のほとんどは筋細胞の良好な収率を得るために消えるまで再び - （3.9 3.7ステップ）の手順を繰り返してください：注意してください。 </li><li>実験の終了まで室温で6-8時間のためのストレージソリューションに筋細胞を保管してください。 </li></ol>細胞内Ca 2+過渡状態と筋細胞の収縮の4同時測定<ol><li>アセトキシメチルエステルのFura-2 AM（2μM）でロードLV筋細胞。 注：ダークチューブ（ 図1Bvii）にロードされた筋細胞を持つすべてのロード手順と実験を行います。 <ol><li> CENTR10秒間2000×gで筋細胞懸濁液（1ml）にifuge。上清を捨て、低Ca 2+濃度（250μM、表材料および装置）とのタイロード溶液の1ミリリットル中の筋細胞ペレットを再懸濁。 </li><li>軽く筋細胞懸濁液を分散させる、のFura-2AMとポロキサマー407（2μl）を追加し、室温で混合物を維持- 15分間（20〜24 Oの C）（ 図1Bvii）。 </li><li>遠心分離は、混合物を5秒間、上清を廃棄し、500μMのCa 2+を含む灌流液の1ミリリットルで筋細胞ペレットを分散させます。 10分後、5秒間混合物を遠心分離し、上清を捨てます。 </li><li>新鮮な灌流液（500μMのCa 2+、1ミリリットル）を追加し、フラ- 2AM保つ-レコーディングのために、この溶液中にロードされた筋細胞ペレットを。 </li></ol></li><li> LV筋細胞の収縮と細胞内Caの測定2+ <ol><li>記録する前に、通る灌流チューブを埋めます36 O℃に予熱したあるタイロード溶液、水ジャケット</li><li> 8分 - 5のための倒立蛍光顕微鏡のチャンバーにロードされたLV筋細胞サスペンション - フラ2 AMの数滴を置きます。ゆっくりタイロード溶液（2.2ミリリットル/分）を灌流。 </li><li>フィールド刺激（2 Hz）を開始するデジタル刺激装置の前面パネルにある「スタート」ボタンを押してください。 注：出力電圧（10 V、5ミリ秒の持続時間）は、チャンバの両側に位置する白金線を介してチャンバ内の筋細胞に適用されます。 <ol><li>その記録のための契約を安定（ハイパーまたはハイポ収縮が表示されていないもの）筋細胞を選択します。 </li></ol></li><li>ビデオベースの筋節検出システムの水平位置に選択肢の筋細胞を調整し、サルコメアの最適な画像を得るために顕微鏡の焦点を調整します。明確な筋節が明らかに平均するまで観察されている領域に紫の長方形のボックスを配置しますサルコメア長（赤ピーク）の特異鋭いピーク（ 図2A、下の画像）が表示されます。 </li><li>フィールド刺激（ 図2AおよびB）に応答して、筋節長の変化を記録します。 注：1にロード筋細胞を使用してください - 2時間。 </li><li>ビデオベースの筋節検出システムのフィールドが筋細胞（ 図2A）の大きさになるようにカメラの絞りを調整します。 510 nmの（買収周波数千ヘルツ）で360ナノメートル/ 380 nmでの励起および発光で筋細胞を刺激します。録音サルコメア短縮とフィールド刺激（ 図2B）とFURA2 AM比。 </li></ol></li></ol>筋フィラメントのCa 2+感受性の5評価<ol><li>サルコメアの長さと定常状態での Ca 2+過渡電流の平均（10から20までのトレース）と（両方の測定値と同じ筋細胞の筋節長対のFura-2比の位相面のループをプロットsおよびデルタ変化; 図2C）。 </li><li>各プロットでは、50％の弛緩（EC 50、 図2C）でフラ-2比を定義します。各介入のループおよびEC 50の両方を比較してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bers, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation-contraction+coupling.">Cardiac excitation-contraction coupling.</a> Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).</li><li>Eisner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+calcium+cycling+in+cardiac+muscle.">Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle.</a> Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).</li><li>Palmiter, K. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

ここでは、単一の孤立心筋細胞における筋フィラメントのCa 2+感受性の変化を評価し、電気生理学的特性、細胞内Ca 2+過渡電流、および筋フィラメント動態と一緒に、このパラメータを測定することの重要性を強調するためのプロトコルを記述します。パラメータの一つまたは二つの記録は、心臓の収縮と弛緩のメカニズムを解明しない場合があるからです。個別に1?...

心臓の興奮収縮（EC）カップリングは、心筋の機械的特性を分析するための基本的なスキーム、 すなわち、心臓1,2の収縮機能です。 ECカップリングは、筋細胞膜のイオンチャネル（ 例えば、パッチクランプ技術によって測定することができる電位依存性Na +チャネル）の活性に対する二次膜の脱分極によって開始されます。 LTCCs を経由して 、その後の電位依存性L型の活性化のCa 2+チャネル（LTCCs）およびCa 2+流入は、ナノモル（nMでから細胞質ゾルCa 2+濃度を増加させ、リアノジン受容体（RyRs）を介してのCa 2+放出の大部分をトリガ）（μM）レベルをマイクロモル。細胞質ゾルの Ca 2+におけるこのような増加は、細いフィラメント中のトロポニンC（TnCの）へのCa 2+結合を促進し、誘発フィラメント複合体の立体構造変化をアクチン-ミオシン相互作用を容易にし、myocardiを達成しますアルは3を収縮しました。逆に、細胞質ゾルCa 2+が SR中のCa 2+ -ATPaseを介して筋小胞体（SR）（SERCA2aの）に戻し再取り込まれる又はNa + / の Ca 2+交換器と原形質膜を介して筋細胞の外に押し出され、 Ca 2+ ATPアーゼ1,2。その結果、細胞質ゾルのCaの減少は2+アクチン-ミオシンと筋細胞弛緩1-3の解離の結果、元の状態に戻し細いフィラメントの立体構造変化を扇動します。ほとんどの哺乳動物の心臓細胞における1細胞質ゾルのCa 2+の除去の90％ -それは70を占めるので、この方式では、SERCA2aの活性は、一般に、心筋弛緩の速度を決定すると考えられます。このように、などLTCC、のRyRとのSERCA2a、による異常のCa 2+ハンドリングが疾患のある心臓1-4で損なわれた収縮と弛緩のための主要なメカニズムと考えられてきました。 、2+総細胞内Caの約1％のECカップリング勘定のメッセンジャーおよびCa 2+の大部分として機能する細胞内Ca 2+バッファ5,6にバインドされている無料のサイトゾルの Ca 2+。これは、様々なのCa 2+緩衝液は、 例えば、膜リン脂質、ATP、クレアチンリン酸、カルモジュリン、パルブアルブミン、筋原繊維のTnC、ミオシン、SERCA2aの、かつSRのカルセケストリン心筋細胞に豊富であるという事実にある。5,6,7。これらの中でも、SERCA2aのとTnCのは、支配的なのCa 2+バッファ5,6,7です。また、Caは2+、そのバッファへの結合は単収縮時の動的なプロセスであり、追加の原因を結合のCa 2+の変化（ 例えば、Ca 2+を 30〜50％が2+トランジェント7のTnCに結 ​​合し、カルシウムの間にそれから解離します）濃細胞内Ca 2+の変更で、細胞質ゾルに遊離Ca 2+の結果を「解放」entration。その結果、細胞内Ca 2+レベルの摂動は、収縮不全および不整脈8,9の前駆体である異常な筋フィラメントの動きを誘導します。 （生理学的および病理学の両方）は、多くの要因が筋フィラメントのCa 2+バッファリングと筋フィラメントのCa 2+感受性8-10に影響を与える筋フィラメントタンパク質の転写後修飾の源とすることができます。最近では、のCa 2+トランジェント、異常のCa 2+放出、および不整脈8のポーズ依存増強を誘発、筋フィラメントタンパク質における突然変異は、Ca 2+結合親和性および細胞内Ca 2+ハンドリングを向上させることが報告されました。この考え方に沿って、我々はまた、神経型一酸化窒素合成酵素のアップレギュレーションに対する二次性高血圧ラット心臓における筋フィラメントのCa 2+の脱感作が上昇、拡張期と収縮期のCa 2+レベルに関連付けられていることが示されています今度は、のCa 2+依存性不活性化12 LTCCの脆弱性を増加させる11、。したがって、筋フィラメントのCa 2+感受性は、細胞内Ca 2+ホメオスタシスと筋細胞収縮機能の「アクティブ」な調節因子です。これは、筋フィラメントおよびCa 2+の間の相互作用、筋細胞、ECカップリング及び心臓機能の徹底的な調査のためのタンパク質の取り扱いを分析することが必要となってきています。 ここでは、孤立した心筋細胞における筋フィラメントのCa 2+感受性の変化を評価するプロトコルを記述します。細胞内Ca 2+プロファイル、筋フィラメントのCa 2+感受性および収縮の包括的な分析は、新規メカニズムを根底にある心筋の力学を発掘します。

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley rat</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 weeks</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodium</td><td>Hanlim Pharmaceutical (Korea)</td><td>AHN901</td><td>Insurance code:645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Merck</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>Molecular Probes</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127 20% solution in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water Bath</td><td>Chang Shin Scientific</td><td>Model: C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard Softwae Suite</td><td>IonOptix Ltd</td><td>Experimental Builder</td><td>Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes</td></tr><tr><td>Myocyte Calcium &amp;amp; Contractility Recording System</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulating Water Bath</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>Myocyte Fluorescence Microscope</td><td>Nikon</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S Power</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp;amp; Video Detection</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence &amp;amp; System Interface</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>Excitation Light Source</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>High intensity ARC Lamp Power supply</td><td>Cairn Reseach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter wheel controller</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stimulator</td><td>Medical Systems Corportion</td><td>S-98 Mutimode</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Compositions of Experimental Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 3.5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>Concentration (mmol) 0.4</td></tr><tr><td>Storage Solution (pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.2</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentration (mmol) 29</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>Concentration (mmol) 5</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>Concentration (mmol) 20</td></tr><tr><td>Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Concentration (mmol) 141.4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>Concentration (mmol) 4</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>Concentration (mmol) 0.33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Concentration (mmol) 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Concentration (mmol) 5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1.8&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>Concentration (mmol) 1</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Concentration (mmol) 14.5</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (30mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>Concentration (mmol) 0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>Collangenase Solution 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (20mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL)</td><td></td><td></td><td>Concentration (mmol) 1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>Collagenase Type 2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td>Concentration (mmol) 1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 0.05 mM</td></tr><tr><td>BSA solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolation Solution (40mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Fetal Albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>Concentration (mmol) 400 mg</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>Concentration (mmol) 1mM</td></tr></tbody></table>

assessment of myofilament ca2+ sensitivity underlying cardiac excitation-contraction coupling

心不全や不整脈は、世界中の死亡率および罹患率の主要な原因です。しかし、疾患のある心臓における病因および心筋機能不全のメカニズムは完全には明らかにされないままです。最近の説得力のある証拠は、筋フィラメントの変化は、Ca 2+感度心筋細胞における細胞内Ca 2+恒常性およびイオンチャネルの活動に影響を及ぼしていること健康と病気の心の中で心臓の活動電位と収縮を担う不可欠なメカニズムを示しています。実際、心臓の活動電位の基礎となるイオンチャネルやトランスポーターの活動（ 例えば Na +、 の Ca 2+およびK +チャネルおよびNa + -Ca 2+交換体）と細胞内Ca 2+のタンパク質（ 例えば 、リアノジン受容体およびCaの取り扱い筋小胞体（SERCA2aの）またはホスホランバンおよびそのリン酸化）2+ -ATPaseは、従来evaluするために測定されます心臓の興奮収縮（EC）カップリングの基本的なメカニズムを食べました。筋フィラメントが収縮と弛緩の機能単位であり、筋フィラメントの Ca 2+感受性が筋原繊維性能の実装では不可欠であるのに対し、膜と細胞内Ca 2+変化の両方の電気的活動は、ECカップリングのトリガ信号です。それが研究の焦点でない限り、それにもかかわらず、いくつかの研究では、心筋の機能解析に筋フィラメントのCa 2+感受性を組み込みます。ここでは、サルコメア短縮/再延長とのFura-2 AM（レシオメトリック検出）およびラット心臓から心筋細胞における筋フィラメントのCa 2+感受性の変化を評価を使用して、細胞内Ca 2+レベルを測定プロトコルを記述します。主な目的は、筋フィラメントのCa 2+感受性が機構的な分析のためのECカップリングに考慮されるべきであることを強調することです。私の総合的な調査翻訳および治療 ​​的価値のより効果的な戦略を設計するための貴重な情報を提供する健康と病気の心の中で筋細胞の収縮性を根底チャネル、イオントランスポーター、細胞内Ca 2+の取り扱い、および筋フィラメントの Ca 2+感受性に。

LV筋細胞は、正常と高血圧ラット心臓から単離されます。フィールドの刺激に応答して、明確な条線（サルコメアを表す）、安定した収縮との棒状筋細胞は、最適な筋細胞であると考えられていると録音（ 図2A）のために選択されています。 Fのigure 2Aに示す例では、フラ2 AMは、LV筋細胞が水平に配置され、筋細胞、記録フィールドの大部分?...

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Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

筋フィラメントのCaの評価<sup&gt; 2+</sup&gt;感度基礎心臓興奮収縮連関

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

9.4K ビュー.  Seoul National University College of Medicine. This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts. 

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Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and geometric&#160;deformation. Our understanding of the internal relationships between these events has been limited because we can neither &#39;see&#39; inside the muscle nor precisely track the spatio-temporal nature of excitation-contraction dynamics. To resolve these problems, we have constructed a device that combines a suite of imaging modalities. Specifically, it integrates a brightfield microscope to measure local changes of sarcomere length and tissue strain, a fluorescence microscope to visualize the Ca2+ transient, and an optical coherence tomograph to capture the tissue&#39;s geometric&#160;changes throughout the time-course of a cardiac cycle. We present here the imaging infrastructure and associated data collection framework. Data are collected from isolated rod-like tissue structures known as trabeculae carneae. In our instrument, a pair of position-controlled platinum hooks hold each end of an ex vivo muscle sample while it is continuously superfused with nutrient-rich saline solution. The hooks are under independent control, permitting real-time control of muscle length and force. Lengthwise translation enables the piecewise scanning of the sample, overcoming limitations associated with the relative size of the microscope imaging window (540 &#181;m by 540 &#181;m) and the length of a typical trabecula (&#62;2000 &#181;m). Platinum electrodes at either end of the muscle chamber stimulate the trabecula at a user-defined rate. We exploit the stimulation signal as a trigger for synchronizing the data from each imaging window to reconstruct the entire sample twitching under steady-state conditions. Applying image-processing techniques to these brightfield imaging data provides tissue displacement and sarcomere length maps. Such a collection of data, when incorporated into an experiment-modeling pipeline, will provide a deeper understanding of muscle contractile homogeneity and heterogeneity in physiology and pathophysiology.

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

This protocol presents a collection of sarcomere, calcium, and macroscopic geometric&#160;data from an actively contracting cardiac trabecula ex vivo. These simultaneous measurements are made possible by the integration of three imaging modalities.

心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

生物工学

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

生物学

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

医学

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

マウスの心臓変力作用の調​​査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

イントラ小胞体のCaの光学マッピング<sup&gt; 2+</sup&gt;とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury and/or remodeling. One approach for assessing these functional alterations utilizes unloaded shortening and Ca2+ transient analyses in primary adult cardiac myocytes. For this approach, adult myocytes are isolated by collagenase digestion, made Ca2+ tolerant, and then adhered to laminin-coated coverslips, followed by electrical pacing in serum-free media. The general protocol utilizes adult rat cardiac myocytes but can be readily adjusted for primary myocytes from other species. Functional alterations in myocytes from injured hearts can be compared to sham myocytes and/or to in vitro therapeutic treatments. The methodology includes the essential elements needed for myocyte pacing, along with the cell chamber and platform components. The detailed protocol for this approach incorporates the steps for measuring unloaded shortening by sarcomere length detection and cellular Ca2+ transients measured with the ratiometric indicator Fura-2 AM, as well as for raw data analysis.

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

A set of protocols are presented that describe the measurement of contractile function via sarcomere length detection along with calcium (Ca2+) transient measurement in isolated rat myocytes. The application of this approach for studies in animal models of heart failure is also included.

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

天然骨格筋細胞における機能的部位特異的蛍光測定法

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, including voltage-gated ion channels. This approach has been used primarily in heterologous expression systems to simultaneously measure membrane currents, the electrical manifestation of the channels&#39; activity, and fluorescence measurements, reporting local domain rearrangements. Functional site-directed fluorometry combines electrophysiology, molecular biology, chemistry, and fluorescence into a single wide-ranging technique that permits the study of real-time structural rearrangements and function through fluorescence and electrophysiology, respectively. Typically, this approach requires an engineered voltage-gated membrane channel that contains a cysteine that can be tested by a thiol-reactive fluorescent dye. Until recently, the thiol-reactive chemistry used for the site-directed fluorescent labeling of proteins was carried out exclusively in Xenopus oocytes and cell lines, restricting the scope of the approach to primary non-excitable cells. This report describes the applicability of functional site-directed fluorometry in adult skeletal muscle cells to study the early steps of excitation-contraction coupling, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction. The present protocol describes the methodologies to design and transfect cysteine-engineered voltage-gated Ca2+ channels (CaV1.1) into muscle fibers of the flexor digitorum brevis of adult mice using in vivo electroporation and the subsequent steps required for functional site-directed fluorometry measurements. This approach can be adapted to study other ion channels and proteins. The use of functional site-directed fluorometry of mammalian muscle is particularly relevant to studying basic mechanisms of excitability.

著者スポットライト:骨格筋の興奮性を研究するためのネイティブ細胞における機能的部位指向蛍光測定  

Functional site-directed fluorometry is a method to study protein domain motions in real time. Modification of this technique for its application in native cells now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ channels in murine isolated skeletal muscle fibers.

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

筋フィラメントのCaの評価

要約

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心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

マウスの心臓変力作用の調査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

イントラ小胞体のCaの光学マッピング

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害と^Ca2+ 一過性の解析

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

筋フィラメントのCaの評価

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心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

マウスの心臓変力作用の調​​査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

イントラ小胞体のCaの光学マッピング

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害とCa2+ 一過性の解析

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

マウスの心臓変力作用の調査のために分離された乳頭筋の収縮の測定

げっ歯類筋細胞における心収縮機能障害と^Ca2+ 一過性の解析