We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&amp;E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.

1. Mäuse <ol><li> Alle Studien mit Mäusen wurden von der Stony Brook University Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. Die Mäuse wurden auf einem 00.12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. <ol><li> Kommerziell C57BL / 6-Mäusen erhalten. Erhalten C57BL / 6 - Mäuse tragen KLF5 Allele flankiert von loxP - Stellen (KLF5 f l / f l). Diese Mäuse wurden zuvor 21 beschrieben und gnädig von Dr. Ryozo Nagai zur Verfügung gestellt. </li></ol></li><li> Bestellen Sie C57BL / 6-Mäuse, die induzierbare Cre-Rekombinase-Gen unter Regulation des Lgr5-Promotor (Lgr5-EGFP / CreERT2 Mäuse). </li><li> Lgr5-EGFP / Creer T2 / KLF5 f l / f l Mäusen kreuzen KLF5 fl / f l Mäuse mit Lgr5-EGFP / Creer T2 Mäuse und dann Rückkreuzung die Nachkommenschaft KLF5 fl / f l zu etablieren </sup&gt; Mäusen. </li><li> Treat Mäuse mit Tamoxifen nach dem Protokoll zuvor beschriebenen 22. Injizieren 8 Wochen alten Versuchs- und Kontrollmäusen intraperitoneal (IP) mit 1 mg Tamoxifen (10 mg / ml) in sterile Maisöl gelöst, für 5 aufeinanderfolgende Tage. </li><li> Am Tag 14 nach der ersten Injektion Tamoxifen, opfern Mäuse CO 2 Erstickung , indem es sie in einer Kammer platziert , um CO 2 -Gas Quelle verbunden. Erlauben es dem Gas in die Kammer zu strömen, bis die Mäuse bewusstlos und jede Bewegung aufhört sind. Euthanasie durchführen Zervikaldislokation zu gewährleisten. </li></ol> 2. Gewebepräparation und Schweizer Rollen <ol><li> Mit Dissektion Pinzette und Schere, schnitt einen Einschnitt in der Haut der Bauchseite. Mit einer Pinzette, halten Sie die Haut an der Einschnitt und ziehen Sie aus dem Bauch Muskelgewebe sanft entfernt. Verwenden Sie eine Schere aus der Bauchhaut und setzen Sie die Bauchmuskeln zu schneiden. </li><li> Halten und ziehen Sie den peritoneum mit der Zange. Achten Sie darauf, nicht zu halten und Ziehen an den Darm. machen Sie vorsichtig einen Einschnitt in der Bauchgewebe und weiterhin die Haut wegschneiden, um die Bauchmuskeln aus. machen Sie vorsichtig einen Einschnitt in die Bauchmuskeln und sie weiterhin Wegschneiden zu den Darm aus. </li><li> Identifizieren Sie den Doppelpunkt und Spuren an das distale Ende, wo es das Rektum / Anus verbindet. Mit einer Schere, schneiden Sie so nah an der Analöffnung wie möglich. </li><li> Identifizieren Sie den Magen und verfolgen, wo es mit dem Dünndarm verbindet. Mit einer Schere, freigeschnitten den Darm etwa 1 cm vom Magen. Übertragen die gesamte Länge des befreit Dünndarm und Dickdarm in eine saubere Petrischale mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Mit einer Hand oder einer Pinzette, um das distale Ende des Dickdarms zu halten und mit der anderen Hand sanft über die gesamte Länge des Dickdarms von jedem mesenteric Binde- und / oder Fettgewebe entwirren. </li><li> Identifizieren Sie den Blinddarm(Kleine Beutel zwischen Dünn- und Dickdarm) und schneiden, wo der Blinddarm und der Doppelpunkt verbinden (das proximale Ende des Dickdarms) um den Darm zu befreien. </li><li> Mit einer Hand oder einer Pinzette, halten Sie den Dünndarm und mit der anderen Hand sanft über die gesamte Länge des Dünndarms von jedem mesenteric Binde- und / oder Fettgewebe entwirren. Schneiden Sie den Blinddarm entfernt und verwerfen, wenn es keine Notwendigkeit dafür. Hinweis: Der Prozess hier beendet werden kann , die seziert Darm in modifizierter Bouin-Fixiermittel durch Inkubation (50% Ethanol / 5% Essigsäure in dH 2 O) über Nacht und fahren am nächsten Tag den Vorgang. </li><li> ein Segment des Darms (Dünndarm oder Kolon) Handhabung, füllen einen 10-ml-Spritze mit modifizierten Bouin-Fixiermittel und heften sich an eine Sondennadel. Führen Sie die Nadel etwa einem halben Zentimeter in der vorderen Öffnung des Darmsegments. </li><li> Halten Sie die Sondennadel innerhalb des Darm-Segment durch festen Druck mit einem Instrument Anwendungauf die intestinale Segment. Mit der anderen Hand die Spritze gelten sanfte, aber gleichmäßigen Druck, den Inhalt des Darmsegments zu spülen modifizierten Bouin-Fixiermittel verwendet wird. Dieser Schritt ermöglicht die gleichzeitige Reinigung des Darmsegments und sofortige Fixierung. Verwenden Sie eine Petrischale, die Flow-Through-Abfall zu sammeln. Die Fixierung kann durch den Darm Farbe drehen undurchsichtig beobachtet werden. Hinweis: Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auszuüben, beim Spülen oder der Darm-Segment könnte aufplatzen. </li><li> Mit einer Schere, schneiden Sie das Darmsegment öffnen längs entlang der mesenterischen Linie. Halten Sie es mit einer Pinzette und spülen Sie ihn kurz in einer Petrischale mit PBS. <ol><li> Schneiden Sie den Dünndarm in drei gleich große Segmente: proximalen, mittleren und distalen. Das proximale Segment ist das man sofort den Magen folgenden, und das distale Segment ist derjenige unmittelbar vor dem Doppelpunkt. Das proximale Segment entspricht dem Zwölffingerdarm, den mittleren bis Jejunum und dem distaldas Ileum. </li><li> Für jedes Segment das proximale und das distale Ende markieren. Das proximale Ende ist derjenige, der ursprünglich in Richtung auf den Magen zeigt, und das distale Richtung Kolon gerichtet. </li></ol></li><li> Verwenden Sie die oben auf einer Petrischale, die gereinigt und geöffnet Darm-Segment zu platzieren. Legen Sie das Darmsegment mit der luminalen Seite nach oben zeigt. <ol><li> Für den Doppelpunkt zu identifizieren der luminalen Seite von den Farbvarietät / Grate über ihre Breite läuft und an dem proximalen Ende vorhanden sind. Die mittleren und distalen Bereichen haben einige Farbvarietät, die in Längsrichtung verlaufen. Für den Dünndarm, identifizieren die luminale Seite durch die grobe erscheinende Oberfläche, die den Zotten markiert. Hinweis: Für den Dünndarm gibt es keine externe makroskopische anatomische Abgrenzung der proximalen, mittleren und distalen Regionen. Jedoch können diese Bereiche in den Abschnitten unter dem Mikroskop identifiziert werden kann. Die Zotten sind am längsten im proximalen Bereich und werden nach und nach distal kürzer, wo sie sinddie kürzeste Länge. Mikroskopisch sind die Kolonkrypten kürzesten im proximalen Bereich, der auch durch das Vorhandensein von Graten identifiziert werden kann. Die Kolonkrypten sind höchsten in den Mittelteil und kürzer im distalen Bereich dennoch noch größer als im proximalen Bereich. </li></ol></li><li> Fahren Sie mit dem Schweizer den Doppelpunkt rollen: <ol><li> Halten Sie den Doppelpunkt flach offen und ziehen Sie sie mit einer Pinzette von seinem proximalen Ende in Richtung auf den Rand der Petrischale. </li><li> Halten Sie luminalen Seite nach oben und halten Sie das proximale Ende mit der Zange mit einer Hand und mit der anderen Hand halten einen Zahnstocher. </li><li> Wickeln Sie den Rand des proximalen Ende um den Zahnstocher mit der Pinzette und leicht kneifen die verpackte Kante gegen den Zahnstocher es an Ort und Stelle zu halten. </li><li> Sanft und langsam beginnen den Zahnstocher mit den Fingern rollen den Darm um den Zahnstocher zu rollen eine Schweizer Rolle zu bilden. </li><li> Sobald die gesamte Kolon Länge aufgerollt wurde, wird eine Pinzette benutzen, um sorgfältig die c schiebenOlon Rouladen aus dem Zahnstocher und in ein Gewebe-Verarbeitung / Embedding Kassette. Legen Sie die Kassette in 10% gepuffertem Formalin über Nacht bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Fahren Sie mit dem Schweizer in den Dünndarm rollen: <ol><li> ein Segment zu einem Zeitpunkt, Handhabung, halten das Segment flach offen mit luminalen Seite nach oben und ziehen Sie sie mit einer Pinzette von seinem proximalen Ende in Richtung auf den Rand der Petrischale. </li><li> Fahren Sie mit dem Schweizer Roll wie für den Doppelpunkt beschrieben. </li></ol></li><li> Fahren Sie mit der Verarbeitung Formalin fixierten Geweben für Paraffineinbettung. Gehen Sie wie folgt vor: HINWEIS: Verwenden Sie einen automatisierten Prozessor (siehe Materialien und Equipment für weitere Details). <ol><li> Während Gewebe in der Kassette ist, spülen Sie Gewebe mit PBS bis Fixateur vollständig entfernt wird. </li><li> Dehydratisieren Gewebe Ethanol in der folgenden Reihenfolge unter Verwendung von 50% Ethanol für 10 min, 70% Ethanol für 10 min, 80% Ethanol für 10 min, 95% Ethanol für 10 min, 100% Ethanol für 10 min, 100% Ethanol für 10 min , und 100% Ethanol für 10 min. </li><li> Austausch ethanol mit Xylol in der folgenden Reihenfolge: 2: 1 Ethanol: Xylol für 10 bis 15 min, 1: 1 Ethanol: Xylol für 10 bis 15 min, 1: 2 Ethanol: Xylol für 10 bis 15 min, 100% Xylol 10 - 15 min, 100% Xylol für 10 - 15 min und 100% Xylol für 10 - 15 min. ACHTUNG: Xylen ist eine Gefahr für die Gesundheit, so dass der Arbeitsplatz sollte mit einer lokalen Absaugung mit einer richtigen Haube und der richtigen Schutzausrüstung ausgestattet werden sollte von Personal getragen werden. </li><li> Exchange-Xylol mit Paraffin. Führen Sie die folgenden Schritte in einem Vakuumofen-Set für 54 bis 58 ° C: 2: 1 Xylol: Paraffin 30 min, 1: 1 Xylol: Paraffin 30 min, 1: 2 Xylol: Paraffin 30 min, 100% Paraffin 1 bis 2 Stunden und 100% Paraffin mit 1 - 2 Stunden oder über Nacht. Hinweis: Lassen Sie sich nicht das Paraffin 60 ° C für längere Zeit nicht überschreiten, da dies die Paraffin Polymere zersetzen und es hart und spröde machen. </li><li> Einbetten in frischen neuen Paraffin und orientieren Gewebe als degezeugt, bevor das Paraffin erstarrt. Für die Schweizer Brötchen, Gewebe paraffinization folgen, ist es wichtig, jede Rolle auf seiner Seite während Paraffineinbettung neu zu positionieren. Dadurch wird sichergestellt, dass während des Schneidens wird, Abschnitte der gesamten Länge jeder Walze hergestellt werden. </li></ol></li><li> Zur Färbung, schneiden 5 um dicke Abschnitte Mikrotom. Sammeln Sie die Abschnitte über die geladene Objektträger und trocknen Sie sie (backen) in einem 65 ° C Ofen über Nacht; lassen auf Raumtemperatur abkühlen und sie anschließend zum Färben verwendet. Anmerkung: Die Backzeit kann verkürzt werden auf 1 - 2 Stunden, je nachdem wie frisch geschnittenem Die Objektträger werden. Wenn weniger als einem Monat seit sectioning, dann ist es ratsam, über Nacht zu backen. Wenn es hat sich mehr als einen Monat, dann 1 bis 2 h Backen reicht aus, um Zeit zu sparen. Wenn die Zeit läuft, kann immer über Nacht Lage verwendet werden. </li></ol> 3. Die histologische Analyse und Immunfluoreszenzanfärbung Führen Sie die histologische Analyse und immunofluFluoreszenz - Färbung beschrieben , wie zuvor 23,24, mit Modifikationen. Für eine verbesserte grün fluoreszierende Protein (EGFP) Immunofluoreszenz: <ol><li> Bake die Folien in einem 65 ° C Ofen für 1 h auf endogene alkalische Phosphatase-Aktivität inaktivieren und entparaffinieren anschließend in Xylol. </li><li> Inkubieren Abschnitte in einem Bad von 3% Wasserstoffperoxid in Methanol endogene Peroxidasen Gewebe zu blockieren; durch Inkubation in einem abnehm Alkoholbad Serie (100%, 95%, 70%), gefolgt von Antigen-Retrieval in Citrat-Pufferlösung (10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween-20, pH 6,0) bei 125 ° C rehydriert dann für 10 min mit einer decloaking Kammer. </li><li> Zeichnen Sie einen Kreis um Gewebeschnitte mit Stift Markierung, die hydrophobe Barriere bietet und inkubieren Abschnitte mit Blockierungspuffer (2,5% Rinderserumalbumin [BSA] in TBS-Tween) für 30 min bei 37 ° C und dann mit dem primären Antikörper gegen EGFP (Verdünnung 1 : über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei) 4 ° C 500 unter leichtem Schütteln.</li><li> Waschen Abschnitte und inkubiere mit fluoreszierendem-tagged sekundären Antikörper in der entsprechenden Konzentration für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Waschen Sie Dias nach der sekundären Antikörperbehandlung und Fleckenkerne mit Hoechst und montieren mit Montage Medien. <ol><li> Für KLF5 / EGFP / Ki-67 Co-Färbung, Prozess gleitet wie in den Schritten 3.1 beschrieben - durch Inkubation mit KLF5 Antikörper (Verdünnung 1: 150), 3.3 und führen KLF5 Färbung über Nacht. </li><li> Bewerben Kaninchen AP Polymer Erkennung Dias laut Protokoll. </li><li> Reveal Klf4 mit Chromogen immunhistochemischen Färbung Färbung gemäß Protokoll des Herstellers. </li><li> Führen Antikörper Elution der zuvor beschriebenen Protokoll 25 verwendet wird . Inkubiere Objektträger bei 50 ° C in Glycin-SDS (pH 2,0) Lösung unter Rühren für 1 Stunde. </li><li> Wasch gleitet gründlich mit destilliertem Wasser und Inkubieren Puffer (2,5% BSA in TBS-Tween) für 30 min bei 37 ° C mit Blockierung. </li><li> In Ki-67 (Verdünnung 1: 500) und EGFP (Verdünnung 01.500) Antikörper gleichzeitig und inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Führen Fluoreszenzdetektion mit einem geeigneten sekundären Antikörper vor mit Hoechst-Färbung (Daten nicht gezeigt) und montieren mit Eindeckmediums. </li></ol></li><li> Beobachten histologische Morphologie der Gewebe auf Anfärben 5-um - Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) 26. Für Fluoreszenzbilder verwenden Emissionswellenlängen von 535, 646 und 700 EGFP, KLF5 sichtbar zu machen, und Ki-67-Färbung auf. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die Schweizer Walztechnik ist eine leistungsfähige Methode zur Darmgewebe zur histologischen und morphologischen Beurteilung in großem Maßstab vor. Im Gegensatz zu dem zuvor beschriebenen Swiss-Walztechnik, die ursprünglich zur Herstellung von Gefrierschnitten 18,19 entwickelt wurde, stellte das Verfahren hier ermöglicht die schnelle intestinalen Gewebepräparation und Fixierung für Formalin Fixierung und Paraffineinbettung (FFPE). Im Vergleich zu gefrorenem Gewebe, hat FFPE Gewebe wesentlich längere H...

Die Säuger Darmepithel umfasst eine einzelne Schicht aus säulen Zellen. Im Dünndarm werden die proliferative Zellen zu den Krypten beschränkt, während die differenzierten Zellen villus Region besetzen. Da es jedoch keine Zotten im Dickdarm sind, werden die proliferative Zellen auf den Boden der Krypten lokalisiert und differenzierten Zellen besetzen den oberen Bereich der Krypten. Darmepithel erfährt rasche Nachfüllung (ca. 3 - 5 Tage), die durch kontinuierliche Trennung der proliferativen Zellen in den Krypten angetrieben wird. Die proliferativen Zellen der Krypten sind keine homogene Bevölkerung und werden weiter in Stammzellen und Transit-Verstärkung (TA) Zellen 1 unterteilt. Die Stammzellen liegen an der Unterseite der Krypta, innerhalb der ersten 4 bis 5 Zellen von ganz unten 2. Das aktuelle Modell unterstützt die Existenz von zwei Arten von Stammzellen: Krypta Basis säulen (CBC) Stammzellen und Reserve ruhenden Stammzellen. Die CBC stem Zellen aktiv vermehren und werden von Leucin-rich repeat enthaltenden G-Protein - gekoppelten Rezeptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (OLFM4) 4 und Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5 markiert. Auf der anderen Seite, sind Reserve ruhenden Stammzellen von B - Zell-spezifischen Moloney - Maus - Leukämie - Virus - Integrationsstelle 1 (Bmi1) 6, Maus Telomerase Reverse Transkriptase (mTERT) 7 gekennzeichnet, HOP Homeobox (Hopx) 8, Double-Like und CAM - Kinase -Wie 1 (DCLK1) 9, und leucinreichen Repeats und Immunoglobulin-ähnlichen Domänen 1 (Lrig1) 10. Die aktiv vermehrenden Stammzellen führen zu TA-Zellen dann eine weitere Differenzierung in absorptive Zellen durchlaufen (Enterozyten) und sekretorischen Zellen (enteroendokrinen, Becher, Paneth und Tuft-Zellen). Kontinuierliche Zellteilung in der proliferativen Zone führt zu einer Aufwärtsbewegung von Epithelzellen entlang der Krypta-villus Achse, bis sie oben auf der Zotten zu erreichen, wo sie unterziehen Apoptose und sindabgestoßen von der Oberfläche des Epithels ab. Die verschiedenen Arten von intestinalen Epithelzellen werden durch die Expression von bestimmten Proteinen markiert (zB intestinalen Becherzellen können durch Färbung mit Antikörper gegen MUC2 und Paneth - Zellen mit Antikörper gegen Lysozym zu erkennen). Wir untersuchen die Rolle der Krüppel-ähnlichen Faktoren (KLFs) in der Homöostase und Pathobiologie des Darmepithels 11-13. Die hier vorgestellten Ergebnisse , die Durchführbarkeit eines modifizierten Swiss-Walztechnik unterstützen , werden bei früheren Untersuchungen der Rolle von Krüppel-like factor 5 (KLF5) bei der Aufrechterhaltung der aktiv proliferierenden intestinalen epithelialen Stammzellen 14 basiert. KLF5 ist ein Faktor Zinkfinger - Transkriptions , die 12 in dem aktiven Darm Schaft und TA - Zellen stark exprimiert wird. Frühere Studien zeigten, dass KLF5 wird coexprimiert mit Ki-67, einem bekannten proliferative Marker in den Darmkrypten. Die Magen-Darm-tr<html> Akt ist kein strukturell oder funktionell homogenen Gewebe. Der Dünndarm wird in Duodenum unterteilt, Jejunum und Ileum und den Dickdarm in Caecum und Colon, wobei letztere weiter in proximaler unterteilt, mittleren und distalen Abschnitten. Jeder dieser Abschnitte hat einzigartige histologische Eigenschaften und spielt verschiedene Rollen 15. Als solche können die Auswirkungen von Beleidigungen und der Grad der Reaktion des Darmepithels kann 16 auf dem Bereich des untersuchten Gewebes abhängt. Darüber hinaus zeigen verschiedene Mausstämme Vielfalt der Antwort auf der histologischen Ebene basierend auf der Art der Insult in den Studien verwendet 16. Somit ist Gewebepräparation geziemt notwendig, geeignete histologische und molekulare Analyse der Darmgewebe zu ermöglichen. Als solche ermittelt die Swiss-Rolle-Technik gewährt Analyse der gesamten Länge des Darmepithel zu einer Zeit und damit gut informierte Schlussfolgerungen über umfassende Informationen. e_content &quot;&gt; Die Swiss-Roll - Technik wurde zuerst von Magnus 17, erwähnt und im Detail von Moolenbeck und Ruitenberg und Park et al. , wie ein Verfahren zur Herstellung von Geweben und histologische Durchführung des Nagetiers Darm analysiert 18,19 dar. Das Protokoll in dieser Druckschrift abgegrenzt stellt eine verbesserte Version der ursprünglichen Methode, die für eine rechtzeitige und zuverlässige Gewebevorbereitung für diagnostische Zwecke ermöglicht. mit dieser modifizierte Technik für die effiziente Sammlung und Vorbereitung des Darmepithels für allgemein verwendete Techniken, wie der Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, als auch wie in situ - Hybridisierung (fluoreszierend und chromogenen 20). Ferner verwendet das modifizierte Gewebeprobe Herstellungsverfahren leicht verfügbar und relativ preiswerten Reagenzien während eines Verfahrens zur schnellen Gewebefixierung bietet und ermöglicht eine Rückgewinnung von Protein, DNA und RNA für zusätzliche Auswertung. Genommen zusammen, this-Technik eignet sich hervorragend für eine umfassende Beurteilung der histopathologischen, pathologische und molekulare Merkmale des Darmepithel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1016">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Stainless Steel Dissecting Kits</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25640-002</td>
			<td style="width:403px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Decloaking Chamber</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td>DC2012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Syringe 10ml</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>89215-218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid</td>
			<td style="width:179px;">Simport</td>
			<td>M515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm]</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Manual Slide Staining Set</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish Green</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Staining Dish White</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">24-Slide Slide Holder with Detachable Handle</td>
			<td style="width:179px;">Tissue-Tek/Sakura</td>
			<td>4465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Oven</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td>6243</td>
			<td>for baking slides at 65 degree</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:179px;">Nikon</td>
			<td>Eclipse 90i</td>
			<td>Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>DAI-PAP-S-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Methanol</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:179px;">AAPR</td>
			<td>281000ACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Xylene</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>X5P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Hydrogen peroxide 25% solution in water</td>
			<td style="width:179px;">ACROS</td>
			<td>202465000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">10% bufered formalin</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-026-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Bovine serum fraction V, heat shock</td>
			<td style="width:179px;">Roche</td>
			<td>3116956001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Tween 20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Gavage needle</td>
			<td style="width:179px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20068-624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Klf5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">sc-22797</td>
			<td>Dilution 1: 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Chicken anti EGFP antibody</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">AB16901</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Rabbit anti Ki67 antibody</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">CRM325B</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Mach3 rabbit AP polymer detection kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">M3R533L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Warp red chromogen kit</td>
			<td style="width:179px;">Biocare Medical</td>
			<td style="width:119px;">WR806 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Lgr5-EGFP/CreERT2 mice&#160;</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>008875&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Automated processor</td>
			<td style="width:179px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">Leica TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Die Schweizer Walztechnik in Kombination mit immunhistochemischen Färbung ermöglicht eine umfassende Analyse von kleinen oder großen Darmgewebe. Das Beispiel von H &amp; E - Färbung eines Dickdarms einer C57BL / 6 - Maus (Figur 1) ist eine Darstellung der Durchführbarkeit und die Wirksamkeit dieser Technik. Wie in 1 gezeigt, ist das Bild der Lage , alle Teile des Dickdarms zu erfassen: proximalen, mittleren und distalen. Somit ermöglicht es eine um...

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Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Epithelzellen entlang der Darmschleimhaut sind wesentlich unterschiedlichen Zelllinien zu definieren. Die richtige Darstellung von Darmgewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Identifizierung von Proteinexpressionsmuster mit maximaler Auflösung. Diese Studie hat zum Ziel, die optimalen Verfahren und Bedingungen für die Verarbeitung der Maus Darmgewebe zu beschreiben.

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

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Research

JoVE Journal

Biology

68.0K Aufrufe.  Stony Brook University School of Medicine.  Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Epithelzellen entlang der Darmschleimhaut sind wesentlich unterschiedlichen Zelllinien zu definieren. Die richtige Darstellung von Darmgewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Identifizierung von Proteinexpressionsmuster mit maximaler Auflösung. Diese Studie hat zum Ziel, die optimalen Verfahren und Bedingungen für die Verarbeitung der Maus Darmgewebe zu beschreiben. 

Serie: Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pressure-Polieren Pipetten für verbesserte Patch-Clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Forschung

Biologie

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are analyzed. Established methods to detect cell division include direct visualization by continuous microscopy in cell culture, dilution of vital dyes such as carboxy&#64258;uorescein di-aetate succinimidyl ester (CFSE), immuno-detection of mitogenic antigens such as ki67 or PCNA, and thymidine analogues. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

We have derived a strategy to detect sequential incorporation of thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice to quantify two successive rounds of cell division. This strategy is useful to detect cell turnover of long-lived tissues, oncogenic transformation, or transit-amplifying cells.

Immunfluoreszenz-Nachweis von zwei Thymidinanaloga (CldU und IDU) in primärem Gewebe

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Ausweiden der Maus Glaskörper und Netzhaut für Proteomik-Analysen

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

It is well recognized that human movement in the spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3. An infectious disease typically spreads via contact between infected and susceptible individuals in their overlapped activity spaces. Therefore, daily mobility-activity information can be used as an indicator to measure exposures to risk factors of infection. However, a major difficulty and thus the reason for paucity of studies of infectious disease transmission at the micro scale arise from the lack of detailed individual mobility data. Previously in transportation and tourism research detailed space-time activity data often relied on the time-space diary technique, which requires subjects to actively record their activities in time and space. This is highly demanding for the participants and collaboration from the participants greatly affects the quality of data4.
Modern technologies such as GPS and mobile communications have made possible the automatic collection of trajectory data. The data collected, however, is not ideal for modeling human space-time activities, limited by the accuracies of existing devices. There is also no readily available tool for efficient processing of the data for human behavior study. We present here a suite of methods and an integrated ArcGIS desktop-based visual interface for the pre-processing and spatiotemporal analyses of trajectory data. We provide examples of how such processing may be used to model human space-time activities, especially with error-rich pedestrian trajectory data, that could be useful in public health studies such as infectious disease transmission modeling.
The procedure presented includes pre-processing, trajectory segmentation, activity space characterization, density estimation and visualization, and a few other exploratory analysis methods. Pre-processing is the cleaning of noisy raw trajectory data. We introduce an interactive visual pre-processing interface as well as an automatic module. Trajectory segmentation5 involves the identification of indoor and outdoor parts from pre-processed space-time tracks. Again, both interactive visual segmentation and automatic segmentation are supported. Segmented space-time tracks are then analyzed to derive characteristics of one's activity space such as activity radius etc. Density estimation and visualization are used to examine large amount of trajectory data to model hot spots and interactions. We demonstrate both density surface mapping6 and density volume rendering7. We also include a couple of other exploratory data analyses (EDA) and visualizations tools, such as Google Earth animation support and connection analysis. The suite of analytical as well as visual methods presented in this paper may be applied to any trajectory data for space-time activity studies.

A suite of spatiotemporal processing methods are presented to analyze human trajectory data, such as that collected using a GPS device, for the purpose of modeling pedestrian space-time activities.

Bahndaten Analysen für Fußgänger Raum-Zeit-Activity Study

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Eine Immunfluoreszenz-Verfahren zur Charakterisierung von Barrett-Ösophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...