Wir danken Daniel Chen aus der Digital Video Produktion Team von Buchholz High School für die Unterstützung bei der Videobearbeitung. Diese Forschung auf Stomata Schließzellen, Proteomik und Metabolomik in der Chen-Labor wurde durch Zuschüsse aus den US National Science Foundation (0818051, 1158000 und 1412547) unterstützt. Wenwen Kong wird von der China Scholarship Council unterstützt. Dr. Qiuying Pang wird von der China Scholarship Council und der National Natural Science Foundation of China (31570396) unterstützt.

1. Anbau von Pflanzen
<ol><li>Keimen Sie die Samen in Blumenerde Mischung. Wachsen Sie Pflanzen in einer Kammer Wachstum mit einer Lichtintensität von 140 µmol Photonen m−2 s −1 und eine Photoperiode von 8 h Licht bei 22 ° C und 16 h dunkel bei 18 ° C für 2 Wochen.</li>
	<li>Transplantation Sämlinge ähnlicher Größe individuell in 4" Durchmesser Töpfe mit den Boden und wachsen für weitere 3 Wochen unter den gleichen Bedingungen im Schritt 1.1 beschrieben. Hinweis: Wasserpflanzen Sie mit Leitungswasser zweimal in der Woche um den Boden feucht zu halten.</li>
</ol>2. Vorbereitung des angereicherten Spaltöffnungen
<ol><li>Entfernen Sie die Blätter des 5 - Wochen alten A. Thaliana Pflanzen einzelne mit einem Skalpell.</li>
	<li>Legen Sie jedes Blatt auf zwei Stücke von klaren Tesafilm mit Einteiler der abaxial (unteren) Seite an und das andere Stück adaxial (oberen) Seite des Blattes an. Lassen Sie das Band auf dem Blatt für 5 s.</li>
	<li>Sanfte Peel auseinander die beiden Teile der Bänder mit dem Zeigefinger und dem Daumen an jeder Hand die abaxial Seite mit Pflaster und Schließzellen und die adaxial Seite mit Mesophyll Zellen zu trennen.</li>
	<li>Ort die Schalen von der abaxial Seite der Blätter in 60 mL der Stomata öffnen (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, angepasst auf pH 6.2 mit 1 M KOH) in 40 mm × 12 mm Größe Petri Puffer Speisen während sie erfasst werden.<ol>
<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte, bis alle Probe Schalen gesammelt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Petrischalen mit den Schalen in die Wachstums-Kammer unter leichten Bedingungen in Schritt 1.1. Lassen Sie die Schalen unter dem Licht für 2 h Stomata öffnen.</li>
	<li>Ort schält sich in einer 150 mm x 20 mm Petrischale mit 50 mL der Zellwand Verdauung Enzym Mischung (0,7 % Cellulase r-10, 0,025 % Macerozyme r-10, 0,1 % (w/V) Polyvinylpyrrolidon-40 und 0,25 % (w/V) Rinderserumalbumin in 55 % Basislösung (0,55 M Sorbit, 0,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM Ascorbinsäure, 10 µM KH2PO4, 5 mM 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES) bei pH 5,7 mit 1 M KOH eingestellt).</li>
	<li>Schütteln Sie die Schalen auf eine wechselseitige Shaker in einer Petrischale bei 50 u/min für 20 Minuten.</li>
	<li>Herausnehmen Sie Schalen mit einer Pinzette aus Enzymlösung, nach 20 min. die Schalen auf eine 150 x 20 mm Größe Petrischale mit 50 mL Wasser übertragen.</li>
	<li>Spülen mit einer transferpipette, Schalen für 15 s zweimal mit 10 mL Wasser, alle restlichen Enzymlösung zu entfernen.</li>
	<li>Benutzen Sie eine Pinzette, um Schalen in einer Petrischale 150 x 20 mm Größe mit 50 mL frische Stomata öffnen Puffer wie in Schritt 2.4 verwendet zu platzieren. Inkubation für 1 h bei Lichtverhältnissen erklärt in Schritt 1.1 erlauben die Stomata zu erholen.</li>
</ol>3. Abscisic Säure (ABA) Behandlung und Spaltöffnungen Bewegung Assay
<ol><li>In einer Petrischale 150 x 20 mm Größe. Inkubieren Sie die angereicherten Spaltöffnungen Schalen bei 30° C für 15 min in 50 mL des Puffers Stomata öffnen oder in 50 mL des Puffers Stomata öffnen mit einer Endkonzentration von 10 µM ABA für die angemessene Behandlungszeit.</li>
	<li>Ein Shaker bei 50 u/min für 5, 15 und 30 min Schalen aufsetzen. Nach jedem Zeitintervall eine Schale mit einer Pinzette zu entfernen und die bildgebenden Schritte in Schritt 3.3.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder von Spaltöffnungen vor ABA Behandlung und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der ABA-Behandlung mit einem Lichtmikroskop.<ol>
<li>Nehmen Sie eine Schale und legen Sie es auf einen Glas-Objektträger.</li>
		<li>Legen Sie die Folie auf der Mikroskop-Bühne und stellen Sie die Bühne so ein, dass das Bild der Schale visualisiert werden kann.</li>
		<li>Passen Sie die feinen und natürlich Fokus auf das Mikroskop um ein klares Bild von den Schließzellen zu erhalten.</li>
		<li>Nehmen Sie mehrere Bilder von mehreren Spaltöffnungen bei 40 X Vergrößerung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie 60 Stomata Öffnungen mit ImageJ-8.</li>
	<li>Berechnen Sie die Standardfehler und Bedeutung bei einem p-Wert < 0,05 der Stomata Blende 60 Messungen.</li>
</ol>(4) Protein Extraktion und Trennung der SDS-Page
<ol><li>Schleifen Sie die Schalen für 15 s in genug flüssigem Stickstoff um die Schalen mit einem gekühlten Mörser und Stößel zu decken.</li>
	<li>Pro 50 Schalen hinzufügen 3 mL Tris gesättigt Phenol (pH 8,8) und 3 mL Protein Extraktionspuffer (0,9 M Saccharose, 0,1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4 % 2-Mercaptoethanol, 10 µL 1 mM Protease und Phosphatase-Inhibitor) mit einer Pipette vermischen und dann Schleifen die Schalen für 5 Addi nale Minuten unter einem Abzug.</li>
	<li>Den Extrakt mit einer Pipette zu übertragen und die Schalen mit einer Pinzette aus Metall zu einem Oakridge Zentrifugieren Rohr und agitieren auf einem Schüttler bei 50 u/min für 1 h bei 4 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie die Schalen aus der Oakridge Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 5.000 x g für 10 min. Übertragen Sie dann die obere phenolische Phase auf eine neue saubere Mikro-Zentrifugenröhrchen mit einer Pipette.</li>
	<li>Niederschlag der Phenol extrahiert Proteine durch Zugabe von 5 Bänden der eiskalte 0,1 M Ammoniumacetat in 100 % Methanol. Vortex kurz und Inkubation über Nacht bei-20 ° C.</li>
	<li>Bei 20.000 x g bei 4 ° C für 20 min zentrifugieren, Dekantieren des Überstands durch langsam aus dem Schlauch Gießen und das Protein Pellet in das Rohr zu behalten.</li>
	<li>Das Protein Pellet zweimal mit 0,1 M Ammoniumacetat in Methanol, Waschen und dann zweimal mit 80 % Aceton und einmal mit 100 % kaltem Aceton. Hinweis: Waschungen erfolgt durch Zugabe von 10 mL der angegebene Reagenz auf das Rohr des Proteins. Auf einem Schüttler bei 50 u/min für 5 min, gefolgt von Zentrifugation bei 15.000 x g bei 4 ° C für 10 min schütteln. Dann Gießen Sie das Reagenz aus der Tube behalten nur das Protein Pellet.</li>
	<li>Das Pellet 1 mL kaltem Aceton 100 % hinzu und wieder aussetzen durch pipettieren langsam rauf und runter.</li>
	<li>Bei 20.000 x g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren dann Protein Federung per Pipette auf eine 2 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen übertragen.</li>
	<li>Das Aceton durch Dekantieren es aus Rohr zu entfernen und das Pellet in Abzug für 10 min trocknen.</li>
	<li>Das Protein in einem Mikro-Zentrifugenröhrchen mit 200 µL Puffer Auflösung (8 M Harnstoff, 0,5 % SDS, 30 mM Tris-HCl bei pH 8,5) auflösen und Vortex für 30 min. Zentrifuge bei 20.000 x g bei 15 ° C für 20 min und Sammeln der Überstand in einen neuen Schlauch.</li>
	<li>Die Proteinkonzentration nach Protein Quantifizierung Protokoll9zu quantifizieren.</li>
	<li>Verwenden Sie Proteinproben für Protein Trennung durch Gelelektrophorese nach Protokoll10.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormone+interactions+in+stomatal+function.">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li><li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+cell+signal+transduction.">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li><li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses.">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li><li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+applications+of+Arabidopsis+thaliana+guard+cell+protoplasts.">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li><li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+Dependence+Of+K++Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts.">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li><li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method.">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10 (2009).</li><li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll,+epidermal+and+vascular+tissues.">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li><li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents,+chaotropes,+dyes,+and+reducing+agents.">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li><li>He, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laemmli-SDS-PAGE.">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li><li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+tags:+A+novel+quantification+strategy+for+comparative+analysis+of+complex+protein+mixtures+by+MS/MS+(vol+75,+pg+1895).">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li><li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+labeling+by+iTRAQ:+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research.">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Schließzellen sind ein Modellsystem zur Untersuchung von Signal Transduction Mechanismen in Pflanzen und es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Vorbereitung der Proben, die in der Studie verwendeten die am besten geeignete biologische Fragen zu beantworten. Trotz des zunehmenden Interesses an Schließzellen innerhalb der Pflanze Forschungsgemeinschaft, gibt es keine universelle Methode zum Stomata Schließzellen vorbereiten, die sowohl die Physiologie der Stomata Bewegung erlauben würde sowie der molekularen Ver?...

Spaltöffnungen spielen eine wichtige Rolle in der allgemeinen Physiologie und Fitness Pflanzen. Diese kleine Pflanze bestimmte Strukturen von zwei spezialisierten epidermalen Zellen bekannt als Schließzellen gebildet werden und befinden sich meist reichlich auf der abaxial Oberfläche der Blätter. Spaltöffnungen sind notwendig für den Austausch der Gase zwischen der Anlage und der Atmosphäre sowie die Kontrolle der Wasserverlust durch Transpiration. Schließzellen regulieren Stomata Blende durch die Integration von verschiedenen externen (z.B., Licht, Feuchtigkeit, Erreger Kontakt, Kohlendioxid-Konzentration) und internen (zB., endogenen Hormonen) Reize1,2. In den letzten 20 Jahren ist dieser Zellentyp Modellsystem für Studium Zelle signalisieren Prozesse in Pflanzen geworden. Diese Zellen bilden einen kleinen Bruchteil der gesamten Zellen in ein Blatt; so muss um ihre einzigartige Mobilfunk zu untersuchen, biochemischen und molekularbiologischen Eigenschaften in eine einzelne Zelle Art und Weise, um sie von anderen Zelltypen Blatt zu isolieren. In der Vergangenheit haben Wache Zelle Studien häufig die Vorbereitung der Guard Zelle Protoplasten (GCP)3,4,5beteiligt. Dies in der Regel erfordert die Verwendung von großen Mengen an Zellwand entwürdigende Enzyme und oder mechanische Störungen über mischen und hat bewiesen, kostspielig und zeitaufwendig sein, dauert in der Regel viele Stunden zur Vorbereitung einer GCP-Probe, oft mit wenig Ertrag Zeiten. Noch wichtiger ist, weil Schließzellen als komplette Paare, Spaltöffnungen Blende Regeln handeln, die Verwendung von GCP als ein künstliches System zu studieren, Guard Zelle Signalisierung ersichtlich.
Hier entwickelten wir eine Methode um Spaltöffnungen vorzubereiten, in denen intakt Schließzellen sind bereichert und physiologische Reaktionen auf Reize zu erhalten. Diese Methode wurde eine Methode, die verwendet wurde, um Mesophyll Zelle Protoplasten6,7zu isolieren. In unserer Methode sind Spaltöffnungen vorbereitet mit klarem Tesafilm, zunächst die Mehrheit der Mesophyll Zellen trennen die adaxial Schicht des Blattes aus der abaxial Schicht mit dem Pflaster und der Schließzellen beigefügt. Dies geschieht durch Anbringung ein Stück Klebeband auf beiden Seiten des Blattes und schälen sie auseinander. Die Zellen aus dem abaxial Layer dürfen unter Licht in einem Spaltöffnungen-Eröffnung-Puffer zu erholen. Später werden die verbleibenden Zellen Pflaster entfernt mit einer kleinen Menge der Zellwand entwürdigende Enzyme, Guard-Zelle, die angereichert werden, auf dem Band zu hinterlassen.
In dieser einfachen Methode Stomata Schließzellen, die tragfähig und reaktionsfähig sind schnell und effizient werden vorbereitet, dauert weniger als eine Stunde angereicherten Stomata Schließzellen von 50 Schalen mit minimalen Kosten zu erhalten. Die Methode hier erlegt weniger Schäden an den Pflanzenzellen als bisherige Methoden dem Protoplasten zubereitet werden. Darüber hinaus Materialien von dieser Methode Ertrag wünschenswert Protein Mengen gesammelt. Vor allem, weil das Blatt nicht mischen unterliegt oder langwierige Verdauung Zeiten und die Schließzellen intakt sind, die Ergebnisse der Studien genauer werden darauf ein Guard natürliche Zellbiologie relevant sein. Mit dieser Methode können die Stomata Bewegungen mit Veränderungen auf molekularer Ebene in Echtzeit korreliert werden. Erkenntnisse aus Studien mit dieser Vorbereitung Methode wäre so wichtig für ein umfassenderes Verständnis der Guard Zelle Signalisierung.
Wir verwendeten die Pflanze Arabidopsis Thaliana als Vorbild; jedoch kann dieses Protokoll zur Bereicherung der Stomata Schließzellen in andere Pflanzenarten wie Brassica Napus mit kleinen Änderungen in der Verdauung Zeit angewendet werden. Als ein Proof of Concept haben wir bewiesen, dass Stomata Schließzellen, angereichert mit dieser Methode lebensfähig und reagieren auf Reize wie Fluorescein Diacetat (FDA) Assay und Studien unter Verwendung der Pflanzenhormon Abscisic Acid (ABA), bzw. zeigen. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass qualitativ hochwertige Proteine von diesen Schließzellen isoliert werden können. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll dieses Prozesses.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:889px;" width="889">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Stainless Steel Surgical Scalpel</td>
			<td style="width:297px;">Feather&#160;</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NC9999403</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Scotch Tape (3M)</td>
			<td style="width:297px;">ULINE</td>
			<td style="width:119px;">S-9781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR455701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cellulase (Onozuka R-10)&#160;</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Macerozyme R-10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>21560003-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">DM6000B Microscope&#160;</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;PI78443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3119-0030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZQ Protein Quantitation Kit</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R33200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescein Diacetate (FDA)</td>
			<td style="width:297px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F1303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Abscisic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Metro Mix 500</td>
			<td style="width:297px;">BWI Companies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TX-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Bio-Safe Comassie (G-250)</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">161-0786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microcentrifuge Tube (2mL)</td>
			<td style="width:297px;">USA Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1620-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:297px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Tweezers&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4017-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td style="width:297px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:297px;">Fisherbrand</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stomata tape-peel: an improved method for guard cell sample preparation

Das Studium der Schließzellen ist wichtig, das Wissen um die spezifischen Beiträge dieser Zelle Art die Gesamtfunktion der Pflanzen. Allerdings ist es oft schwierig, zu isolieren und damit oft zu studieren, stellt eine Herausforderung dar.
Diese Studie legt eine Stomata Guard Zelle Bereicherung Methode. Das Protokoll nutzt Tesafilm um die Schließzellen isolieren und Proteine aus den Zellen zu extrahieren. Diese Methode verbessert die Integrität und den Ertrag der Guard Zelle während der Isolierung und bietet eine zuverlässige Probe für die Untersuchung der Signalisierung Zellprozesse und wie sie mit Stomata Bewegung Phänotypen korrelieren. Bei dieser Methode wurden die Blätter der Pflanze zwischen beiden Teilen der Band partitioniert und geschält auseinander um der abaxial Seite zu entfernen. Dieses Protokoll wurde an Arabidopsis Blattgewebe Schließzellen isolieren angewendet. Die Zellen wurden mit Fluorescein Diacetat (FDA) Lebensfähigkeit zu bestimmen und Abscisic Säure (ABA) einzuschätzen Spaltöffnungen Bewegung als Reaktion auf ABA behandelt. Dieses Protokoll ist zusammenfassend erweist sich als nützlich für die Vorbereitung angereicherten Stomata Schließzellen und Proteine zu isolieren. Die Qualität der Zellen und Proteine erhalten Sie hier aktivieren physiologische und andere biologische Studien.

Ein repräsentatives Bild von Arabidopsis Schließzellen vor und nach der Verdauung des Mesophyll und Epidermiszellen in Abbildung 1dargestellt ist. Guard Zellviabilität vor und nach der Entfernung des Mesophyll und epidermalen Zellen kann mit der FDA um zu messen, enzymatische Aktivität und Integrität der Zellmembran (Abb. 1 b und 1D) beobachtet werden. Abbildung 2 veranschaulich...

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Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des Vorbereitens angereicherten Stomata Schließzellen, die nützlich für physiologische und andere biologische Studien.

Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Aufrufe.  University of Florida. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des Vorbereitens angereicherten Stomata Schließzellen, die nützlich für physiologische und andere biologische Studien.

Serie: Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montage-, Lade-und Alignment einer analytischen Ultrazentrifuge Messkammerdirektanschluss

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Erstellung von Qualitäts-Inositol Pyrophosphate

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...