Unterstützt durch die JDRF, die NIH (R01-DK081469), der Commonwealth of Pennsylvania (Center for Excellence in der Regenerativen Medizin zu gewähren 4100043362), der March of Dimes (Basil O&#39;Connor Starter Scholar Research Award) und der University of Pennsylvania DERC Pilot und Machbarkeit zu gewähren (DK19525).

1. Labeling Gewebe mit CldU und IdU <ol><li> Lösen Sie Thymidin-Analoga (CldU oder IDU) in Wasser. Wiegen Sie 1 mg / mL des jeweiligen chemischen und fügen Sie Glasflaschen von destilliertem Wasser zu trennen. Wir bereiten in der Regel 1 Liter je zu einem Zeitpunkt. </li><li> Lösen Sie die Chemikalien auf einer Rührplatte oder eine andere Form der Agitator. CldU wird in 10 min zu lösen. Rühren bei Raumtemperatur. IdU erfordert mehr als eine Stunde Rühren bei 37 ° C in einem Shaker. Wasserquellen, die beeinflussen können IdU Löslichkeit. Wenn IdU bleibt ungefederten nach über Nacht geschüttelt, versuchen Sie eine saubere Wasserquelle. Die Lösungen sind bei 4 ° C im Dunkeln gelagert. </li><li> Verwalten der ersten Thymidin enthaltenden Lösung (entweder CldU oder IDU), um die Mäuse für den gewünschten Zeitraum Kennzeichnung. Nicht in Mäusen den Zugang zu unmarkiertem Wasser während der Zeit der Label haben. Wenn die benannten Kennzeichnung Zeitraum abgeschlossen ist, beginnt eine Auswaschung mit unmarkierten Wasser für mindestens 24 Stunden (das Thymidin mit Analoga Serum Halbwertszeiten von mehreren Stunden). Verwalten der zweiten Thymidin enthaltenden Lösung (entweder CldU oder IDU), um die Mäuse für den gewünschten Zeitraum Kennzeichnung. Refill Wasserflaschen regelmäßig zu verhindern Austrocknung! </li><li> Alternativ können Mäuse durch sequentielle intraperitoneale Injektion von CdlU und dann IdU gekennzeichnet werden. Bereiten CldU oder IdU bei 10 mg / mL Konzentration. IdU kann verlangen, tropfenweise Zugabe von konzentrierter Natronlauge durch kräftiges Schütteln gefolgt, um in Suspension gehen. Fügen Sie nicht mehr als Natriumhydroxid. Fügen Sie einen einzigen Tropfen Natronlauge auf einen 10 mL Lösung von IdU gefolgt von einer Stunde Rühren bei 37 ° C in einem Shaker. Wenn nicht in Lösung, wiederholen Zugabe von Natronlauge. Inject 100mcg pro g Körpergewicht in den intraperitonealen Raum. </li><li> Die Kontroll-Objektträger sind für dieses Protokoll. Als Ergebnis empfehlen wir dringend, Ermittler führen mehrere Variationen Thymidinanalogon Kennzeichnung Sensitivität und Spezifität zu gewährleisten. Diese sollten 1. Mäuse, die nur mit CldU markiert wurden; 2. Mäuse, die nur mit IdU markiert wurden, 3. Mäuse, die nacheinander mit CldU und dann IdU markiert wurden, 4. Mäuse, die nacheinander in umgekehrter Reihenfolge markiert wurden, zunächst mit IdU und dann CldU, 5 Mäuse, mock nur mit Wasser gekennzeichnet sind. Beim Lernen auf Etikett mit CldU und IdU, sollten die Ermittler immer führen die gesamte Protokoll mit allen 5 oben setzt der Kontroll-Objektträger aus dem Gewebe von Interesse. </li></ol> 2. Tissue Harvest, Fixation und Slide Vorbereitung <ol><li> Mit entsprechenden Betäubung durchführen tödliche Überdosis und dann Opfer der Maus über Ausbluten. Nehmen Sie frisches Gewebe und fix mit 4% paraformalehyde bei 4 ° C für 24 Stunden. Transfer-Gewebe bis 1:4 Formalin-Puffer und lagern bei 4 ° C für die Einbettung. </li><li> Alternativ führen tödliche Überdosis und dann versorgen die Maus über die linke Herzkammer mit Kochsalzlösung, bis Blut aus dem Körper ausgeschieden wird, dann sofort mit 30-50 ccm 4% Paraformaldehyd perfundiert. Entfernen Sie das Gewebe von Interesse und speichern in 1:4 Formalin-Puffer bei 4 ° C für die Einbettung. </li><li> Nach Gewebe Dehydrierung und Einbettung in Paraffin, schneiden 5-Mikron-Gewebeschnitte und Ort auf geladene Objektträger. Backen Sie die Objektträger bei 65 ° C für 16 Stunden, um die Haftung des Gewebes zu rutschen sicherzustellen (essentielle mit Antigen-Retrieval Schritte unten). </li></ol> 3. Dehydration, Permeabilisierung und Antigen Retrieval <ol><li> Entfernen Sie überschüssiges Paraffin durch Eintauchen Dias in zwei Xylol Bäder für 5 min. jeder. </li><li> Rehydrieren das Gewebe durch Eintauchen Dias in Ethanol mit Wasser verdünnt: 100, 95, 90, 80 70 und 50%. Weichen Sie die Objektträger 3 min. bei jeder Konzentration, beginnend mit 100% und in Richtung 50% für die endgültige Eintauchen. </li><li> Waschen Sie die Objektträger für 5 min. in 1x PBS. </li><li> Permeabilisieren Zellen durch Eintauchen Dias in 0,2% Triton-X-Lösung für 5 min (aus frischen jedes Mal). </li><li> Bereiten Sie Folien für die Mikrowellen Gewebe Antigen-Retrieval. Setzen Sie die Dias in ein Becherglas mit einem ausreichenden Volumen 0,01 M pH 6,0 Natriumcitrat-Puffer, so dass die Lösung 5 cm über dem oberen Rand des Dias zu berücksichtigen Verdampfungsverluste abdeckt. </li><li> Mikrowelle gleitet, bis die Lösung kocht (3-10 min. Bei voller Leistung). Leistung reduzieren, bis die Lösung wird langsam kochendes (10-80%) und weiterhin für weitere 20 min. Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen, um sicherzustellen, Mikrowelle bleibt die Lösung bei einer langsamen Kochen bringen. </li><li> Legen Sie Becherglas mit Dias auf einer Bank-top und lassen Sie sie vorsichtig auf Raumtemperatur (ca. 2 Stunden) cool. </li><li> Bestätigen Sie, dass Objektträger bei Raumtemperatur mit einem Thermometer sind. </li><li> Tauchen Sie gleitet in 1.5N HCL für 40 min. bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Objektträger zweimal in 1X PBS, 5 min. pro Waschgang. </li></ol> 4. Primäre und sekundäre Antikörper <ol><li> Es ist wichtig, dass die Folien sehr feucht durch das gesamte Protokoll zu bleiben. Dry Gewebe wird viel mehr auto-Fluoreszenz, so dass die entstehenden Bilder unbrauchbar. Um zu verhindern, zu sterben, Prozess einer Folie zu einer Zeit. </li><li> Kreis jeden Abschnitt auf den Folien mit einer Flüssigkeit blockiert (dh, Wachs) pen. Legen Sie die Folien wieder in den Behälter 1x PBS. </li><li> Machen Sie einen feuchten Inkubationskammer, indem feuchte Papiertücher flach auf dem Boden einer luftdichten Kunststoffbehälter. </li><li> Make up Blocking Lösung von 10% Esel-Serum in 1x PBS verdünnt. Es ist wichtig, vollständig zu bedecken jeden Abschnitt mit der Lösung. Für Gewebeschnitten, die 1 x 1,5 Zentimeter sind, ist ein Volumen von 50 Mikroliter Lösung pro Abschnitt ausreichend. </li><li> Fügen Sie die Blocking-Lösung, um die Folien. Entfernen Sie Folie aus 1x PBS und beseitigen die überschüssige Flüssigkeit durch leichtes Antippen des Schiebers Rand auf einem Stapel von trockenen Papiertüchern. Legen Sie gleiten in Inkubationskammer und 50 Mikroliter 10% Block-Lösung zu jedem Abschnitt. Wenn alle Folien sind in der Nähe des Containers und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde abgeschlossen. </li><li> Bereiten primärer Antikörper Verdünnung auf IdU erkennen. Verdünnen Maus-anti-BrdU in einer Konzentration 1:250 in 5% Esel-Serum in 1x PBS hergestellt. Abzweiger Block-Lösung von Bild und Ort wieder in den Brutraum. Fügen Sie die oben genannten primären Antikörper zu jedem Abschnitt beimpft und über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Bereiten hoher Stringenz gewaschen (das minimiert Bindung von Maus-anti-BrdU Antiseren gegen CldU). Make up frische salzarme TBST-Puffer (36mm Tris, 50 mM NaCl, 0,5% Tween-20, pH 8,0). Sie benötigen 40 mL Puffer pro Paar Dias. 40 ml Puffer je 50 ml konischen Rohr. Vor dem Hinzufügen von Folien, Vorwärmung der Lösung auf 37 ° C. </li><li> Zwei in einer Zeit, zu entfernen Dias aus dem Brutraum, statt sie back-to-back (so dass Gewebeproben abgewandten zueinander), und tippen Sie das überschüssige Primärantikörper. Legen Sie die Folien in den Rohren mit wenig Salz TBST und Deckel gefüllt. Man schüttelt die Röhren für 20 min. in einem Schüttel-Inkubator Bakterienkultur mit der Temperatur bei 37 ° C, und die Geschwindigkeit eingestellt auf 225 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Waschen Sie die Slides zweimal in frischem 1X PBS. 5 min. pro Waschgang. </li><li> Vorbereitung der nächsten primärer Antikörper-Lösung für die Erkennung von CldU und Gewebe-Antigen, falls gewünscht. Verdünnen Ratte anti-BrdU in einer Konzentration 1:250 in 5% Esel-Serum in 1x PBS hergestellt. Verdünnen primären Antiseren gegen Gewebe-Antigen auf Arbeitsebene Konzentration in den primären Antikörper-Lösung. </li><li> Tippen Sie auf mehr als 1x PBS off der Folien möchten, und legen Sie sie in den Brutraum. Add primärer Antikörper zu jedem Abschnitt beimpft und über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Slides zweimal in frischem 1X PBS. 5 min. pro Waschgang. </li><li> Bereiten Sie den sekundären Antikörper-Lösung. Verdünnen Cy2 Esel-anti-Ratte bis 1:250 und Cy5 Esel anti-Maus bis 1:500 in 1X PBS Lösung mit 5% Esel-Serum. Add Cy3 sekundären zu primären Arten von Gewebe-Antigen-Antiseren erkennen. Auch verdünnen 0,4 mg / ml Stammlösung von DAPI bis 1:150 in sekundären Antikörper-Lösung. </li><li> Tippen Sie überschüssige 1X PBS abrutscht und in die Inkubationskammer. Add sekundären Antikörper-Lösung zu jedem Abschnitt und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Slides zweimal in frischem 1X PBS. 5 min. pro Waschgang. </li><li> Tippen Sie überschüssige 1X PBS off der Folien und haften Deckglas mit Prolong Gold-anti-fade Montage Medien (NICHT verwenden Vectashield mit dyanine Farbstoffe!). Drücken Sie auf Deckgläsern um Luftblasen zu entfernen. Lagerung bei 4 ° C. </li></ol> 5. Imaging and Analysis <ol><li> Bild des Gewebes von Interesse, mit einem Fluoreszenz-Mikroskop mit einer hohen Energie-Lichtquelle, Plan-Apochromaten, und einen hohen Wirkungsgrad Mikroskop-Kamera (z. B. Hamamatsu Orca ER) ausgestattet. Aufnehmen von Bildern in der AMCA (DAPI), Cy2 (CldU), Cy3 (Tissue-Antigen) und Cy5 (IDU) Kanäle. Merge Bilder zu einem einzigen Multi-Layer-Bilddatei zu erstellen. </li><li> Wenn richtig ausgeführt, wird DAPI gefärbte Zellkerne homogen hell ist. Tissue Antigens (zB Insulin) soll zeigen Zellen von Interesse. Wenn Färbung mit DAPI oder Gewebe-Antigen ist schwach oder inkonsistent sind, tauchen Folie in 1X PBS über Nacht zu entfernen Deckglas und wiederholen Anwendung der sekundären Antiseren. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf Gewebe-Antigen in Cy3. Überprüfen Sie CldU und IdU Färbung in Cy2 und Cy5-Kanäle, Umschalten zwischen Kanälen. Suchen Sie nach möglichen Kreuzreaktivität zwischen den Markierungen, wie durch übermäßige IdU und CldU Co-Positivität angegeben. Geben Sie für Gewebe, die nur CldU oder IdU enthalten. Mangelnde CldU oder IdU positive Kerne kann auf ein technisches Problem mit der Etikettierung oder Färbung. In diesem Fall ist für eine hoch replikativen Gewebe (zB Lymphknoten) zu suchen. </li><li> Analysieren Bilder. Anzeige Schichten mit DAPI und Gewebe-Antigen. Mit einer weißen Tafel Marker in der dominanten Hand und einer Zellzahl in der nicht-dominanten Hand, markieren jeder Kern mit einem kontrastierenden Marke mit einem trockenen löschen Marker (aka white board marker). Graf DAPI-positiven Zellen im Gewebe von Interesse. Rekordwert Zellzahl. Verwenden Sie ein trockenes Radiergummi Markierungen zu entfernen. Anzeige Schichts mit DAPI-, Gewebe-Antigen, und CldU. Graf CldU positiven Zellen im Gewebe von Interesse. Rekord CldU Zellzahl, aber nicht gelöscht markiert. Anzeige ändern, um Schichten, die Gewebe-Antigen, CldU und IdU visualisieren. Graf CldU IdU doppelt positive Zellen. Rekord-Wert, löscht alle Spuren und zeigen Schichten mit DAPI-, Gewebe-Antigen, und IdU. Zählen Sie die Gesamtzahl der IdU positiven Zellen im Gewebe von Interesse. Rekord IdU Zellzahl. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wir sequenziell beschriftet 6 Wochen alte weibliche Mäuse mit CldU für eine Woche und dann IdU für zwei Wochen, durch unmittelbare Opfer gefolgt. Bauchspeicheldrüsen wurden gefärbt, um CldU, IdU und Insulin (ein Gewebe Antigen) sowie DAPI zu erkennen. Inseln wurden gleichmäßig mit Insulin gefärbt. CldU Zellkernen unterschieden sich von IdU Zellkernen (Abbildung 2). Viele Kerne außerhalb der Insel wurden CldU IdU co-positive (Abbildung 2, unten rechts, weiße Pfeile). Ein einziges Insulin positive Zelle hatte Kernfärbung für beide CldU und IdU (Abbildung 2, unten rechts, magenta Pfeil). Mäuse. Alle Experimente mit Mäusen wurden nach den Richtlinien der IACUC Ausschuss des Kinderkrankenhauses von Philadelphia durchgeführt. Weibliche B6.129 F1-Wildtyp-Mäuse wurden von Taconic (Germantown New York), an der Versuchstier Anlage am Kinderkrankenhaus von Philadelphia untergebracht und gefüttert Maus Diet 5015 von PMI Nutrition International (Richmond. Indiana) gekauft. Labeling-Strategie. Durch die Markierung der ersten Zellteilung Veranstaltung mit CldU (grün markiert in diesem System) und die zweite Zellteilung mit IdU (rot markiert in diesem Schema), sequenzielle Zellteilung führt in Zusammenarbeit markierten Zellen mit beiden CldU und IdU (grün / rot) . Repräsentative Ergebnisse von Thymidin Kennzeichnung von Pankreas-Zellen Gesamtumsatzes in Mäusen. Immunfluoreszenz-Bild von einer Maus Bauchspeicheldrüse mit Inselchen Langerhans in der Mitte. Maus wurde mit CldU für 1 Woche und dann IdU für 2 Wochen in das Trinkwasser vor dem unmittelbaren Opfer infundiert. Pancreas Probe wurde wie im Protokoll beschrieben. 40x Bilder mit unterschiedlichen Schichten angezeigt eignet sich zum Zählen. Zusammengeführt Bilder enthalten DAPI (weiß) CldU (grün), IDU (rot), Insulin (gelb). (Oben, links) DAPI und Insulin. (Oben, rechts) CldU und Insulin. (Unten, links) IDU und Insulin. (Unten rechts) CldU, IdU und Insulin. Maßstab: 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Labeling-Strategie. Durch die Markierung der ersten Zellteilung Veranstaltung mit CldU (grün markiert in diesem System) und die zweite Zellteilung mit IdU (rot markiert in diesem Schema), sequenzielle Zellteilung führt in Zusammenarbeit markierten Zellen mit beiden CldU und IdU (grün / rot) . <img src="/files/ftp_upload/2166/2166fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse von Thymidin Kennzeichnung von Pankreas-Zellen Gesamtumsatzes in Mäusen. Immunfluoreszenz-Bild von einer Maus Bauchspeicheldrüse mit Inselchen Langerhans in der Mitte. Maus wurde mit CldU für 1 Woche und dann IdU für 2 Wochen in das Trinkwasser vor dem unmittelbaren Opfer infundiert. Pancreas Probe wurde wie im Protokoll beschrieben. 40x Bilder mit unterschiedlichen Schichten angezeigt eignet sich zum Zählen. Zusammengeführt Bilder enthalten DAPI (weiß) CldU (grün), IDU (rot), Insulin (gelb). (Oben, links) DAPI und Insulin. (Oben, rechts) CldU und Insulin. (Unten, links) IDU und Insulin. (Unten rechts) CldU, IdU und Insulin. Maßstab: 100 um.

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Alle Experimente mit Mäusen wurden in der Tierhaltung in der Kinderklinik in Philadelphia nach den Richtlinien des Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt.

Unser Ansatz zur Thymidin-basierten Ansatz zur Etikettierung Zellerneuerung hat viele potenzielle Anwendungen in der biomedizinischen Forschung. Bis heute haben wir uns auf die Bauchspeicheldrüse konzentriert, aber wir haben auch diese Strategie angewandt, um die Zellerneuerung der Haut, Darm, Leber, Nebenniere, Niere, Hoden-, Eierstock-, Schilddrüsen-, Lymphknoten, Blutbildung und Gehirn 1 zu untersuchen. Da die Zellerneuerung variiert von Gewebe zu Gewebe, sollte die Kennzeichnung Strategien individuell auf die spannendsten Informationen aus der Orgel von Interesse zu erhalten. Morrison und seine Kollegen verwendeten CldU und IdU für 1 Tag jeweils Hämatopoese 2 Label. Kuhn und seine Kollegen verwenden CldU und IdU für 4 Tage jeweils um die Zellteilung bei der Regeneration von Herzmuskel 3 zu detektieren. Im Gegensatz dazu haben wir CldU und IdU für bis zu 9 Monate insgesamt Basalzell Gesamtumsatzes in Pankreasinseln, einem Gewebe mit minimalem Zellerneuerung wie das Tier im Alter 1,4-6 Etikett verwendet. Die naheliegendste mögliche Anwendung unserer Strategie ist die Kennzeichnung für Studien zur Zellerneuerung im Gewebe Homöostase zu definieren. Aber unsere Technik hat mehrere weitere mögliche Anwendungen. Zum Beispiel haben wir kürzlich auch diese Technik angewendet, um onkogenen Transformation in Geweben, in denen Schwerpunkte der erhöhte Replikation leicht durch verstärkten Einbau von CldU oder IdU 5 kann identifiziert werden zu identifizieren. Morrison und seine Kollegen verwendeten CldU und IdU für 1 Tag jeweils für Etiketten Beibehaltung Verhalten von hämatopoetischen Stammzellen 2-Test. Wir haben auch sequentielle Thymidinanalogon Kennzeichnung zu ermitteln, ob Transit-Verstärkung Zellen zum Wachstum oder Erneuerung von Gewebe beitragen 1 angewendet. In dieser Anwendung sequenzielle Verabreichung von Thymidin-Analoga stellt einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung der Ursprünge und Überleben von Zellen im Gewebe eine Rolle spielt. Thymidin-Analoga sollte nicht ohne Vorsicht angewendet werden. Synthetische Thymidinanaloga haben potenzielle Toxizität auf sich teilende Zellen, und ihre Verwendung könnte theoretisch beeinträchtigen die Zellerneuerung in wachsenden Tieren. Thymidin-Analoga als radiosensibilisierende Agenten für Krebspatienten verwendet worden, und kann die Zellerneuerung langsam. So fordern wir Ermittler vorsichtig auf mögliche Toxizitäten in ihrem Gewebe von Interesse zu untersuchen. Zum Beispiel finden Trumpp und seine Kollegen, dass die systemische BrdU zwingen kann hämatopoetischen Stammzellen zu Zellzyklus 7 eingeben. So beobachtet Rutter und Kollegen, die eine hohe Dosis Thymidinanaloga giftig für die Entwicklung der Bauchspeicheldrüse 8 sind. In jüngerer Zeit Hellerstein und Kollegen an KineMed fand Inc, daß BrdU Verwaltung intra-Insel Verbreitung von 16-25% mit einem proprietären schwerem Wasser Markierungstechnik 9 verlangsamt. Die ganze Insel Vorbereitungen Hellerstein und seine Kollegen verwendeten enthielt viele andere endokrine und nicht-endokrinen Zelltypen, was so viel wie 50% der gesamten Insel Zubereitungen enthalten könnte. Allerdings finden wir, dass eine längere Infusion von BrdU hat keinen Einfluss auf beta-Zell-Proliferation in jungen erwachsenen Mäusen, wie Ki67 Expression 4 gemessen. Ebenso hat langfristige Gabe von CldU und IdU nicht scheinen, um Beta-Zellmasse Expansion 1 beeinträchtigen. Darüber hinaus sind Beta-Zell-Proliferation Äquivalent zwischen Mäusen mit BrdU für längere Zeit und Mäuse, die nur für ein paar Stunden (Preise werden in äquivalente Zeiträume normalisiert) sind beschriftet. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse, dass Mäuse, kann sicher tolerieren langfristige niedrig dosierte Gabe von Thymidin-Analoga. Dennoch können wir nicht ausschließen, potentielle Toxizität von Thymidin-Analoga in pankreatischen Beta Zellwachstum. Als Ergebnis wir weiterhin Kontrollen durchzuführen, wenn die Kennzeichnung Mäuse mit Thymidin-Analoga, und fordern andere Forscher, dies so gut zu machen. Unsere Technik der sequentiellen Thymidinanalogon Kennzeichnung ist nicht ohne Tücken und technischen Herausforderungen. Als Ergebnis sind Kontroll-Objektträger besonders wichtig. Wir haben die Kontrolle Folien, die aus verschiedenen Geweben besteht aus 1 erzeugt) Mäuse, die nur mit CldU markiert wurden,.. 2) Mäuse, die nur mit IdU markiert wurden;. 3) Mäuse, die nacheinander mit CldU und dann IdU markiert wurden;. 4) Mäuse, die nacheinander in umgekehrter Reihenfolge markiert wurden, zunächst mit IdU und dann CldU;. 5) Mäuse, mock nur mit Wasser gekennzeichnet sind. Beim Lernen auf Etikett mit CldU und IdU, sollten die Ermittler immer führen die gesamte Protokoll mit allen 5 oben Foliensätze aus dem Gewebe von Interesse. Leichte Kreuzreaktionen zwischen CldU und IdU ist eine unglückliche, aber unvermeidliche Kehrseite mit beiden Thymidinanaloga Kennzeichnung. Die CldU und IdU Technik basiert auf Unterschiede in der Affinität zwischen Antiseren, die ursprünglich gegen BrdU in verschiedenen Spezies (Maus und Ratte) wurden abgeleitet. Unser Protokoll, während schwerfällig, ist entworfen, um solche Kreuzreaktion zu minimieren. Daher fordern wir vorsichtig unter Forschern, die das Überspringen Schritt (e) des Protokolls zu prüfen. Insbesondere haben wirauftretende Probleme mit sekundären Antiseren, dass kreuzreaktive sind zwischen Maus und Ratte. Dies kann durch die Verwendung von Jackson Antiseren, die voll sind zwischen Maus und Ratte cross-adsorbiert minimiert werden. Wir haben gelegentlich nicht angemessen erkennen Thymidineinbau. In solchen Fällen ist es von entscheidender Bedeutung für positive Kontroll-Objektträger zu verwenden, um festzustellen, welche Reagenz oder Schritt nicht funktioniert. Die Schwierigkeiten sind in der Regel aufgrund der schlechten Aliquots von Antiseren, trocken Dias oder unzureichende nuklearen Permeabilisierung. Wir haben es versäumt, erfolgreich Label entwickelnden Embryonen mit IdU. So können nicht alle Gewebe durchlässig sein IdU. Alternativen zu CldU und IdU für Doppel Thymidinanalogon Kennzeichnung sind am Horizont. EdU (5-Ethinyl-2 desoxyuridin) kann ein Substrat für Kupfer-katalysierten Klick-Chemie-Erkennung 10,11 sein. EdU Nachweisverfahren benötigen keine Trennung von DNA-Strängen und sind somit sehr gut für Analyse mittels Durchflusszytometrie 12. Edu ist kompatibel, aber nicht kreuzreaktiv mit BrdU 10. EdU wurde verwendet, um die Zellerneuerung der verschiedenen Maus-Geweben, einschließlich Betazellen des Pankreas 13, Darm-L-Zellen 14 und Epidermis 15 quantifizieren. Edu ist ziemlich teuer im Moment ($ 1000 US-Dollar pro 500mg). Dennoch scheint Edu-Erkennung zu viel empfindlicher als BrdU-Erkennung 10. So könnte es wirtschaftlich machbar Edu und BrdU anstelle von CldU und IdU kombinieren. Diese Methode könnte auch erlauben, den drei verschiedenen Runden der Zellteilung in Mäusen dreifach für Edu, CldU und IdU gekennzeichnet. Zusammenfassend ist unsere Technik der sequentiellen Thymidinanalogon Kennzeichnung einen neuartigen Ansatz zur Erkennung Zellerneuerung. Wir hoffen, dass unser Ansatz ermöglicht es anderen Wissenschaftlern, um genauer zu quantifizieren Zellteilung, und erwarten, dass es neue Paradigmen in Gewebshomöostase öffnen.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-chloro-2-deoxyuridine (CldU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210547891</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedical</td>
<td>0210035701</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4% Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>19943</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% Buffered Formalin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>23-427-098</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYLENES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>EM-XX0060-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol, Anhydrous (Histological)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A405P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS, 10X Powder Concentrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton &#x2013;X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP151-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrochloric Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>BDH3028-2.5LG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Pharmingen</td>
<td>347580</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat mab anti BrdU</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Accurate Chemical</td>
<td>OBT0030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy2 donkey anti-rat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>712-225-153</td>
<td>Fully adsorbed secondaries from Jackson (minimal cross reactivity).</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy5 donkey anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson immuno</td>
<td>715-175-151</td>
<td>See above</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Cover Slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>C9056-1CS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>YFP Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49003 ET EYFP</td>
<td>Reduces auto-fluorescence in Cy2 channel</td>
</tr>
<tr>
<td>Cy3 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49004 ET Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy5 Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>49006 ET Cy5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ORCA ER Microscope Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>C4742-95-12ER</td>
<td>Excellent detection of fluorophores</td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>Do not use Vectashield (toxic to cyanine dyes).</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

immunofluorescent detection of two thymidine analogues (cldu and idu) in primary tissue

Genaue Messung der Zellteilung ist eine grundlegende Herausforderung in der experimentellen Biologie, die immer komplexer, wenn sich langsam teilenden Zellen analysiert werden wird. Etablierte Methoden zur Zellteilung zu erkennen sind direkte Visualisierung durch kontinuierliche Mikroskopie in Zellkultur, Verdünnung von entscheidender Farbstoffe wie Carboxyfluorescein di-aetate Succinimidylester (CFSE), Immuno-Detektion von mitogenen Antigene wie Ki67 oder PCNA und Thymidin-Analoga. Thymidin-Analoga kann durch eine Vielzahl von Methoden, einschließlich Radio-Erkennung für Tritium-Thymidin, Immun-Erkennung für Brom-desoxyuridin (BrdU), Chlor-deoxyuridin (CldU) und Iod-desoxyuridin (IDU) und der chemischen Erkennung für Ethinyl-desoxyuridin erkannt werden (EDU). Wir haben eine Strategie zur sequentiellen Aufnahme von verschiedenen Thymidin-Analoga (CldU und IDU) in das Gewebe erwachsener Mäuse zu erkennen abgeleitet. Unsere Methode erlaubt es Forschern, um genau zu quantifizieren zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung. Durch die Optimierung der Immunfärbung Protokolle unser Ansatz erkennt sehr niedrige Dosis Thymidinanaloga über das Trinkwasser, sichere Verabreichung an Mäuse für längere Zeit zu verabreichen. Folglich kann unsere Technik verwendet, um die Zellerneuerung in sehr langlebigen Geweben zu detektieren. Optimal immunofluoresent Färbung Ergebnisse können in mehreren Gewebearten, darunter Bauchspeicheldrüse, Haut, Darm, Leber, Nebennieren, Hoden-, Eierstock-, Schilddrüsen-, Lymphknoten und Gehirn erreicht werden. Wir haben auch diese Technik angewendet, um onkogenen Transformation im Gewebe zu identifizieren. Wir haben weiter diese Technik, um festzustellen, ob Transit-Verstärkung Zellen zum Wachstum oder Erneuerung von Gewebe beitragen angewendet. In diesem Sinne stellt sequenzielle Verabreichung von Thymidin-Analoga einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung der Ursprünge und Überleben von Zellen im Gewebe eine Rolle spielt.

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Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Wir haben eine Strategie zur sequentiellen Aufnahme von Thymidin-Analoga (CldU und IDU) in das Gewebe erwachsener Mäuse zu erkennen an zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung zu quantifizieren abgeleitet. Diese Strategie ist sinnvoll, die Zellerneuerung an langlebigen Geweben, onkogenen Transformation oder die Durchreise verstärkenden Zellen zu erkennen.

Immunfluoreszenz-Nachweis von zwei Thymidinanaloga (CldU und IDU) in primärem Gewebe

Accurate measurement of cell division is a fundamental challenge in experimental biology that becomes increasingly complex when slowly dividing cells are ...

immunofluorescent-detection-two-thymidine-analogues-cldu-idu-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue

30.4K Aufrufe.  University of Pennsylvania-School of Medicine. Wir haben eine Strategie zur sequentiellen Aufnahme von Thymidin-Analoga (CldU und IDU) in das Gewebe erwachsener Mäuse zu erkennen an zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung zu quantifizieren abgeleitet. Diese Strategie ist sinnvoll, die Zellerneuerung an langlebigen Geweben, onkogenen Transformation oder die Durchreise verstärkenden Zellen zu erkennen.

Serie: Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues CldU and IdU in Primary Tissue

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Forschung

Biologie

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Apoptose-Induktion und Detektion in einer primärer Kultur von Seegurken-Darmzellen

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

Einfacher Nachweis der primären Cilia durch Immunfluoreszenz

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Quantitativer Proteomik-Workflow mit multipler Reaktionsüberwachung basierender Detektion von Proteinen aus menschlichem Hirngewebe

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Immunfluoreszenzmarkierung von pflanzlichen Virus- und Insektenvektorproteinen in Hemipteren-Eingeweiden

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...