Name: a cell-free assay using xenopus laevis embryo extracts to study mechanisms of nuclear size regulation
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation at JoVE.com

Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Alle Xenopus Verfahren und Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den NRC - Führer für die Pflege und Verwendung von Labortieren 8. Auflage durchgeführt. Protokolle wurden von der University of Wyoming Institutional Animal Care und Use Committee (Assurance # A-3216-01) zugelassen. 1. Herstellung von X. laevis Ei - Extrakt (angepasst von 27,28) <ol><li> Prime weiblichen X. laevis Frösche ein Minimum von drei Tagen und höchstens zwei Wochen vor der Eiersammlung mit einem einzigen 100 IU Injektion von trächtigen Stute Serum - Gonadotropin (PMSG). </li><li> Einen Tag vor dem Experiment, injizieren grundierten Frösche mit 800 IE humanes Choriongonadotropin (HCG) und kann bei 16 ° C in 1 l pro Frosch von 1 / 3x Marc modifizierten Ringers (MMR). Siehe Tabelle 1 für alle Pufferzusammensetzungen. Hinweis: Einige Frösche werden nicht Eier legen oder wird schlechter Qualität Eier legen. Typischerweise 2 - 3 Frösche injiziert sufficien mindestens einen Frosch zu gewährleisten legent Zahlen von guter Qualität Eier. Die durchschnittliche Frosch wird lag genug Eier mindestens 1 ml Ei-Extrakt herzustellen. </li><li> Vorbereitung 1 L 1 / 3x MMR mit kaltem destilliertem deionisiertem Wasser (ddH 2 O), 500 ml Puffer B, 1 L Puffer C, 500 ml Puffer D und 100 ml Puffer E. </li><li> Transfer Eier zu einem Glas Kristallisierschale gelegt (150 x 75 mm). Unter Verwendung eines Kunststoff-Pasteur-Pipette mit der Spitze abgeschnitten, Bauernhof aus weißen geschwollenen aktivierte Eier oder lysiert Eier. Nur behalten Eier mit verschiedenen und gleich dunkel Tier Pole und weiß pflanzlich Pole. </li><li> Vorbereitung 13 x 51 mm-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml Puffer E mit 355 uM Cytochalasin D supplementiert zugegeben gerade vor in Schritt 1.7 zu verwenden. </li><li> Dejelly und die Eier zu waschen. <ol><li> Waschen Sie Eier kurz mit kaltem 1 / 3x MMR in einem entsprechend dimensionierten Becher, der Puffer 3 Wechsel - 4 mal. </li><li> Entfernen Sie die Gelee Mäntel aus den Eiern durch Inkubation mit Puffer B Diese nehmen überall von 3 bis 10 min. Da die trübe Gelee Mäntel sind aus dem Ei freigegebens, ändern Sie den Puffer. Anmerkung: Dejellying abgeschlossen ist, wenn die Eier fest in der Ecke der Schale verpackt erscheinen, wenn gekippt und vegetabile Pole nach unten gerichtet. Eier sind viel zerbrechlicher nach dejellying, also nicht brüten Eier mit Puffer B für länger als nötig und die anschließende Waschungen müssen sehr sorgfältig durchgeführt werden. </li><li> Wash Eier kurz mit 3-4 Änderungen von Puffer C </li><li> Wash Eier kurz mit 2 Änderungen von Puffer D </li><li> Wash Eier kurz mit 2 Änderungen Puffer E. </li></ol></li><li> Füllen Sie Zentrifugenröhrchen mit Eiern eine große Bohrung Glaspipette oder Plastiktropfen verwenden. Absaugen Überschüssigen Puffer. Um die Eier zu verpacken und so viel Puffer wie möglich, Zentrifuge in Schwingbecherrotor bei 212 × g für 60 Sekunden und dann bei 478 × g für 30 Sekunden zu entfernen. Absaugen Überschüssigen Puffer. Hinweis: Es ist wichtig, so viel überschüssigen Puffer wie möglich bei diesem Schritt zu entfernen, das Ei-Extrakt, um sicherzustellen, minimal verdünnt. </li><li> In einem Schwingen<html> Becherrotor, Ultrazentrifuge unter Vakuum für 15 min bei 12.000 xg und 4 ° C Eier geöffnet zu zerkleinern und in verschiedene Schichten trennen, wobei das Zytoplasma der bernsteinfarbene Schicht in der Mitte zu sein. Entfernen Zentrifugenröhrchen und Stelle sofort auf Eis. </li><li> Sammeln Sie den Extrakt. <ol><li> Unter Verwendung einer 18-Gauge-Nadel und Spritze durchbohren das Zentrifugenröhrchen gerade über der dunklen pigmentierte Schicht an der Unterseite des Rohres und entfernen Sie die mittlere bernsteinfarbenem zytoplasmatische Schicht. Sie nicht von der oberen Lipidschicht zu sammeln. Sammeln Sie das Zytoplasma in ein entsprechend dimensioniertes Rohr. Hinweis: Im Allgemeinen 1 Frosches erzeugt mindestens 1 ml Extrakt. </li><li> Supplement Zytoplasma mit 1/1000 das Volumen von 19,7 mM Cytochalasin D, 1/1000 das Volumen von LPC-Lager, und 1/50 das Volumen 50x Energiemix. vorsichtig umdrehen das Rohr zu mischen. Nicht übermäßig, den Extrakt pipettieren. </li><li> Halten Sie den Extrakt auf Eis und innerhalb von 3 Stunden der Vorbereitung für die besten Ergebnisse. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 2. Herstellung von Demembranated X. laevis Sperm (angepasst von 29) Hinweis: Die Prozedur Bände hier vorgestellten sind für bis zu 8 Hoden. <ol><li> Entfernen 0,05% Benzocain (10% Benzocain Lager in Ethanol hergestellt und verdünnt auf 0,05% in Wasser Frosch Tank) von 4 ° C und auf Raumtemperatur erwärmt. Anesthetize und männlichen X. opfern laevis Frösche in Benzocain Lösung bei Raumtemperatur für 20 - 30 min. Stellen Sie sicher, Tod durch Abwesenheit von Herzschlag durch die Untersuchung und das Gefühl der Brustbereich, durch mangelnde Reaktion auf mechanische Stimulation und / oder durch Enthauptung. </li><li> Machen Sie einen U-förmigen Schnitt entlang des Bauches. Entfernen Sie die tubulirte Masse von gelben Fettkörper. An der Spitze der Nieren, suchen Sie die Hoden, die Länge 29 blassrosa Massen etwa 1 cm in ovalförmig sind. Excise die Hoden und rollen sie auf Löschpapier Blut und andere Gewebe zu entfernen. </li><li> Waschen Sie die Hoden in Buffer T verwenden einen engen Einbau Stößel Hoden mit 1 ml Puffer zu HackfleischT in einem 1,5-ml-Röhrchen, bis sie homogen ist (10 Schläge oder mehr). Zentrifuge von 5 bis 10 sec in einem Mini-Zentrifuge und sammeln Sie den Überstand, Entfernung großer Gewebestücke. Wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal und den Überstand zu sammeln. </li><li> Übertragen, um die Spermien enthaltenden Lösung in ein 15 ml Kunststoffröhrchen. Erhöhen Sie die Lautstärke auf insgesamt 2 ml mit Puffer T. Zentrifuge bei 1411 × g für 10 min bei 16 ° C, um die Spermien zu pelletieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 500 ul Puffer T. Zentrifugation bei 1.411 xg für 10 min bei 16 ° C. Wiederhole diesen Schritt einmal oder zweimal bei Bedarf das Pellet von somatischen und roten Blutkörperchen zu reinigen. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 100 &amp; mgr; l Puffer T und 300 &amp; mgr; l Buffer S. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Hinweis: Puffer S enthält Lysolecithin, die für demembranation verantwortlich ist. </li><li> In drei Volumina Puffer R (frisch zubereitet vor der Verwendung). Invert Rohr genau einmal. Zentrifuge bei 1.411 xg für 15 min bei 16 &amp;# 176; C. </li><li> Das Pellet in 400 ul Puffer R und dann eine weitere 2 ml Puffer R. Zentrifuge bei 1411 × g für 15 min bei 16 ° C hinzufügen. </li><li> Das Pellet in 50 ul Puffer T. </li><li> Verdünnen Sie 1 ul demembranated Spermakerne mit 9 ul Buffer T Wenden Sie diese Verdünnung auf einem Hämozytometer. Zählen Sie die Anzahl der dünnen S-förmigen Samenkerne in einem großen 4 x 4 Raster, und multiplizieren Sie diese Zahl mit 100, die Konzentration der Lager in Spermakerne pro ul zu erhalten. </li><li> Verdünnen Sie die Lager auf 100.000 Spermakerne pro ul mit Puffer T, in einem 200x Lager führt. Bereiten Sie 3-5 ul Aliquots. Blitzeis in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. </li></ol> 3. Nuclear Assembly <ol><li> Supplement 100 ul Eiextrakt mit 1,5 &amp; mgr; l 35,5 mM Cycloheximid (Endkonzentration ~ 0,5 mM), 6 ul 20x Calciumvorratslösung (Endkonzentration ~ 0,6 mM) und 0,7 &amp; mgr; l 200x Spermien (Endkonzentration ~ 700Spermakerne / ul). Skalieren Sie das Reaktionsvolumen nach oben oder unten wie nötig. Umkehren oder sanft zu mischen tippen. Hinweis: Auszug aus der Metaphase in Interphase radelte bietet eine robuste und zuverlässige Plattform für die Kernbaugruppe. </li><li> Inkubieren in einem Wasserbad bei 16-20 ° C für 90 min. Mischen Sie vorsichtig alle 15 min klopfen, um sicherzustellen, Kerne im Extrakt suspendiert bleiben. </li><li> Überwachung der Fortschritte der Kernbaugruppe bei 45 min durch einen Squash-Vorbereitung wie folgt. <ol><li> Pipettieren 2 ul Extrakt auf einen Glasträger und mit 2 ul Kern fix. </li><li> Overlay mit einem 22 mm 2 Deckglas. Bild auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit Wasser, Öl oder Luft 20 - 100X Ziele und eine DAPI-Filter. Anmerkung: Nuclei durch Hellfeld-Bildgebung sichtbar gemacht werden, sondern sind viel leichter durch Fluoreszenz sichtbar zu machen. </li><li> Verwenden Sie Kerne sofort oder Flash-Freeze-Aliquots in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Hinweis: Hinzufügen von 4% Glycerin auf die Kerne prIOR zum Einfrieren helfen kann, ihre Integrität zu erhalten. Gefrorene Kerne sind in der Regel noch lebensfähig und in der Lage Kernimport jedoch das Einfrieren Prozess gestört oder mehr strukturell fragile Kerne führen kann. Kerne bis zu einem Jahr nach dem Gefrieren verwendet werden. </li></ol></li></ol> 4. Herstellung von X. laevis Embryo - Extrakt <ol><li> Induce weiblich X. laevis Frösche Eier zu legen , wie in 1.1 und 1.2 beschrieben. </li><li> Isolieren Hoden von männlichen X. laevis Frösche wie in 2.2 beschrieben. Versenken Hoden in L15 Medien, ergänzt mit 50 IU / ml Penicillin und Streptomycin in einem Glas 35 x 10 mm Petrischale. Lagerung bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen. </li><li> Sammeln und befruchten Eier. <ol><li> Sammeln frisch gelegte Eier durch Frösche über einem Glas wieder verwendbaren Petrischale hält und Eiablage fördern durch leichten Druck auf den unteren Rücken in der Nähe der Kloake. Quetschen der Frosch zu hart zu Verletzungen führen kann, was zu einem aufgeblähten Bauch und erfuiring Euthanasie 29. </li><li> Prop das Gericht bei einem ungefähren Winkel von 45 °, lassen Eier in den Rand der Schale zu sammeln, entfernen Sie alle überschüssigen Puffer, und fügen Sie MMR genug 1 / 3x kaum die Eier decken. Düngung Eier innerhalb von 15 Minuten der Sammlung. </li><li> Verwenden Sie einen festen Sitz Stößel aufzuweichen und homogenisieren 1/4 eines Hodens in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 500 ul Hochsalz Modified Barths Saline (High Salt MBS). Hinzufügen mazerierten Hoden auf die Eier und ermöglichen Befruchtung bei Raumtemperatur erfolgen für 15 bis 20 min, dann überschwemmen Eier mit 1 / 3x MMR. Anmerkung: Die Wirksamkeit der Hoden nimmt mit Lagerzeit kann daher Hoden Gewebe für eine erfolgreiche Befruchtung erforderlich sein, wenn Hoden verwenden, die länger als eine Woche gelagert wurden. </li><li> Bestätigung der Befruchtung von für die Kontraktion des dunklen pigmentierten animalen Pol Prüfen und durch die Drehung der Embryonen mit ihren Tierpole nach oben zeigen, in der Regel etwa 20 - 30 min nach Zugabe von zerstoßenem testes. Erwarten Sie die erste Zelle Spaltung innerhalb von 90 min auftreten. </li><li> Mit einer breiten Bohrung Glaspipette sorgfältig tot (weiß und geschwollen oder ungleichmäßige Verteilung von Eigelb und Pigment) zu entfernen, lysiert oder unbefruchtete Eier (dh nicht gespalten), da sie rasch Tod im benachbarten Embryonen veranlassen wird. </li><li> Überall 1-2,5 Stunden nach der Befruchtung, dejelly Embryonen in 2 - 3% Cystein gelöst in 1/3 x MMR und auf pH 7,9 mit 10 N KOH. Führen Sie zwei Puffer Änderungen, die jeweils 3 - 4 min. Gründlich waschen Sie die Embryonen mit 6 bis 10 kurze Änderungen von 1 / 3x MMR alle Spuren von Cystein zu entfernen. Hinweis: Dejellied Embryonen haben eine Vitellinmembran und sind nicht so zerbrechlich wie dejellied Eier. </li></ol></li><li> Mit einer breiten Bohrung Glaspipette, übertragen gesund befruchtet (dh gespalten) Embryonen in eine Petrischale frisch 1 / 3x MMR enthält , und es ihnen ermöglichen, auf die gewünschte Stufe bei RT oder zu entwickeln , wenn langsamere Entwicklung bevorzugt wird, 16 ° C. Weiter zu entfernen abgestorbene oder lysed Embryonen, die durch Mangel an erste Abteilung oder weißen geschwollenen Aussehen gekennzeichnet. </li><li> Überprüfen Sie die Stufe der Embryonen , die durch fast vollständige Schließung der Blastoporus Überprüfung und von 24 bis Zeichnungen inszenierter Embryonen in Referenzmaterialien verglichen wird . Hinweis: Die Embryonen bei 16 ° C kultiviert Stufe 11,5 erreichen - 12 in ca. 12 Stunden. </li><li> Inkubieren Stufe 11,5-12 Embryonen in frischem 1 / 3x MMR ergänzt mit 0,5 mM Cycloheximid für 1 h bei RT, Embryonen im späten Interphase zu verhaften. </li><li> Transfer mit breiten Bohrung Glas oder Plastikpipette mindestens 15 (vorzugsweise 30 oder mehr) Interphase verhaftet Embryonen zu einem Reaktionsgefäß. Hinweis: 15 Embryonen ausreichend sind, etwa 20 &amp; mgr; l Extrakt herzustellen. Scale up nach Bedarf. </li><li> 1 ml Ei Lysepuffer (ELB), ergänzt mit 1 ul LPC Lager. Vorsichtig umdrehen Embryonen zu waschen, lassen Embryonen auf den Boden des Röhrchens zu fallen, und den Puffer zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zwei weitere Male. &lt;/ Li&gt; <li> Resuspendieren Embryonen in 500 ul ELB plus 0,5 ul LPC Lager, 5 ul 19,7 mM Cycloheximid und 5 ul 35,5 mM Cytochalasin D (bis Aktin-Polymerisation hemmen). Zentrifuge bei 200 × g für 1 min in einer Tischmikrozentrifuge. </li><li> Überschüssigen Puffer und mit einem Stößel, um gründlich die Embryonen zu vernichten. Zentrifuge in einem Schwingbecher-Rotor für 10 min bei 10.000 × g und 16 ° C. </li><li> Stechen Sie die Lipidschicht von oben mit einer 200 ul Pipettenspitze. Mit einem sauberen 200 ul Pipettenspitze, entfernen Sie die mittlere Cytoplasma-amber-farbige Schicht auf eine geeignete Größe Rohr. </li><li> Supplement Embryoextrakt mit 1/50 des Volumens von 50x Energiemix (ATP-Regenerationssystem zur Verfügung zu stellen), 1/100 das Volumen von 35,5 mM Cycloheximid, 1/500 Volumen von 19,7 mM Cytochalasin D und 1 / 1.000 das Volumen der LPC Lager. </li><li> Bereiten Sie einen Squash, wie in 3.3 beschrieben, um endogene embryonalen Kerne in dem Extrakt zu visualisieren. Hinweis: Embryo-Extrakt kann mit eingefroren werden<html> die endogenen Kerne an dieser Stelle. Aliquotieren zu reduzieren Frost / Tau-Zyklen und bei -80 ° C. </li><li> Zum Entfernen von Kernen aus dem Embryo-Extrakt, verdünnt den Extrakt mit einem gleichen Volumen von 1/50 ELB das Volumen 50x Energie Mischung enthält, 1/100 das Volumen von 35,5 mM Cyclohexamid, 1/500 das Volumen von 19,7 mM Cytochalasin D, und 1/1000 das Volumen der LPC-Lager. Zentrifuge in einem Schwingbecher-Rotor bei 17.000 xg für 15 min bei 16 ° C. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit wird vorsichtig jegliches verbleibende Lipid an der Spitze zu vermeiden. Nicht die pelletierten Kerne an der Unterseite des Rohres stören. Bereiten Sie einen Squash beschrieben, wie in 3.3, um sicherzustellen, dass die meisten Kerne entfernt wurden. Verwenden Sie den Extrakt frisch oder aliquoten und bei -80 ° C. </li><li> Aufzuheizen Embryoextrakt für Kontrollversuche, Wärme 30 inaktivieren - 100 ul Aliquots des Extraktes bei 56 ° C für 30 min unter Verwendung eines Thermocyclers verwenden. Lassen Sie hitzeinaktiviertem Extrakt auf Raumtemperatur vor der Verwendung zurückzukehren. </li></ol>_title &quot;&gt; 5. Nuclear Schrumpf Assay und Immunofluoreszenz <ol><li> Isolieren Sie Kerne in Ei-Extrakt zusammengebaut durch Verdünnung 25-150 ul vormontierter Kerne in 1 ml ELB in einem 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 1.600 × g für 3 min bei 4 ° C in einer Tischmikrozentrifuge. Entfernen Sie Puffer, wobei darauf geachtet, nicht die fragile Pellet der Kerne an der Unterseite des Rohres zu stören. </li><li> Resuspendieren Kerne in einem Volumen von Embryoextrakt gleich dem ursprünglichen Volumen der in 5.1 verwendeten Ei-Extrakt. Verwenden Sie ELB oder Hitze inaktivierten Extrakt für Kontrollreaktionen, als angemessen. </li><li> Ziehen Sie das Rohr tippen Sie auf das Pellet und resuspendieren die Kerne aufzubrechen. 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, sanft das Rohr klopfen alle 15 zu mischen - 30 min. Hinweis: Die meisten der Kernschrumpfung innerhalb der ersten 30 min erfolgt. </li><li> Überwachung der Fortschritte der Kernschrumpfung durch einen Squash vorbereitet. <ol><li> Pipettieren 2 ul Extrakt auf einen Glasträger und mit 2 ul Kern fix. </li><li> Overlay mit einem 22 mm 2 </sup&gt; Deckglas. Bild auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop. </li></ol></li><li> Tippen Sie auf das Rohr die Kerne unmittelbar vor der Zugabe von 500 &amp; mgr; l Fixiermittel zu suspendieren, bestehend aus ELB, 15% Glycerin und 2,6% Paraformaldehyd. Invert sofort, und legen Sie den Schlauch auf einem Rotator für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Sie Spin-down-Rohre durch die Ausstattung 15 ml Rundboden-Glasröhrchen mit rundem Boden Kunststoff-Einsätze (Design und Schemata auf Anfrage erhältlich). 5 ml Kernkissen Puffer. Werfen Sie einen 12 mm Kreisdeckglas in die Röhre, sicher zu sein, es auf der Oberseite der Kunststoffeinsatz flach aufliegt. </li><li> Schicht vorsichtig die Lösung feste Kerne auf der Oberseite des Kernkissen, das eine breite Bohrung Pipettenspitze verwenden. Zentrifuge in einem Schwingbecher-Rotor für 15 min bei 1000 xg und 16 ° C. </li><li> Verwenden eines Aspirators alle dem Puffer zu entfernen, und der Kunststoffeinsatz an der Oberseite des Rohres ziehen. Entfernen Sie das Deckglas mit einem Paar von feinen Pinzette, vorsichtig auf die Seite der Abdeckung zu beachtengleiten auf dem wurden die Kerne gesponnen. Post-fix in kaltem Methanol für 5 min bei RT (bei -20 ° C gelagert). </li><li> Übertragen Sie die Deck Kern Seite nach oben auf ein Blatt aus Kunststoff Paraffinfilm eine große Petrischale aus Kunststoff Futter. Platzieren wet Einwegtücher an der Seite der Schale Austrocknung zu verhindern. </li><li> Rehydrieren Kerne auf dem Deckglas mit 500 ul PBS-NP40 (1x PBS plus 0,1% NP40) und Aspirat nach von 5 bis 10 sec. </li><li> Schicht vorsichtig 75 &amp; mgr; l PBS-3% Rinderserumalbumin (BSA) auf dem Deckglas. Erlauben 1 Stunde bei Raumtemperatur zu blockieren oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Blockierungslösung und Inkubieren mit primärem Antikörper (zB mAb414 gegen den Kernporenkomplex, 1: 1000) , verdünnt in PBS-3% BSA für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. Waschen Sie sich mit fünf sofortige Änderungen von PBS-NP40. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper, verdünnt in PBS-3% BSA für 1 h bei RT. Waschen Sie sich mit fünf sofortige Änderungen von PBS-NP40. </li><li> bebrütenmit 10 &amp; mgr; g / ml Hoechst verdünnt in PBS-3% BSA für 5 min bei RT. Waschen fünfmal mit PBS-NP40. Entfernen Sie alle überschüssigen Puffer. </li><li> Montieren Sie das Deckglas auf einen Objektträger mit 5 ul verblassungshemmenden Eindeckmediums. Siegel mit klarem Nagellack. Bild sofort mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit 20 - 100x Objektive oder lagern bei 4 ° C für eine spätere Bildgebung. Hinweis: Führen Sie die Quantifizierung , wie zuvor 23 beschrieben. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink...

Die Größen der Zellorganellen maßstabs typischerweise mit der Größe der Zelle, und das mit der Zellgröße 1-10 für die Skalierung der Kerngröße ist vielleicht am besten dokumentiert. Dies gilt insbesondere während der Embryogenese und der Zelldifferenzierung, wenn dramatische Verringerungen sowohl in Zell- und Kerngröße häufig 11,12 beobachtet. Ferner verändert Kerngröße ist ein wichtiger Parameter bei der Krebsdiagnose und -prognose 13-17. Die Mechanismen, die zur Kerngrößenregulierung beitragen, sind weitgehend unbekannt, aufgrund der Komplexität und Wesen der Kernstruktur und Funktion teilweise. Das Verfahren hier wurde als ein in vitro - Assay für die Kerngröße Skalierung beschrieben entwickelt, die biochemische Manipulation und Aufklärung von Mechanismen der Kerngrößenregulierung zugänglich ist. Xenopus laevis Ei - Extrakt ist ein gut etabliertes System komplexe zelluläre Prozesse in einem in - vitro zu rekapitulieren und studieren </em&gt; Kontext. Diese Extrakte haben ergeben , neue grundlegende Informationen über verschiedene zelluläre Prozesse einschließlich der Montage und Funktion der mitotischen Spindel, endoplasmatischen Reticulum und Kern 18-22. Ein wesentlicher Vorteil des Systems ist , dass Extrakt X. Eiextrakten laevis stellen eine nahezu unverdünnten Zytoplasma deren Zusammensetzung kann leicht verändert werden, beispielsweise durch Zugabe von rekombinanten Proteinen oder Immunodepletion. Weiterhin ist eine wesentliche Prozesse manipulieren können durch Behandlungen , die die ansonsten letalen in einem in vivo - Kontext sein könnten. Änderungen des Eies Extrakt Verfahren ermöglichen eine Trennung von Auszügen aus X. laevis Embryonen statt Eier, und diese Embryo - Extrakte sind gleichermaßen zugänglich biochemische Manipulation 23. Während X. laevis - Entwicklung, die Einzelzell befruchteten Embryo (~ 1 mm Durchmesser) durchläuft eine Reihe von zwölf schnellen Zellteilungen (Stufen 1 bis 8) bis zu mehreren Tausend erzeugen 50 μm Durchmesser und kleinere Zellen, eine Entwicklungsstufe erreicht nannte die midblastula Übergang (MBT) oder Stufe 24 bis 26 August. Der MBT wird durch den Beginn der zygotischen Transkription, Zellmigration, asynchrone Zellteilungen, den Erwerb von Spaltphasen und Errichtung von Kern Steady-State-Größen statt kontinuierliche Ausbau der Kernkraft wie in der Pre-MBT Embryo aus. Von Stufe 4 bis Gastrulation (Stufen 10,5-12), verringert sich das Volumen der einzelnen Kerne um mehr als 10-fach 11. Hier ist das Ziel, die Mechanismen zu identifizieren, die für diese Verringerung der Kerngröße während der Entwicklungsfortschritt. Der Ansatz besteht darin, zunächst Kerne montieren in X. laevis Ei - Extrakt und um diese Kerne aus dem Ei Zytoplasma / Extrakt isolieren. Diese Kerne werden dann in Zytoplasma von Ende Gastrulastadium Embryonen erneut suspendiert. Nach einer Inkubationszeit, werden die Kerne aus Ei-Extrakt kleiner Extrakt späten Stadium Embryo. Wir schlussfolgerten, dass diese would ein nützlicher Test sein für die Identifizierung zytoplasmatische Komponenten in späten Stadium Embryonen, die zur Entwicklung der Kerngrößenskalierung beitragen. Unter Verwendung dieses Tests in Verbindung mit in vivo - Validierung, haben wir gezeigt , dass die Proteinkinase C (PKC) trägt zur Entwicklungs Verringerungen der Kerngröße in X. laevis 23.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ATP disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Beckman</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>chymostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>creatine phosphate disodium</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>cytochalasin D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>disposable wipes (kimwipes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glass crystallizing dish (150 x 75 mm)</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Macron</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - Human Chorionic Gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Lysolecithin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin + Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Plastic paraffin film (parafilm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Prospec</td><td>hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom glass tubes, 15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge rotor</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (anti-fade mounting medium)</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

a cell-free assay using xenopus laevis embryo extracts to study mechanisms of nuclear size regulation

Eine grundlegende Frage in der Zellbiologie ist wie Zell- und Organell Größen reguliert werden. Es ist seit langem erkannt worden, dass die Größe des Kerns im allgemeinen mit der Größe der Zelle skaliert, insbesondere während der Embryonalentwicklung, wenn dramatische Verringerungen sowohl in Zell- und Kerngrößen auftreten. Mechanismen der Regulation der Kerngröße sind weitgehend unbekannt und kann zu Krebs relevant sein , wenn veränderte Kerngröße ein wichtiger diagnostischer und prognostischer Parameter ist. In - vivo - Ansätze zur Kerngröße Regula Identifizierung mit den grundlegenden und komplexen Natur der Kernfunktion kompliziert sind. Die in vitro - Ansatz hier beschriebenen Kerngrößensteuerung zu studieren nutzt die normale Verringerungen der Kerngröße , die während der Xenopus laevis Entwicklung auftreten. Zuerst werden Kerne in X. zusammengebaut laevis Ei - Extrakt. Dann werden diese Kerne isoliert und in Zytoplasma von späten Stadium Embryonen erneut suspendiert. Nach einer 30-90 min Inkubationszeit, Kernflächeverringert sich um 20 bis 60%, einen nützlichen Test bietet Cytoplasma-Komponenten, die in späten Stadium Embryonen zu identifizieren, die zu Entwicklungskerngrößenskalierung beitragen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Vorgehensweise ist die relative Leichtigkeit, mit der das Ei und Embryoextrakte können biochemisch manipuliert werden, so dass für die Identifizierung neuer Proteine ​​und Aktivitäten, die Kerngröße zu regulieren. Wie bei jedem in vitro - Ansatz, der Validierung der Ergebnisse in einem in vivo - System ist wichtig, und die Mikroinjektion von X. laevis Embryonen ist für diese Untersuchungen besonders geeignet.

Versammlung der Nuclei in Egg Extract Die ersten Schritte dieses Protokolls sind X vorzubereiten laevis Ei - Extrakt (Protokoll 1) und demembranated Samenkerne (Protokoll 2). Diese Reagenzien werden dann verwendet , um Kerne montieren de novo (Protokoll 3). Abbildung 1 zeigt einige repräsentative Daten. Die Zugabe von Kalzium treibt die meiotisch verhaftet Ei-Extrak...

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A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Ein zellfreien Assay unter Verwendung von<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrahiert Mechanismen der Kerngröße Verordnung zum Studium

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

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Research

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Biology

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

8.3K Aufrufe.  University of Wyoming. Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Serie: A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Mittels konfokaler Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Um Modulatoren der Wnt und Shh Morphogen Gradienten Untersuchen

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Biochemie

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Biologie

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produktion von<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrakte Mikrotubuli-assoziierten RNAs identifizieren

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Ein zellfreien Assay unter Verwendung von

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Manipulation und

Mittels konfokaler Analyse

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

In Vitro Nuclear Assembly mit Fraktionierte Xenopus Egg Auszüge

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis

Herstellung transgener Xenopus laevis Durch Restriktionsenzym-vermittelte Integration und Reaktorsicherheit Transplantation

Produktion von

Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose