Name: a cell-free assay using xenopus laevis embryo extracts to study mechanisms of nuclear size regulation
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
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Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Todos os procedimentos e estudos de Xenopus foram realizadas em conformidade com o Guia NRC para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 8ª edição. Protocolos foram aprovados pela Universidade de Wyoming Institutional Animal Care e Use Committee (Assurance # A-3216-01). 1. Preparação de X. Extrato laevis Egg (adaptado de 27,28) <ol><li> Prime X. feminina laevis rãs um mínimo de três dias e um máximo de duas semanas antes da coleta de ovos com um único IU injeção de gonadotrofina de égua prenhe (PMSG) 100. </li><li> Um dia antes do experimento, injetar rãs imunizadas com 800 UI de gonadotrofina coriônica humana (HCG) e lugar a 16 ° C em 1 L por sapo de 1 / 3x toques modificados do Marc (MMR). Ver Tabela 1 para todas as composições de tampão. Nota: Algumas rãs não põem ovos ou põem ovos de má qualidade. Normalmente 2 - 3 rãs são injetados para garantir pelo menos um sapo vai colocar sufficiennúmeros t de ovos de boa qualidade. O sapo média põem ovos suficientes para produzir pelo menos 1 ml de extrato de ovo. </li><li> Prepare 1 G 1 / MMR 3x com água desionizada destilada fria (ddH2O), 500 ml de tampão B, 1 L de tampão C, 500 ml de tampão D e 100 mL de tampão E. </li><li> Transferência puseram ovos para um prato de cristalização de vidro (150 x 75 mm). Usando um plástico Pasteur pipeta com a ponta cortada, fazenda fora inchado activado ovos brancos ou ovos lisadas. reter apenas ovos com pólos animais escura distintos e iguais e pólos vegetais brancos. </li><li> Preparar 13 x 51 mm tubos de centrifugação com 1 ml de tampão E suplementado com 355 | iM de citocalasina D adicionado imediatamente antes da utilizao no passo 1.7. </li><li> Dejelly e lavar os ovos. <ol><li> Lavar os ovos brevemente com frio 1/3 x MMR em um copo de tamanho adequado, mudando o tampão 3 - 4 vezes. </li><li> Retire as peles de geléia de os ovos de incubação com tampão B. Isso vai demorar 3-10 min. Como os casacos de geléia nublados são liberados a partir do ovos, mudar o tampão. Nota: Dejellying é completa quando os ovos aparecem bem embalado no canto do prato quando inclinado e pólos vegetais são orientados para baixo. Os ovos são muito mais frágeis após dejellying, por isso não incubar os ovos com tampão B durante mais de lavagens necessárias e posteriores precisam ser realizadas com muito cuidado. </li><li> Lavar os ovos brevemente com 3 - 4 mudanças de tampão C. </li><li> Lavar os ovos brevemente com 2 mudanças de tampão D. </li><li> Lavar os ovos brevemente com 2 mudanças de tampão E. </li></ol></li><li> Preencha tubos de centrífuga com ovos usando uma ampla pipeta furo de vidro ou conta-gotas de plástico. Aspirar off tampão excesso. Para embalar os ovos e remover tanto tampão quanto possível, de centrifugação em rotor basculante a 212 xg durante 60 seg e em seguida a 478 xg durante 30 seg. Aspirar off tampão excesso. Nota: É importante remover tanto quanto possível o tampão em excesso neste passo para garantir o extracto de ovo é minimamente diluídos. </li><li> Numa oscilante<html> rotor de cesto, ultracentrífuga sob vácuo durante 15 min a 12000 xg e 4 ° C para esmagar ovos aberta e separar-se em camadas diferentes, com o citoplasma sendo a camada de cor âmbar no meio. Remover tubos de centrífuga e coloque imediatamente em gelo. </li><li> Recolher o extracto. <ol><li> Utilizando uma agulha de calibre 18 e seringa, perfurar o tubo de centrifugação imediatamente acima da camada pigmentada escura na parte inferior do tubo e remover a camada de cor âmbar citoplasmática meio. Não coletamos nenhuma da camada lipídica superior. Recolhe-se o citoplasma em um tubo adequadamente dimensionado. Nota: Geralmente, um sapo produz pelo menos 1 ml de extrato. </li><li> citoplasma suplemento com 1 / 1.000 o volume de 19,7 mM citocalasina D, 1 / 1.000 do volume de estoque LPC, e 1/50 do volume de 50x mix de energia. Inverta suavemente o tubo para misturar. Não excessivamente pipete o extrato. </li><li> Manter o extracto sobre gelo e usá-lo dentro de 3 horas de preparação para obter os melhores resultados. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 2. Preparação de Demembranated Sperm X. laevis (adaptado de 29) Nota: Os volumes de procedimentos aqui apresentados são para até 8 testículos. <ol><li> Remover 0,05% benzocaína (estoque benzocaína a 10% preparada em etanol e diluiu-se a 0,05% na água do tanque da rã) a partir de 4 ° C e aquecer até à temperatura ambiente. Anestesiar e sacrifício masculino X. laevis rãs em solução benzocaína à temperatura ambiente durante 20 - 30 min. Certifique-se de morte por ausência de batimentos cardíacos por examinar e sentir a área do peito, pela falta de resposta à estimulação mecânica, e / ou por decapitação. </li><li> Faça uma incisão em forma de U ao longo do abdómen. Retire a massa em tubo de corpos gordos amarelos. Na parte superior dos rins, testículos localizar as massas, que são cor de rosa pálido cerca de 1 cm de comprimento 29 de forma oval. Extirpar os testículos e juntá-las em papel absorvente para remover o sangue e outros tecidos. </li><li> Lavar testículos em tampão T. A utilização de um pilão apertado equipado para picar testículos com 1 ml de tampãoT em um tubo de 1,5 ml até ficar homogénea (10 golpes ou mais). Centrifugar 5 - 10 segundos num mini-centrifugador e recolher o sobrenadante, a remoção de grandes pedaços de tecido. Repetir a centrifugação mais uma vez e recolher o sobrenadante. </li><li> Transferir a solução contendo esperma a um tubo de plástico de 15 ml. Aumenta o volume a um total de 2 ml com tampão T. Centrifugar a 1.411 xg durante 10 min a 16 ° C para sedimentar o esperma. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 ul de tampão T. Centrifugar a 1.411 xg durante 10 min a 16 ° C. Repetir esta etapa uma vez ou duas vezes como necessário para limpar o pelete de glóbulos vermelhos e somáticas. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão T e 300 ul de tampão de S. incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Nota: Tampão S contém a lisolecitina, que é responsável pela demembranation. </li><li> Adicione três volumes de tampão R (preparada antes da utilização). Inverta tubo exatamente uma vez. Centrifugar a 1.411 xg durante 15 min a 16 &amp;# 176; C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 400 ul de tampão R e, em seguida, adicionar um adicional de 2 ml de tampão de R. Centrifugar a 1.411 xg durante 15 min a 16 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento em 50 ul de tampão T. </li><li> Diluir 1 mL demembranated núcleos de esperma com 9 ul de tampão T. Aplique esta diluição para um hemocitômetro. Contar o número de núcleos finas de esperma em forma de S em uma grande grade 4 x 4, e multiplicar esse número por 100 para obter a concentração das ações em núcleos de esperma por mL. </li><li> Diluir o estoque para 100.000 núcleos de esperma por ul com tampão de T, resultando em um estoque 200x. Preparar 3 - 5 mL alíquotas. congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. Montagem Nuclear <ol><li> Suplemento 100 ul de extracto de ovo com 1,5 mL de ciclo-heximida 35,5 mM (concentração final de ~ 0,5 mM), 6 ul de 20x solução de partida de cálcio (concentração final de ~ 0,6 mM), e 0,7 ul 200x esperma (concentração final ~ 700esperma núcleos / uL). Dimensionar o volume de reação cima ou para baixo, conforme necessário. Inverter ou bata suavemente para misturar. Nota: Extrato de um ciclo de metaphase em interfase fornece uma plataforma mais robusta e confiável para a montagem nuclear. </li><li> Incubar em um banho de água a 16-20 ° C durante 90 min. Misturar batendo suavemente a cada 15 min para assegurar núcleos permanecem suspensas no extracto. </li><li> Monitorar o progresso do conjunto nuclear a 45 min através da preparação de uma polpa como segue. <ol><li> Pipeta de 2 l de extracto numa lâmina de vidro e adicionar 2 ul correção núcleo. </li><li> Overlay com uma lamela de 22 mm2. Imagem em um microscópio de epifluorescência, utilizando água, óleo ou ar 20 - objetivos 100X e um filtro DAPI. Nota: Os núcleos podem ser visualizadas por imagiologia de campo brilhante, mas são muito mais fáceis de visualizar por fluorescência. </li><li> Use núcleos imediatamente ou alíquotas de flash congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. Nota: A adição de 4% de glicerol ao pr núcleosIOR ao congelamento pode ajudar a manter a sua integridade. núcleos congelados são geralmente ainda viável e capaz de importação nuclear, no entanto, o processo de congelamento pode conduzir a núcleos frágeis rompidas ou mais estruturalmente. Os núcleos até um ano após a congelação pode ser usado. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de X. laevis Extrato de embrião <ol><li> Induzir X. feminina laevis rãs põem ovos como descrito em 1.1 e 1.2. </li><li> Isolar testículos de X. masculino rãs laevis, conforme descrito em 2.2. Submerge testículos em meios L15 suplementado com 50 UI / ml de penicilina e estreptomicina, em um vidro de 35 x 10 mm numa caixa de Petri. Armazenar a 4 ° C por até duas semanas. </li><li> Recolha e fertilizar ovos. <ol><li> Recolher ovos frescos, mantendo rãs sobre um vidro reutilizável placa de Petri e promover a postura de ovos, aplicando pressão suave para a parte inferior das costas perto da cloaca. Espremendo o sapo demasiado duro pode resultar em lesões, levando a um abdômen inchado e requiring eutanásia 29. </li><li> Prop o prato a um ângulo de aproximadamente 45 °, para recolher ovos permitir na borda do prato, remover todo o excesso de tampão, e adicionar suficiente um / 3x MMR para cobrir apenas os ovos. Fertilizar os ovos dentro de 15 min após a colheita. </li><li> Usar um pilão firmemente ajustado para macerar e homogeneizar 1/4 de um testículo em um tubo de 1,5 mL com 500 uL de elevado teor de sal de modificação salina de Barth (elevado teor de sal MBS). Adicionar testículos maceradas para os ovos e para permitir que a fertilização ocorra à temperatura ambiente durante 15 - 20 min, depois inundar ovos com 1 / 3x MMR. Nota: Eficácia dos testículos diminui com o tempo de armazenamento, por conseguinte, mais tecido testículos pode ser necessário para a fertilização bem sucedida quando se utiliza testículos que foram armazenados durante mais de uma semana. </li><li> Confirmar fertilização através da verificação de contracção do polo animal pigmentada escura e pela rotação dos embriões com os seus pólos animais voltado para cima, geralmente cerca de 20 - 30 min após a adição de Teste esmagados. Espere a primeira clivagem celular para ocorrer dentro de 90 min. </li><li> Usando uma ampla pipeta furo de vidro diligentemente remover mortos (branco e inchado ou distribuição desigual de gema e pigmento), lise, ou ovos não fertilizados (ou seja, não clivada), como eles vão rapidamente induzir a morte em embriões vizinhos. </li><li> Em qualquer lugar 1-2,5 horas após a fertilização, dejelly embriões em 2-3% de cisteína dissolvido em 1/3 x MMR e ajustada a pH 7,9 com 10 N de KOH. Realizar duas mudanças de tampão que são cada 3-4 min. Lave bem os embriões com 6 - 10 breves mudanças de 1 / 3x MMR para remover todos os vestígios de cisteína. Nota: os embriões Dejellied têm uma membrana vitelina e não são tão frágil como ovos dejellied. </li></ol></li><li> Usando uma pipeta de largura furo de vidro, transferência (ou seja, clivado) Embriões fertilizados saudáveis ​​para uma placa de Petri contendo um fresco / 3x MMR e permitir-lhes a desenvolver para a fase desejada, à TA ou, se é preferido o desenvolvimento mais lento, 16 ° C. Continuar para remover morto ou lyembriões sed indicado por falta de primeira divisão ou a aparência inchada branco. </li><li> Verificar o estágio dos embriões através da verificação de fechamento quase total do blastopore e por comparação com desenhos de embriões em estágios disponíveis em materiais de referência 24. Nota: Os embriões cultivados a 16 ° C irá atingir o estágio 11,5-12 em aproximadamente 12 horas. </li><li> Incubar etapa 11.5 - 12 embriões em fresco 1 / 3x MMR suplementado com ciclo-heximida 0,5 mM durante 1 hora à TA, a prender os embriões no final de interfase. </li><li> Transferir com vidro grande furo ou pipeta de plástico de um mínimo de 15 (de preferência 30 ou mais) embriões prendeu-interfase para um tubo de microcentrífuga. Nota: 15 embriões são suficientes para produzir cerca de 20 ul de extracto. Intensificar conforme necessário. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de lise de ovo (ELB) suplementado com 1 ml de estoque LPC. Inverter cuidadosamente para lavar os embriões, os embriões permitir a cair para o fundo do tubo, e remover o tampão. Repita este passo de lavagem mais duas vezes. &lt;/ Li&gt; <li> embriões ressuspender em 500 mL de ELB mais 0,5 ul de estoque LPC, 5 ul de cicloheximida 19,7 mM e 5 ul de 35,5 mM citocalasina D (para inibir a polimerização de actina). Centrifugar a 200 xg durante 1 min numa microcentrífuga de mesa. </li><li> Remover o excesso de tampão e usar um pilão para esmagar completamente os embriões. Centrifugar num rotor de balde oscilante durante 10 min a 10000 xg e 16 ° C. </li><li> Perfurar a camada de lido a partir do topo com uma ponta de pipeta de 200 uL. Com uma ponta de pipeta de 200 mL limpo, remover a camada de cor âmbar citoplasmática meio a um tubo de tamanho apropriado. </li><li> extracto de embrião suplemento com 1/50 do volume de mistura de energia 50x (para fornecer um sistema de regeneração de ATP), 1/100 do volume de 35,5 mM de ciclo-hexamida, 1/500 do volume de 19,7 mM de citocalasina D, e 1 / 1.000 o volume de estoque LPC. </li><li> Prepara-se uma polpa como descrito no ponto 3.3 para visualizar núcleos embrionárias endógenos presentes no extracto. Nota: extrato de embriões podem ser congelados com<html> os núcleos endógenos neste momento. Alíquota para reduzir a ciclos de congelamento / descongelamento e armazenar a -80 ° C. </li><li> Para remover os núcleos a partir do extracto de embrião, dilui-se o extracto com um volume igual de ELB contendo 1/50 do volume de mistura de 50x de energia, o volume de 1/100 de 35,5 mM de ciclo-hexamida, 1/500 do volume de 19,7 mM de citocalasina D, e 1 / 1.000 do volume de estoque LPC. Centrifugar num rotor de balde oscilante a 17000 xg durante 15 min a 16 ° C. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante com cuidado para evitar qualquer lípido que permanece no topo. Não perturbe os núcleos sedimentados no fundo do tubo. Prepara-se uma polpa como descrito no ponto 3.3 para assegurar que a maioria dos núcleos foram removidos. Use o extrato fresco ou alíquota e armazenar a -80 ° C. </li><li> Para inactivar pelo calor extracto de embrião para experiências de controlo, de calor 30 - 100 mL alíquotas de extracto a 56 ° C durante 30 min, utilizando um termociclador. Permitir que o calor extracto inactivado regressar até à temperatura ambiente antes de usar. </li></ol>_title &quot;&gt; 5. Nuclear Shrinking Ensaio e Imunofluorescência <ol><li> Isolar núcleos montados no extracto de ovo por diluição de 25 - 150 ul de núcleos pré-montados em 1 ml ELB em um tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 1.600 xg durante 3 min a 4 ° C numa mesa de microcentrífuga. Remover o tampão, com cuidado para não perturbar o sedimento de núcleos frágil na parte inferior do tubo. </li><li> Ressuspender núcleos num volume de extracto de embrião igual ao volume original de extracto de ovo utilizado em 5.1. Uso ELB ou extracto inactivado por calor por reacções de controlo, conforme apropriado. </li><li> Bata levemente o tubo para quebrar o pellet e ressuspender os núcleos. Incubar à temperatura ambiente durante 90 minutos, suavemente batendo no tubo para misturar todos os 15 - 30 min. Nota: Na maior parte do encolhimento nuclear ocorre nos primeiros 30 min. </li><li> Monitorar o progresso de encolhimento nuclear, preparando um squash. <ol><li> Pipeta de 2 l de extracto numa lâmina de vidro e adicionar 2 ul correção núcleo. </li><li> Sobreposição com um 22 mm2 </sup&gt; lamela. Imagem num microscópio de epifluorescência. </li></ol></li><li> Toque no tubo para ressuspender os núcleos imediatamente antes da adição de 500 ul de fixador consiste em ELB, 15% de glicerol e 2,6% de paraformaldeído. Inverta imediatamente, e colocar o tubo num agitador rotativo durante 15 min à temperatura ambiente. </li><li> Prepare girar tubos equipando 15 ml tubos de vidro de fundo redondo com inserções de plástico de fundo redondo (desenho e esquemas disponíveis mediante solicitação). Adicionar 5 ml de tampão de almofada nuclear. Deixe cair uma lamela circular 12 mm no tubo, sendo certo que está na horizontal na parte superior da inserção de plástico. </li><li> Com cuidado, a camada de solução contendo núcleos fixos na parte superior da almofada nuclear utilizando uma ponta de pipeta de grande calibre. Centrifugar num rotor de balde oscilante durante 15 min a 1000 xg e 16 ° C. </li><li> Use de um aspirador para remover todo o tampão de puxar e a inserção de plástico para o topo do tubo. Remover a lamela com um par de fórceps finos, tendo o cuidado de observar o lado da tampaescorregar para o qual os núcleos foram centrifugadas. Pós-correcção em metanol frio (armazenada a -20 ° C) durante 5 min à TA. </li><li> Transferir lado do núcleo lamela em cima de uma folha de filme de parafina de plástico que reveste uma grande placa de petri de plástico. Coloque toalhetes descartáveis ​​molhado ao longo do lado do recipiente para evitar a desidratação. </li><li> Rehidratar núcleos sobre a lamela com 500 ul de PBS-NP40 (1x PBS mais 0,1% de NP40) e aspirado após 5 - 10 seg. </li><li> Cuidadosamente camada 75 ul de PBS-3% de Albumina de Soro Bovino (BSA) para a lamela. Deixa-se bloquear uma hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover solução de bloqueio, e incuba-se com anticorpo primário (por exemplo, mAb414 contra o complexo do poro nuclear, 1: 1000) diluída em PBS-BSA a 3% durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Lavar com cinco mudanças imediatas de PBS-NP40. </li><li> Incubar com anticorpo secundário diluído em PBS-BSA a 3% durante 1 h à TA. Lavar com cinco mudanças imediatas de PBS-NP40. </li><li> Incubarcom 10 ug / ml de Hoechst diluída em PBS-BSA a 3% durante 5 min à TA. Lavar cinco vezes com PBS-NP40. Remova todo o excesso de buffer. </li><li> Monte a lamela numa lâmina com meio de montagem 5 jul antifade. Selo com unhas polonês claro. Imagem imediatamente usando um microscópio de epifluorescência, com 20 - 100x objetivos ou armazenar a 4 ° C para imagens mais tarde. Nota: Execute quantificação como descrito anteriormente 23. </li></ol>

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Control of the onset of transcription.</a> Cell. 30 (3), 687-696 (1982).</li><li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos:+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage.">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30 (3), 675-686 (1982).</li><li>Maresca, T. 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E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISWI+remodeling+complexes+in+Xenopus+egg+extracts:+identification+as+major+chromosomal+components+that+are+regulated+by+INCENP-aurora+B.">ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).</li><li>Goehring, N. W., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+growth+control+through+limiting+pools+of+cytoplasmic+components.">Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components.</a> Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).</li><li>Du Toit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development:+Honey,+I+shrunk+the+nucleus.">Development: Honey, I shrunk the nucleus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).</li><li>Buchner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+kinase+C+in+the+regulation+of+cell+growth+and+in+signalling+to+the+cell+nucleus.">The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).</li><li>Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C,+an+elusive+therapeutic+target.">Protein kinase C, an elusive therapeutic target.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink...

Os tamanhos de organelos celulares tipicamente dimensionado de acordo com o tamanho da célula, e esta tem sido talvez mais bem documentadas para o dimensionamento do tamanho dos núcleos com tamanho de célula de 1-10. Isto é particularmente verdadeiro durante a embriogénese e diferenciação celular, quando reduções dramáticas em ambos celular e tamanho nuclear são frequentemente observados 11,12. Além disso, o tamanho nuclear alterado é um parâmetro chave no diagnóstico e prognóstico do cancro 13-17. Mecanismos que contribuem para a regulamentação tamanho nuclear são pouco conhecidos, em parte devido à complexidade e à natureza essencial da estrutura e função nuclear. O método aqui descrito foi desenvolvido como um ensaio in vitro para o tamanho nuclear de escala que é propício à manipulação bioquímica e a elucidação dos mecanismos de regulação tamanho nuclear. Xenopus laevis extrato de ovo é um sistema bem estabelecido de recapitular e estudar processos celulares complexos em um in vitro </em&gt; Contexto. Esses extratos revelaram novas informações fundamentais sobre vários processos celulares, incluindo a montagem e função do fuso mitótico, retículo endoplasmático, e no núcleo 18-22. Uma vantagem chave do sistema extracto é que X. laevis extratos de ovos representam um citoplasma quase não diluído cuja composição pode ser facilmente alterado, por exemplo, através da adição de proteínas recombinantes ou imunodepleção. Além disso, é capaz de manipular processos essenciais através do emprego de tratamentos que poderiam ser letal num contexto in vivo. Modificações do procedimento de extracto de ovo permitir o isolamento de extratos de X. laevis embriões em vez de ovos, e estes extractos de embriões são igualmente passíveis de manipulação bioquímica 23. Durante X. laevis desenvolvimento, o embrião fertilizado de uma única célula (~ 1 mm de diâmetro) é submetido a uma série de doze divisões celulares rápidas (etapas 1-8) para gerar vários milhares de 50 μm de diâmetro e células menores, chegando a um estágio de desenvolvimento denominado transição midblastula (MBT) ou estágio agosto 24-26. O MBT é caracterizado pelo início da transcrição zigótica, migração celular, divisão celular assíncronos, aquisição de fases de hiato, e estabelecimento de tamanhos de estado estacionário nucleares em vez de expansão nuclear contínuo como no embrião pré-MBT. De estágio 4 a gastrulação (estádios 10,5-12), o volume de núcleos individuais, diminui em mais de 10 vezes 11. Aqui, o objetivo é identificar os mecanismos responsáveis ​​por estas reduções no tamanho nuclear durante a progressão do desenvolvimento. A abordagem é a primeira a montar núcleos em X. laevis extrato de ovo e isolar os núcleos do citoplasma do ovo / extract. Estes núcleos são então ressuspensas em citoplasma de embriões de fase de gástrula tardia. Após um período de incubação, os núcleos de extracto de ovo tornam-se menores no final de extrato fase de embrião. Nós fundamentado que este woulseria um ensaio útil para a identificação de componentes citoplasmáticos presentes em embriões em estágio final que contribuem para o desenvolvimento de escala de tamanho nuclear. Utilizando este ensaio, juntamente com a validação in vivo, demonstrou que a proteína quinase C (PKC) contribui para a redução do desenvolvimento em tamanho nuclear em X. laevis 23.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG</td><td>Molecular Probes</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ATP disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Beckman</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>chymostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>creatine phosphate disodium</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>cytochalasin D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>disposable wipes (kimwipes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glass crystallizing dish (150 x 75 mm)</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Macron</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - Human Chorionic Gonadotropin&amp;nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Lysolecithin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin + Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>pepstatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Plastic paraffin film (parafilm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin</td><td>Prospec</td><td>hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom glass tubes, 15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge rotor</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (anti-fade mounting medium)</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

a cell-free assay using xenopus laevis embryo extracts to study mechanisms of nuclear size regulation

Uma questão fundamental em biologia celular é como tamanhos de células e organelas são regulados. Tem sido desde há muito reconhecido que o tamanho do núcleo geralmente escalas com o tamanho da célula, nomeadamente durante a embriogénese, quando ocorrer uma redução dramática tanto na célula e tamanhos nucleares. Mecanismos de regulação tamanho nuclear são em grande parte desconhecido e pode ser relevante para o cancro onde o tamanho nuclear alterada é um parâmetro de diagnóstico e prognóstico chave. In vivo abordagens para identificar reguladores tamanho nuclear são complicados pela natureza essencial e complexo da função nuclear. A abordagem in vitro descrito aqui para estudar o controlo tamanho nuclear aproveita as reduções de tamanho normal nucleares que ocorrem durante o desenvolvimento de Xenopus laevis. Em primeiro lugar, os núcleos são montados em X. laevis extracto de ovo. Em seguida, esses núcleos são isoladas e novamente suspensas em citoplasma de embriões de fase tardia. Depois de um período de 30 - 90 min de incubação, a área de superfície nucleardiminui em 20 - 60%, proporcionando um ensaio útil para identificar componentes citoplasmáticos presentes em embriões de fase tardia que contribuem para o desenvolvimento de escalonamento tamanho nuclear. Uma das principais vantagens desta abordagem é a relativa facilidade com que os extractos de ovos, bem como de embriões pode ser manipulado bioquimicamente, permitindo a identificação de novas proteínas e actividades que regulam o tamanho nuclear. Tal como acontece com qualquer uma abordagem in vitro, a validação dos resultados de um sistema in vivo é importante, e micro-injecção de X. embriões laevis é particularmente apropriado para estes estudos.

Montagem de núcleos em extracto de ovo Os primeiros passos deste protocolo estão a preparar X. extrato laevis ovo (Protocolo 1) e núcleos de esperma demembranated (protocolo 2). Estes reagentes são então usadas para montar os núcleos de novo (Protocolo 3). A Figura 1 mostra alguns dados representativos. Adição de cálcio conduz o extracto de ovo meioticamente...

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A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Um ensaio-Free Cell Usando<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Extrai para estudar mecanismos de regulação Tamanho Nuclear

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

8.3K visualizações.  University of Wyoming. Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Bioquímica

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Biologia

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

Produção de<em&gt; Xenopus tropicalis</em&gt; Egg Extrai identificar RNAs associada aos microtúbulos

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrato de ovo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Um ensaio-Free Cell Usando

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Manipulação e

Utilizando Análise de confocal

Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula Xenopus

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

In Vitro Assembléia Nuclear Usando Extractos Egg fracionado Xenopus

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Produção de

Reconstituição de β-catenina degradação na

A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose