Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) (Zuschuss MOP-119503) und der Naturwissenschaften und Engineering Council of Canada (NSERC) gefördert. NSERC unterstützt Sommer studentships auch YD und AA YD wird von der University of British Columbia (UBC) mit einem 4-Jahres-Stipendium Auszeichnung unterstützt, AA durch CIHR mit ein Student Master-Auszeichnung (CGS-M) unterstützt. Wir danken Calvin Roskelley für die Unterstützung mit dem Mikroskop die Bilder in Abbildung 2 zu erzeugen , verwendet. Wir erkennen auch die Unterstützung der UBC Tier- und Durchflusszytometrie Einrichtungen.

Die Mäuse wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitlinien für ethische Tierforschung von Verfahren, die von der University of British Columbia Animal Care Committee genehmigt eingeschläfert. 1. Der Erwerb einer einzelnen Zelle Knochenmark-Suspension von Maus Femur und Tibia <ol><li> Schalten Sie einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) 15 Minuten vor dem Beginn des Verfahrens Schrank Luft zu reinigen und ermöglichen eine Luftströmung Stabilisierung, dann reinigen / Spray BSC Oberfläche mit 70% Ethanol. Halten alles so steril wie möglich für die Gesamtheit des Protokolls. Schneiden Sie nicht die Knochen unter nicht sterilen Bedingungen. </li><li> Vorbereitung Dissektionswerkzeuge von in 70% Ethanol (1 Paar Dissektion Schere, 2 Paar Pinzetten) Einweichen Hanks Balanced Salt Solution mit 5% fötalem Kälberserum (HBSS-FCS), sterile Petrischalen (100 mm x 15 mm), 1 ml Spritzen, 26 ½ Gauge-Nadeln, konischen Sammelröhrchen (15 ml oder 50 ml) und Papiertücher in der BSC. </li><li> Euthanize mit der MausProtokolle, die von der Institution Tierforschung Ethikkommission genehmigt. Bringen Sie in die BSC, legen oben auf ein oder zwei Papiertücher und die Maus mit 70% Ethanol besprühen. </li><li> In der BSC, öffnen Sie eine sterile aseptisch Petrischale, aliquote 10 ml HBSS-FCS mit der Basis und 1 bis 2 ml auf den Deckel. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch mit dem Rücken nach oben und heben Sie die Haut um die Brust-Abschnitte mit den Fingern der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die Schere, um einen Einschnitt zu machen, wo die Haut angehoben wird. </li><li> Halten Sie sich an den beiden Enden des Schnittes, wobei ein Ende mit jeder Hand und vorsichtig auseinander ziehen die Haut um die Maus von der Rückseite in den Magen, fortzusetzen, bis zwei Enden des Einschnitts treffen, der an den Magen. </li><li> Drehen Sie die Maus auf Bauch nach oben und mit einer Hand ziehen Sie die untere Hälfte der Haut nach unten in Richtung Bein, halten die Haut zurückziehen, bis die Beine ausgesetzt sind. </li><li> Halten Sie den Fuß der Maus nach oben und schneiden Sie die Achillessehnen über dem Sprunggelenk unddie Bänder die Muskeln Verbindungs ​​am unteren Ende der Tibia mit einer Schere zu Fuss. Dies lockert den Fuß von den Beinknochen. </li><li> Während das Bein nach oben durch den Fuß, schneiden Sie die Muskeln und Bänder mit einer Schere alle um das Kniegelenk am unteren Ende des Oberschenkels die Oberschenkelmuskulatur aus dem unteren Bein zu trennen. Verwenden einer Pinzette vorsichtig gelockert Muskeln ziehen weg von der Fibula und Oberschenkel Oberflächen. Achten Sie darauf, nicht die Femoralarterie zu durchtrennen, schwere Blutungen zu vermeiden. </li><li> Mit der einen Hand auf den Fuß nach unten drücken offene Schere am oberen Ende des Oberschenkels im Hüftgelenk, drehen Sie das Bein und ziehen Sie vorsichtig den Oberschenkelknochen aus dem Hüftgelenk zu trennen, während die Schere mit dem letzten Schnitt zu frei zu machen das Bein aus dem Körper. </li><li> Von diesem Punkt an, halten nur das Gewebe mit einer sterilen Pinzette. Halten Sie an das Bein an einem Ende an und ziehen Sie den Fuß auf den anderen ab. HINWEIS: Dies sollte nicht viel Kraft erfordern, als Verbindungsbänder in Schritt geschnitten werden1.9. Alternativ dazu schneiden die Tibia knapp über dem Knöchel, wo der Knochen fusioniert ist. </li><li> Halten Sie das Bein durch das distale Ende des Femurs mit einem Satz Zangen und proximalen Ende der Tibia und Fibula mit einem anderen, biegen sorgfältig die Tibia und Fibula in die entgegengesetzte Richtung des Kniegelenks sie von Femur und Patella zu trennen. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die verbleibenden Bänder und Muskeln nach unten ziehen, noch an den Unterschenkelknochen befestigt. Hier, nehmen Sie die Fibel zusammen mit dem Bindegewebe mit einer Pinzette, da es zu klein ist, gespült werden für Knochenmarkzellen. Setzen Sie die gereinigte Tibia auf der invertierten Petrischale Deckel. </li><li> Halten Sie das untere Ende des Oberschenkels mit einem Satz von Zangen und der Patella mit einem anderen, biegen Sie die Patella und das umgebende Gewebe in die entgegengesetzte Richtung des Gelenks zur Entfernung. reinigen Dann Bindegewebe aus dem Oberschenkelknochen verbleibt; Ziehen sie mit einer Pinzette entfernt, und legen Sie es auf dem umgekehrten Schalendeckel Petri. Entsorgen Sie die Patella. </li><li> Wiederholen 1.7- 1.13 mit dem anderen Bein, wenn nötig. Übertragen Sie die Knochen auf 1,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem HBSS-FCS für den Transport, falls erforderlich. </li><li> Platzieren Knochen auf das invertierte Petrischale Deckel mit 1 bis 2 ml HBSS-FCS, verwenden Zange restliche Gewebe zu reinigen noch an der Tibia und Femur befestigt, dann übertragen die Knochen an der Basis der Petrischale mit 10 ml HBSS- FCS. Alternativ dazu können die Knochen reinigen und an Muskelgewebe entfernen, um eine 70% Ethanol getränkten Gewebe verwendet wird. </li><li> Schneiden Sie jede der Knochen in der Mitte mit einer Schere. Schild teilweise die Petrischale mit einem sterilen Deckel während des Schneidens die Knochen bleiben in der Schale zu gewährleisten. Alternativ schneiden das Ende jedes Knochenspülung in dem nächsten Schritt zu ermöglichen. </li><li> Bringen Sie die 26 ½ G-Nadel auf die 1-ml-Spritze und ziehen bis 1 ml HBSS-FCS aus der Petrischale. Legen Sie die Spitze der Nadel in das Ende eines Knochenstück und spülen Sie die Knochenmarkzellen (weichen roten Gewebe im Inneren der Knochensubstanz) aus. Führen Sie die Nadel in den Kopfdes Knochens und das offene Ende, bis das gesamte rot gefärbt ist Mark entfernt. Beachten Sie die Knochen, wie in der Farbe weiß. </li><li> Passieren sichtbare Klumpen von Knochenmark durch die Spritze mehrmals eine Einzelzellsuspension zu bilden. </li><li> Entsorgen Sie die gespülten Knochen. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette die Zellsuspension gut und Transfer zum Sammelröhrchen zu mischen. Spülen Sie die Petrischale einmal mit 5 ml HBSS-FCS Restzellen in der Schale zu sammeln. Legen Sie Zellen auf Eis. HINWEIS: Die Zellsuspension Knochenmark ist noch lebensfähig , wenn für 2 gespeichert - bei 4 ° C 3 Std. </li></ol> 2. Überzug und Kultivierung von Knochenmarkzellen (BMC) <ol><li> Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. <ol><li> Vorbereitung von roten Blutzellen (RBC) Lysepuffer, indem 0,84% Ammoniumchlorid in einer endgültigen Lösung von 2 mM Tris pH 7,2, sterilisieren dann durch Filtrieren durch einen 0,2-Mikron-Filter. </li><li> Bereiten BMC Medien durch Zugabe von 10% FCS, 20 mM HEPES, 1x nicht-essentielle Aminosäure, 55 &amp; #181; M 2-Mercaptoethanol, 50 U / ml Penicillin und Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, und 2 mM L-Glutamin RPMI Medium 1640. </li><li> Erhalten kommerziell erhältlichen rekombinanten GM-CSF oder verwenden GM-CSF - Überstand aus AG8.653 Myelomzellen enthält , transfiziert mit dem GM-CSF - Gen 20. Bestimmen Sie die Konzentration von GM-CSF in dem Überstand durch ELISA und fügen Sie das Äquivalent von 20 ng / ml auf den BMC-Medien. </li></ol></li><li> Spin down die Knochenmarkszellen bei 314 × g für 5 min. Das Pellet ist rot, aufgrund RBCs. In der BSC, den Überstand aspirieren einer sterilen Pasteur-Glaspipette angebracht Saugen Vakuum, lösen Sie das Pellet durch Klopfen, dann wurden 10 ml Puffer RBC Lyse hinzufügen. Vortex um die Zellen zu resuspendieren und in RBC-Lyse-Puffer bei Raumtemperatur für 5 min inkubiert. </li><li> 10 ml HBSS-FCS dann Zellen Spin bei 314 × g für 5 min und den Überstand aspirieren. Beachten Sie die Zellpellet als weiße Farbe. Die Zellen in gewünschte Volumen von BMC Medien. </li><li> Zählen Sie die resuspended-Zellen, die eine Zählkammer nach toten Zellen mit 0,4% Trypan-Blau-Färbung. HINWEIS: Wenn Knochenmark von einem Bein (Einzel Tibia und Femur) verwendet wird, Resuspendieren in 5 ml BMC Medien, nehmen 10 ul Zellsuspension und verdünnen Sie es mit 70 &amp; mgr; l von 0,4% Trypanblau, gut mischen und Transfer 10 ul die 1/8 Zelle Verdünnung auf die Hemocytometer Kammer. Zählen der lebensfähigen Zellen in vier Quadranten: der Mittelwert der vier Quadranten Zählwerte x Verdünnungsfaktor x 10 4 = Anzahl der Zellen pro ml. 4 x 10 7 Zellen nach dem RBC - Lyse - einem Femur und einer Tibia von einem Bein wird etwa 2 allgemein ergeben. </li><li> Schätzung der Anzahl von 10 ml Speisen von Knochenmarkkulturen für nachgelagerte Experimente benötigt basierend auf der Anzahl der insgesamt für die Versuche benötigten Zellen am Ende der Kultur. HINWEIS: Jedes Gericht benötigt 2 x 10 6 Knochenmarkzellen bei der ersten Aussaat und Ausbeuten von 5 bis 10 x 10 6 Zellen am Tag 7. <ol><li> Aliquot die Gesamtzahl der Zellen zur Plattierung in ein neues Röhrchen, zentrifugieren bei 314 xg für 5 min, Überstand absaugen und resuspendieren Zellen bei 4 x 10 6 Zellen / ml in BMC Medien. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine neue sterile 100 mm x 15 mm Petrischale mit 9,5 ml BMC-Medium, das 200 ng GM-CSF (rekombinantes oder von GM-CSF enthaltende Überstand). Hinzufügen 500 ul der 4 x 10 6 Zellen / ml Knochenmarkszellen in die Mitte der Petrischale für die Endkonzentration von 2 x 10 5 Zellen / ml in 10 ml. HINWEIS: Es ist wichtig , eine sterile Petrischale nicht eine Gewebekulturschale zu verwenden. Auch wenn die Zellen die Zugabe sorgen Zellen in der Mitte konzentriert bleiben und minimieren Störung der Speisen nach dem Aussäen und während der Medienwechsel. Inkubiere Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. Dies ist Tag 0 in der Kultur. </li><li> Am Tag 3, 10 ml frischem BMC Medien zu jeder Schale von Zellen, die 200 ng GM-CSF hinzuzufügen. Achten Sie darauf, Störung o zu minimierenf die in Suspension konzentriert Zellen. Das Gesamtvolumen der Zellkultur ist jetzt 20 ml. </li><li> Beobachten Zellen unter dem Lichtmikroskop bei 100-facher Vergrößerung. Beachten Sie zahlreiche nicht-haftenden Zellen (rund) und ein paar anhaftenden Zellen (flach). Zellen in Gruppen von drei oder vier ähnlich Blütenblätter einer Blume zu sehen ist, die Proliferation anzeigt. </li><li> Am 6. Tag eine halbe Medienwechsel durchführen. Entfernen Sie vorsichtig 10 ml Medium in einem sterilen 50 ml konischen Röhrchen, Spin bei 314 · g nach unten für 5 min, absaugen und den Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 10 ml frischem BMC Medien 20 ng / ml GM-CSF enthält, sanft Wirbel und zu der ursprünglichen Zellkulturschale mit einem Gesamtvolumen von 20 ml. Beachten Zellen unter dem Mikroskop. HINWEIS: Tag 7 Kultur sollte mit anhaftender flachen Zellen und dichte Wolken von runden nicht adhärenten Zellen bei 70% oder mehr in Konfluenz sein. </li></ol> 3. Sammeln und Vorbereiten BMDC und BMDMs für die Durchflusszytometrie <ol> &lt;li&gt; Halten Sie alle Puffer bei 4 ° C. </li><li> Ernten Sie die Zellen von Tag 7 bis Tag 10. Um die Zellen zu ernten erste Transfer 10 ml des Kulturüberstand zu einem 50 ml konischen Sammelröhrchen, dann kippen die Schale vertikal um ca. 30 Grad und waschen Sie die Schale pipettiert, die restlichen 10 ml der Kultur von der Spitze der Schale. Wiederholen Sie diese Wäsche 5 Mal, jedes Mal Drehen der Schale um ein Drittel. </li><li> Übertragen Sie die restlichen 10 ml der Zellen auf die gleiche Sammelröhrchen und entsorgen Sie die Platte und anhaftenden Zellen. HINWEIS: Die Waschungen werden entfernen nicht haftenden und lose anhaftenden Zellen; die flachen adhärente Zellen sind resistent gegen den Wäschen. Typischerweise von 5 - 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen werden von einer Platte am Tag erwartet 7 und 2 bis 5 x 10 6 Zellen am Tag 10, obwohl Lutz et al. berichtet 10 x 10 6 Zellen am Tag 10. Die anhaftenden Zellen werden nicht aufgenommen. müssen jedoch, wenn diese Zellen auf die nicht-adhärenten Zellen im Vergleich zuKönnen sie wie folgt entfernt werden. 5 ml 0,7 mM EDTA in 1x PBS, pH 7,4 auf die Schale, nachdem die nicht-anhaftenden Zellen entfernt, bei 37 ° C für 5 min, einer Pipette auf und ab um die adhärenten Zellen zu entfernen, und in einem separaten Röhrchen sammeln. </li><li> Spin down die gesammelten Zellen bei 314 xg für 5 min und den Überstand aspirieren. Resuspendieren in 5 ml sterile BMC Medien bei 4 ° C, Wirbel sanft zu mischen, und zählen Trypanblau und Zählkammer. HINWEIS: Jedes Gericht wird 5 ergeben - 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen von einem Tag 7 Kultur. Von nun alle Schritte bei 4 ° C durchzuführen. </li><li> Für Durchflußzytometrie - Analyse, Übertragung 2 x 10 5 Zellen für jede Probe in 5 ml Polystyrol - Rundbodenröhrchen, fügen 300 ul FACS - Puffer bei 4 ° C (1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 2 mM EDTA und 2% Rinderserumalbumin) zu jedem Sample. </li><li> Spin-Zellen bei 314 xg für 5 min nach unten und den Überstand aspirieren. Beobachten Sie eine sichtbare weiße, undurchsichtige Pellet bei derBoden des Röhrchens. </li><li> Die Zellen in 100 ul unmarkierten Fc-Rezeptor zu blockieren Ab Fc-Rezeptor-Bindung (Verwendung 1/10 Überstand von 2.4G2 produzierenden Myelom-Zelllinie) und bei 4 ° C für 20 min inkubiert. Dann fügen Sie 300 ul FACS-Puffer zu jeder Probe, sanft Wirbel, dann Zellen des Abschaltens bei 314 × g für 5 min und der Überstand absaugen. </li><li> Die Zellen in 100 &amp; mgr; l CD11c-PeCy7 bei 0,2 &amp; mgr; g / ml, Gr1-Pacific Blue bei 0,25 &amp; mgr; g / ml, MHCII-APC bei 0,05 &amp; mgr; g / ml, und FL-HA bei etwa 2 ug / ml Makrophagen und DCs zu identifizieren. HINWEIS: FL-HA wurde im Haus unter Verwendung von Fluorescein und Hahnenkamm Hyaluronsäure - Natriumsalz hergestellt , wie zuvor beschrieben 21. </li><li> Inkubieren für 20 min bei 4 ° C Bindung an die Zelloberfläche zu ermöglichen. In 300 ul FACS - Puffer zu jeder Probe, sanft Wirbel, dann Zellen des Abschaltens bei 314 × g für 5 Minuten bei 4 ° C und den Überstand aspirieren . HINWEIS: Wenn Biotinylated Antikörper in 3.8 verwendet werden, wiederholen 3,8-9 mit fluoreszenz Streptavidin. </li><li> Wash-Zellen mit einem anderen 300 ul FACS-Puffer, sanft Wirbel zu mischen und drehen Sie die Zellen bei 314 xg für 5 min nach unten. Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Zellen in 200 &amp; mgr; l FACS-Puffer, enthaltend von 0,1 bis 0,2 ug pro ml Propidiumiodid oder DAPI nonviable Zellen zu markieren. Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometrie - Analyse 22. HINWEIS: Siehe Ergebnisse und Abbildung 3 für weitere Details der Populationen und wie wurden die Zellen gated. </li></ol>

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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Mucosal+Dendritic+Cells+from+Bone+Marrow+Reveals+a+Critical+Role+of+Retinoic+Acid.">Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid.</a> J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).</li><li>Grauer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+maturation+states+of+rat+bone+marrow-derived+dendritic+cells+using+an+improved+culture+technique.">Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique.</a> Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy.">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li><li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), (2014).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

In diesem Manuskript, stellen wir ein Verfahren zur Erzeugung von GM-CSF Makrophagen und DCs aus einem einzigen Maus - Knochenmarkkultur , die von Lutz angepasst ist , et al. 6. MHCII Expression und FL-HA unterscheidet zwischen unreifen DCs und Makrophagen in dieser Kultur - Bindung (siehe 3C), die bisher schwierig war. Dies, zusammen mit einem anderen Bericht von Helft et al. 19 zeigt die Heterogenität innerhalb GM-CSF induzierten BMDC Kulturen , die bisher ange...

Mehrere in vitro Kulturverfahren beschrieben wurden Knochenmark stammenden Makrophagen (BMDMs) und Knochenmark stammenden DCs (BMDCs) unter Verwendung eines oder einer Kombination von Wachstumsfaktoren zu erzeugen. BMDMs kann durch Züchten Knochenmarkszellen erzeugt werden unter Verwendung von entweder Makrophagen - Kolonie - stimulierender Faktor (M-CSF) oder GM-CSF 1,2. Für BMDCs gibt die Zugabe von FLT3 - Ligand an der Knochenmarkkultur zu nicht-haft klassischen und plasmazytoiden DCs (CD11c hoch / MHCII hoch und CD11c lo, B220 + beziehungsweise) nach 9 Tagen in Kultur 3,4. Im Gegensatz dazu nicht adhärenten nach 7 bis 10 Tagen in Kultur erzeugt Zellen mit GM-CSF allein 5,6, GM-CSF und IL-4 7 oder GM-CSF und FLT3 - Ligand 8,9 erzeugen BMDCs mehr ähnelt entzündliche DCs (CD11c hoch, MHCII hohe CD11b +) 10. Obwohl diese in vitro Kulturen werden verwendet , Makrophagen zu erzeugen oderDCs, es ist unklar, ob jede Kultur Anlass zu reinen Populationen gibt. Obwohl beispielsweise adhärente Zellen in den GM-CSF - Kulturen beschrieben Makrophagen 5, die nicht-adhärenten Zellen aus der gleichen Kultur zu sein als DCs 6,11-13, mit der Annahme verwendet , dass sie homogen und jede beobachtete Variabilität sind, aufgrund unterschiedlicher Entwicklungsstadien 14,15. Darüber hinaus haben Studien GM-CSF in vivo gefunden 16,17, ein wesentlicher Wachstumsfaktor für Alveolarmakrophagen Entwicklung zu sein und kann in vitro verwendet werden alveolären Makrophagen-ähnliche 16,17,18 zu erzeugen. Anders als die Einhaltung sind die Verfahren für Makrophagen und DCs von GM-CSF behandelt Knochenmarkkulturen zu erzeugen sehr ähnliche Heterogenität was darauf hindeutet, innerhalb GM-CSF Knochenmarkkulturen existieren können. Dies scheint auch der Fall zu sein, da zwei Papiere des Vorhandenseins von BMDMs in der nicht-haftenden Fraktion von BMDC Kulturen berichten. In einem Papier, sie identified eine Population von Zellen CD11c +, CD11b +, MHCII mid, MerTK + und CD115 +, der eine Genexpression Signatur ausgedrückt, die am ehesten Alveolarmakrophagen und hatte eine reduzierte Fähigkeit glich zu aktivieren 19 T - Zellen. Das zweite Papier verwendet MHCII und FL-HA eine Alveolarmakrophage artigen Population (CD11c +, MHCII mid / niedrig, FL-HA hoch) zu identifizieren , die von unreifen (CD11c +, MHCII Mitte, FL-HA niedrig) und reifen unterschied DCs (CD11c +, MHCII hoch), die beide phänotypisch und funktionell 18. Diese Papiere zeigen beide, dass GM-CSF BMDC Kulturen heterogen sind, sowohl Makrophagen und DC-Populationen enthalten, die Versorgung angibt, sollten getroffen werden, wenn Daten aus BMDC Kulturen zu interpretieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie Knochenmark, Kultur Knochenmarkzellen in-GM-CSF zu isolieren und zu identifizieren, die Alveolarmakrophage artigenBindung und MHCII Ausdruck Bevölkerung aus den unreifen und reifen DCs im Knochenmarkkultur mittels Durchflusszytometrie FL-HA verwenden. Dieses Verfahren wird auf dem etablierten Verfahren von Lutz et al basierend 6 und 5 in der Lage , zu erzeugen -. 10 x 10 6 nicht-adhärenten Zellen am Tag 7 einer 10 ml Kultur. Die Kultur ist verwendbar von den Tagen 7 bis 10 und ergibt eine heterogene Population von Makrophagen, unreifen und reifen DCs, sowie einige Progenitoren am Tag 7. Dies stellt eine einfache Methode zu wachsen und in vitro alveolären Makrophagen-ähnliche in großen Mengen zu isolieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>LSR-II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DMI4000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ST-40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-425-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 1/2 Gauge Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357070</td>
			<td>*Falcon brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml polystyrene round bottomed tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>*Various&#160;</td>
			<td>*Dissection scissors, dumont forcep and standard forcep&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Richert</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 100 x 15 mm Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td>*Falcon brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH0208-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brefeldin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7651-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134-1KG</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14175-095&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS Ultrapure</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-3pelps</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH0268-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9258-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant GM-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-03-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooster Comb Sodium Hyaluronate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H5388-1G</td>
			<td>*Used to make fluoresceinated hyaluronan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21870-076</td>
			<td>No sodium pyruvate no glutamine. Warm media to 37oC before using.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher&#160;</td>
			<td>5271-10&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50876-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5290-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fc Receptor (unlabeled), Tissue Culture Supernatant</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Clone: 2.4G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11c PeCy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0114-82</td>
			<td>Clone: N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Gr-1 efluor450</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-5931-82</td>
			<td>Clone: RB6-8C5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MHCII APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5321-82</td>
			<td>Clone: M5/114.15.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Anti-MerTK</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>BAF591</td>
			<td>Goat polyclonal IgG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4317-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and identification of gm-csf derived alveolar-like macrophages and dendritic cells from mouse bone marrow

Makrophagen und dendritischen Zellen (DCs) sind angeborene Immun in Geweben und lymphatischen Organen gefunden Zellen, die eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern spielen. Sie sind jedoch schwierig in ausreichender Zahl zu isolieren , sie im Detail zu studieren, also in vitro - Modelle entwickelt wurden. In vitro - Kulturen von Knochenmark stammenden Makrophagen und dendritische Zellen sind gut etabliert und wertvolle Methoden zum immunologischen Studien. Hier wird ein Verfahren zur Kultivierung und beide DCs und Makrophagen aus einer einzigen Kultur primärer Maus-Knochenmarkszellen zu identifizieren mit der Cytokin Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) beschrieben. Dieses Protokoll basiert auf dem etablierten Verfahren zuerst von Lutz et al entwickelt. im Jahr 1999 für die Knochenmark abgeleiteten DCs. Die Kultur ist heterogen, und MHCII und fluoresceinierten Hyaluron (FL-HA) verwendet Makrophagen von unreifen und reifen DCs zu unterscheiden. Diese GM-CSF Makrophagen provide eine bequeme Quelle für in - vitro - Makrophagen , die eng Alveolarmakrophagen in beiden Phänotyp und Funktion ähneln.

Ein Flussdiagramm der wichtigsten Schritte dieses Verfahrens zusammenfassend in 1 dargestellt ist. Die Dichte und die Morphologie der Kultur Knochenmark zu verschiedenen Zeiten der Kultur sind in Abbildung 2 dargestellt. Am Tag 1 werden die Zellen klein und einfach , aber für Tag 3, gibt es mehr Zellen, einige sind größer und einige haben anhaften begonnen. Am Tag 6 gibt es eine eindeutige adhärenten und nicht adhärenten Fraktion (2A).</stro...

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Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K Aufrufe.  University of British Columbia. Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages. 

Serie: Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease severity in patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis (PAP)1-3. As abrogation of GM-CSF bioactivity in the lung is the likely cause for autoimmune PAP4,5, it is promising to measure the neutralizing capacity of GM-CSF autoantibodies for evaluating the disease severity in each patient with PAP.
Until now, neutralizing capacity of GM-CSF autoantibodies has been assessed by evaluating the growth inhibition of human bone marrow cells or TF-1 cells stimulated with GM-CSF6-8. In the bioassay system, however, it is often problematic to obtain reliable data as well as to compare the data from different laboratories, due to the technical difficulties in maintaining the cells in a constant condition.
OBJECTIVE: To mimic GM-CSF binding to GM-CSF receptor on the cell surface using cell-free receptor-binding-assay.
METHODS: Transgenic silkworm technology was applied for obtaining a large amount for recombinant soluble GM-CSF receptor alpha (sGMR&alpha;) with high purity9-13. The recombinant sGMR&alpha; was contained in the hydrophilic sericin layers of silk threads without being fused to the silk proteins, and thus, we can easily extract from the cocoons in good purity with neutral aqueous solutions14,15. Fortunately, the oligosaccharide structures, which are critical for binding with GM-CSF, are more similar to the structures of human sGMR&alpha; than those produced by other insects or yeasts.
RESULTS: The cell-free assay system using sGMR&alpha; yielded the data with high plasticity and reliability. GM-CSF binding to sGMR&alpha; was dose-dependently inhibited by polyclonal GM-CSF autoantibody in a similar manner to the bioassay using TF-1 cells, indicating that our new cell-free assay system using sGMR&alpha; is more useful for the measurement of neutralizing activity of GM-CSF autoantibodies than the bioassay system using TF-1 cell or human bone marrow cells.
CONCLUSIONS: We established a cell-free assay quantifying the neutralizing capacity of GM-CSF autoantibody.

We designed a cell-free receptor binding assay in order to estimate the binding of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) to the receptors. It enables us to evaluate competitive inhibition of biotinylated GM-CSF binding to soluble GM-CSF receptor alpha by GM-CSF autoantibody with excellent reproducibility.

Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.