Dieses Protokoll zielt darauf ab, große Mengen an unstimulierten Makrophagen zu erhalten, die aus dem Knochenmark gewonnen wurden und niemals Gewebefaktoren oder Zytokinen ausgesetzt waren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Anzahl der Zellen, die von einem einzigen Tier gewonnen werden. Mit dem richtigen Verfahren kann ungefähr 2 mal 10 hoch 7 Makrophagen erhalten werden.
Diese Methode könnte Forschern aus verschiedenen Bereichen helfen, Makrophagen zu untersuchen, wie z. B. Zellbiologie, Pathologie, Immunologie und Parasitologie. Da Zellen immer anfällig für Kontaminationen sind, ist es notwendig, bei allen sterilen Schritten vorsichtig zu sein und eine Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank zu verwenden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Das Verfahren wird von Izabela Aparecida de Souza vorgeführt. Ein Masterstudent aus unserem Labor.
Um den Eingriff an der ordnungsgemäß eingeschläferten, acht Wochen alten männlichen C57BL/6-Wildtyp-Maus zu beginnen, tränken Sie die Maus mit 70%iger Ethanollösung. Machen Sie mit einer sterilen Schere einen einen Zentimeter langen Schnitt entlang des Bauches und entfernen Sie die Haut, bis der Muskel der Hinterbeine vollständig freigelegt ist. Entfernen Sie dann vorsichtig die Hinterbeine auf Höhe der Hüfte, ohne den Oberschenkelknochen und das Schienbein zu brechen.
Legen Sie die intakten Hinterbeine in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit 70%iger Ethanollösung. Übertragen Sie in einer Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank die isolierten Beine von 70 % Ethanol auf steriles PBS. Reinigen Sie die Knochen mit einer Pinzette und Desinfektionstüchern, indem Sie alle anhaftenden Muskeln und Faszien entfernen.
Verwenden Sie dann eine sterile chirurgische Skalpellklinge, um die Knochenepiphyse an beiden Enden zu durchtrennen und das Knochenmark freizulegen. Füllen Sie eine 20-Milliliter-Spritze mit 10 Millilitern sterilem PBS, ergänzt mit 2%iger Penicillin-Streptomycin-Lösung, und schließen Sie eine 26-Gauge-Nadel daran an. Halten Sie den Knochen mit einer anatomischen Präparierzange mit einer Hand fest.
Führen Sie die Nadel mit der anderen Hand vorsichtig in die Knochenhöhle ein, ohne den Knochen zu zerquetschen. Waschen Sie dann das Innere des Knochens mit PBS aus und sammeln Sie das Knochenmark in einem sterilen konischen Zentrifugenröhrchen. Nach dem Waschen sollte die Knochenhöhle weiß erscheinen.
Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen bei 300 g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in einem Milliliter DMEM/F1210-Medium resuspendiert. Homogenisieren Sie die Suspension und fügen Sie weitere neun Milliliter des Mediums hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Milliliter zu erhöhen.
Geben Sie jeweils einen Milliliter der Vorläuferzellsuspension in eine von 10 runden Petrischalen aus Kunststoff mit den Maßen 100 Milliliter x 20 Millimeter. Verteilen Sie die Zellen mit einer Pipette auf den Platten, um eine gleichmäßige Verteilung zu erhalten. Geben Sie dann neun Milliliter DMEM/F1210, ergänzt mit 20 % L929-Zellüberstand, in jede Schale.
Inkubieren Sie die Schalen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am dritten Tag werden 10 Milliliter DMEM/F1210 Medium, ergänzt mit 20 % L929-Zellüberstand, in jede Schale gegeben. Die dabei entstehenden 20 Milliliter Kulturmedium in jeder Schale reichen für das Zellwachstum bis zur Reifung aus.
Die Überstände aus allen Kulturschalen entsorgen. Waschen Sie jede Kulturschale mit 10 Millilitern sterilem magnesium- und kalziumfreiem PBS, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, und entsorgen Sie die Lösung nach dem Waschen. Geben Sie drei Milliliter nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde, zu jeder Schale.
10 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Verwenden Sie dann ein inverses Mikroskop, um zu visualisieren, ob die Makrophagen von den Zellkulturschalen dissoziieren. Spülen Sie das Geschirr mit einer serologischen Pipette mit der nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung und führen Sie wiederholt kreisende Bewegungen aus, um eine vollständige Dissoziation der Makrophagen zu gewährleisten.
Sammeln Sie die Lösung aus allen Kulturschalen und mischen Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie noch einmal 10 Milliliter steriles, vorgewärmtes PBS in die leeren Kulturschalen. Das konische Röhrchen mit der kombinierten aufgefangenen Lösung wird 10 Minuten lang bei 300 g und vier Grad Celsius zentrifugiert.
Den Überstand verwerfen und das Pellet mit einem Milliliter DMEM/F1210 resuspendieren. Homogenisieren Sie die Suspension langsam und vorsichtig, indem Sie sie auf und ab pipettieren, ohne die Zellen zu beschädigen. Verdünnen Sie ein 10-Mikroliter-Aliquot der Makrophagenlösung, indem Sie 10 Mikroliter Trypanblau hinzufügen, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen.
Am siebten Tag produzierte jede Schale etwa 2 Millionen Makrophagen. Die Exposition gegenüber dem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor aus dem L929-Überstand verwandelte die Knochenmarkvorläufer allmählich in reife Makrophagen, die aufgrund zytoplasmatischer Verlängerungen eine typische verteilte Morphologie aufwiesen. Am dritten Tag sind einige unreife Makrophagen aufgetaucht, die eine typische runde Morphologie mit wenigen Membranvorsprüngen aufweisen.
Obwohl sie sich im Laufe des gesamten Prozesses veränderten, waren sieben Tage notwendig, um eine angemessene Anzahl und Reife zu erreichen. Die erhaltenen Makrophagen zeigten in der durchflusszytometrischen Analyse eine homogene Population in Bezug auf Größe und Granularität. Darüber hinaus exprimierten 100% der Population die charakteristischen Oberflächenmoleküle F480 und CD11B, so dass sie eine einzige, gut definierte Zellpopulation bildeten.
Die Phagozytosefähigkeit der reifen und gut differenzierten Makrophagen wurde durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen bestätigt, die zeigen, dass die Hauptparasiten der Phagozytose Leishmania in den Makrophagen sind. Die Beine sollten vorsichtig vom Tier entfernt werden, da dies in einer unsterilen Umgebung geschieht und die wichtigste Kontaminationsquelle darstellt. Die Beine dürfen außerhalb der Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank nicht gebrochen werden.
Die aus Knochenmark gewonnenen Makrophagen, die aus diesem Protokoll gewonnen wurden, können verwendet werden, um anschließend eine Makrophagen-In-vitro-Polarisation durchzuführen, um die Makrophagenphysiologie zu verstehen.
