Diese Arbeit wurde von Singapur NRF Gemeinschaft (NRF-2011NRF-NRFF001-025) sowie CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014) finanziert.

HINWEIS: Die RNA von Interesse im Rahmen dieser Studie ist ein Fragment von AR 3&#39;UTR. 1. Herstellung von Biotin-markierter RNA <ol><li> Um die RNA zu erhalten, T7-AR-Oligos durch PCR, gefolgt von in vitro Transkription unter Verwendung eines kommerziellen Kits und nach den Anweisungen des Herstellers 11 amplifizieren. HINWEIS: T7-AR-F und T7-AR-R: Primer für die PCR sind in Tabelle 4 aufgeführt. </li><li> Für nicht-spezifische Bindungskontrolle, amplifizieren eine Teilsequenz der Glühwürmchen - Luciferase (FL) DNA durch PCR aus psiCHECK-2 - Plasmid, gefolgt von in vitro Transkription. HINWEIS: Primer für die PCR sind in Tabelle 4: hluc (+) - T7-probe-F und hluc (+) - Sonde-R Tabelle 4 Sequenzen von Template und Primer für die PCR - Amplifikation... </li><li> Für eine 50 &amp; mgr; l PCR-Reaktion, mischen 50 ng DNA (Oligo oder Plasmid), 4 ul dNTPs (2,5 mM jedes einzelnen dNTP), 5 ul 10x Reaktionspuffer, 1 ul 2,5 U / &amp; #181; l DNA-Polymerase, 2 &amp; mgr; l 10 &amp; mgr; M Vorwärtsprimer, 2 ul 10 uM Reverse-Primer und Nuklease-freies Wasser. <ol><li> Führen Sie die PCR-Amplifikation in einem Thermocycler das folgende Programm. Schritt 1: ein Zyklus von 95 ° C für 2 min; Schritt 2: 35 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 72 ° C für 30 sec (AR) oder 60 s (FL); Schritt 3: ein Zyklus von 72 ° C für 10 min. </li></ol></li><li> Synthetisieren biotinylierten RNAs eine in vitro Transcription Kit folgenden Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von 11. In diesem Experiment verwenden PCR-Produkte als Matrizen für die RNA-Synthese. Für eine 20 &amp; mgr; l in vitro Transkriptionsreaktion, Mischungs 200 ng PCR amplifizierte DNA, 2 &amp; mgr; l jedes einzelnen NTP, 1 ul 10 mM Biotin-CTP, 2 ul 10x Reaktionspuffer und 2 &amp; mgr; l T7 - RNA - Polymerase. Inkubieren der Mischung bei 37 ° C für 4 Stunden. </li><li> Folgende in vitro Transkription, treat Reaktionsmischung mit 1 ul 2 U / &amp; mgr; l DNase bei 37 &amp; #176; C für 15 min Templat-DNA abzubauen. Schließlich wird die biotinylierte RNA auf ein Gesamtvolumen von 60 ul zur anschließenden Reinigung verdünnen. </li><li> Reinige biotinylierten RNAs Salze und nicht eingebauten Nukleotide zu entfernen , indem Reinigungssäulen verwendet folgenden Anweisungen des Herstellers 12. Messen Sie RNA-Konzentration und bei -80 ° C für die nachfolgende Pull-down-Assays. </li><li> Um eine ordnungsgemäße Sekundärstruktur für die RNA von Interesse in der RNA-Protein - Wechselwirkung, Wärme 50 ul biotinyliertes RNA (50 pM) bei 90 ° C für 2 min, Chill auf Eis für 2 min, dann liefern mit 50 ul 2x RNA - Struktur - Puffer (Tabelle 3) und ermöglichen die RNA bei RT für 30 min Falten 13,14. </li></ol> 2. Herstellung von RNA-konjugierten Beads HINWEIS: Verwenden Sie einen Magnetfuß zur Trennung der magnetischen Kügelchen und Überstand. <ol><li> Resuspendieren der Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen in der Originalflasche durch kurze Vortexing folgenden Anweisungen des Herstellers. Übertragen Sie 150 ul resuspendiert Kügelchen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Das Röhrchen wird auf Magneten für 1 min. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. HINWEIS: In der RNA Pull-down-Assays, wenn erneut suspendiert Perlen aus Originalfläschchen Aliquotierung, verwenden 50 ul Perlen für einen Test durch Western-Blot gefolgt, und 200 &amp; mgr; l Perlen für einen Test von MS gefolgt. </li><li> Waschen Perlen einmal durch Resuspendieren Wulst Pellet mit 1 ml der empfohlenen 1x W &amp; B des Herstellers (Bindungs- und Wasch) Puffer (Tabelle 3), gefolgt von den Röhrchen 5 Minuten bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. </li><li> Zu inaktivieren RNase on beads, wasche zweimal Perlen, jeweils durch Resuspendieren bead Pellet mit 400 ul Puffer A Puffer A ist eine alkalische Lösung , die 0,1 M NaOH und 0,05 M NaCl (Tabelle 3). Drehen Sie das Rohr für 2 Minuten bei Raumtemperatur in einem Rotator. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. </li> &lt;li&gt; Zum Entfernen NaOH aus Perlen, zweimal waschen Perlen, jedes Mal durch Resuspendieren Wulst Pellet mit 400 ul Puffer B (Tabelle 3), gefolgt von der Röhre 2 min bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. Überstand verwerfen. Halten Wulst Pellet. </li><li> Resuspendieren Wulst Pellet mit 300 ul 2x W &amp; B-Puffer, geteilt Perlen gleichmäßig und Transfer in drei 1,5-ml-Röhrchen (100 &amp; mgr; l Kügelchen pro Röhrchen). Versorgen Sie die Kügelchen enthaltende Röhrchen mit 100 &amp; mgr; l RNase-freiem Wasser, biotinyliert 100 ul FL RNA und 100 ul biotinyliertes AR 3&#39;UTR RNA sind. </li><li> Inkubieren jedes Wulstes Mischung für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Rotation. Die Röhrchen auf Magnet für 1 min. Entsorgen Sie alle Überstand. Halten Sie Perle Pellets. </li><li> Zweimal waschen Perlen, jeweils durch jedes Wulstes Pellet mit 400 ul 1x W &amp; B-Puffer erneut suspendiert, gefolgt von Röhrchen für 5 min bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. </li><li> Die Röhrchen auf Magnet für 1 min. Entsorgen Sie alle Überstand. Resuspendieren jede Wulst pellet mit 50 ul Kernisolationspuffer (Tabelle 3). </li></ol> 3. Preadipozyten Isolierung und Adipogenese Induction <ol><li> Wie in 5 in früheren Veröffentlichungen beschrieben, sezieren Preadipozyten aus dem interskapulären braunen Fettpolster (C57BL6 Wildtyp - Mäusen, 3 Wochen alt). </li><li> Wachsen und in vitro Differenzierung der Präadipozyten 5. Zellen sind bereit für nachgeschaltete Anwendung 4-5 Tage nach Beginn der Differenzierung. </li></ol> 4. Herstellung von Zellysat von Primary Adipozyten HINWEIS: Stellen Sie sicher, alle Verfahren von Zelllysat Zubereitung auf Eis, und alle Puffer auf Eis gekühlt. Pre-Chill-Dounce-Glas Homogenisator auf Eis. <ol><li> Wachsen und unterscheiden Preadipozyten in 15 cm - Schalen 5 (siehe Abschnitt 3.2). Jedes Gericht bietet ausreichend Zellen für eine RNA-Pull-Down-Assay. Am Tag 4 oder 5. Tag der Differenzierung, der Verwerfungszellkulturmedium, und waschen ceLLS einmal mit 1x PBS. </li><li> Zur Ernte Zellen, fügen Sie 10-15 ml 1x PBS zu den Zellen, kratzen Zellen in einem 50-ml-Röhrchen und Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 200 g für 5 min bei RT zu sammeln. Überstand verwerfen unter Verwendung von 1 ml Pipette. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 2 ml hypotonischen Puffer (Tabelle 3), und für 15 min Zellen auf Eis inkubieren. Transfer-Zellen zu einem 15 ml-Dounce-Glas-Homogenisator und Scherzellen mechanisch auf Eis mit 20 Schlägen. </li><li> Pellet Zellkerne durch Zentrifugation bei 3.300 xg für 15 min bei 4 ° C. Halten Sie Kerne Pellets auf Eis für die weitere Verwendung (siehe Abschnitt 4.6). Überstand in 1,5 ml-Röhrchen, fügen 3M KCl gegen den Überstand zu einer Endkonzentration von 150 mM zu erhalten, und Schleudern bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation vorsichtig entfernen lipidlayeron oben unter Verwendung von 1 ml Pipette und sammeln Überstand als zytoplasmatische Zellysat. </li><li> Resuspendieren Kerne Pellet in 1 ml Kernisolationspuffer (siehe Abschnitt 4.4). Transfer Kerne in ein 15 ml-Dounce-Glas-Homogenisator unter Verwendung von 1 ml-Pipette und Scherkerne mechanisch auf Eis mit 100 Hüben. Kerntrümmer Pellet durch Zentrifugation bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C und sammle Überstand als Kern zellulären Lysats. </li><li> Entweder verbinden die Kern- und Cytoplasma-Zellysaten oder jede Fraktion getrennt zu verwenden, für die nachfolgende Pull-Down-Anwendung. In diesem Beispiel Experiment wurden diese zwei Fraktionen von Zell-Lysat in einem Volumenverhältnis von 1: 1. </li><li> Hinzufügen RNase Inhibitor zu diesem Lysat unfraktioniertem Zelle zu einer Endkonzentration von 0,5 U / &amp; mgr; l zu erhalten. Beiseite 100 ul Zelllysat als Eingangskontrolle für Western - Blot - 15. </li></ol> 5. Bindung und Elution von RBP <ol><li> Split Zelllysat in drei gleiche Aliquots (1 ml Zelllysat in einem 1,5-ml-Röhrchen), und Inkubation mit leeren, FL RNA-konjugierten und AR 3&#39;UTR RNA-konjugierte Kügelchen (siehe Abschnitt 2.8), jeweils für 3 Stunden bei 4 ° Cmit Rotation. </li><li> Die Röhrchen auf Magnet für 1 min. Sammeln Überstand einer 1 ml Pipette, gefolgt von RNA-Isolierung aus dem Überstand RNA Ganzheitlichkeit zu bestätigen. Isolieren RNA durch eine Säure Guanidiniumthiocyanat-Phenol - Lösung nach den Anweisungen des Herstellers verwendet (Tabelle 2). Bewerten Sie die RNA Intakt durch die Analyse von 28S und 18S-Untereinheiten der ribosomalen RNA. Halten Wulst Pellets auf Eis. </li><li> Waschen Sie die magnetischen Kügelchen sechs Mal, jedes Mal durch Resuspendieren jedes Wulstes Pellet mit 1 ml Kernisolierungspuffer, enthaltend 40 U RNase-Inhibitor und 0,25% IGEPAL, gefolgt von Röhrchen für 2 min bei Raumtemperatur in einem Rotator dreht. Verwenden Sie einen Magnetfuß zur Trennung der magnetischen Kügelchen und Überstand. Entsorgen Sie alle Überstand. Halten Wulst Pellets auf Eis. </li><li> Verwenden Sie folgende Schritte, um RNA-Protein-Komplexe, die aus Perlen für Western-Blot-eluieren. Zunächst resuspendieren jeder Wulst Pellet in 75 ul Kernisolationspuffer; Dann fügen Sie 25 ul 4x Western-Blot-Laden buffer (enthaltend SDS) mit einem Gesamtvolumen von 100 ul zu erhalten. Schließlich sieden Perlen in 100 ul dieser Lösung bei 95 ° C für 5 min. HINWEIS: Verwenden Sie folgende Schritte RNA-Protein-Komplexe, die aus Perlen für MS zu eluieren. Schritt 1: resuspendieren jedes Wulstes Pellet in 100 &amp; mgr; l Elutionspuffer (Tabelle 3); Schritt 2: bead Proben für 2-3 h bei Raumtemperatur unter Rotation inkubieren; Schritt 3: Zentrifuge und sammeln proteinhaltige Überstand; Schritt 4: Proteinlösungen 20-30 ul vor der Vorlage für MS konzentrieren. </li><li> Zentrifuge jeweils 100 &amp; mgr; l Kügelchenprobe bei 12.000 xg für 30 sec bei 4 ° C und sammle den Überstand. Aliquot 15 ul Überstand für Western-Blot-Analyse (siehe Abschnitt 6.1 und 6.2). Sonde die resultierende Membran mit dem verdünnten HuR monoklonalen Maus-Antikörper (1: 1000 Verdünnung), über Nacht. </li></ol> 6. Western Blotting für die Überprüfung der RBP <ol><li> Separate RBPs durch SDS-PAGE unter Verwendung von Standardtechniken. </li><li> Führen wirVerwendung von Standardtechniken Heck-Blotting durch Sondieren für die RBPs mit der RNA von Interesse verbunden. Hinweis: In dieser Demo-Experiment, monoklonale HuR Maus-Antikörper für die Immunnachweis von HuR Protein verwendet wurde. </li><li> Inkubieren der resultierenden Membran mit dem verdünnten HuR Antikörper (1: 1000 Verdünnung) in 5% w / v fettfreie Trockenmilch, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 bei 4 ° C unter leichtem Schütteln über Nacht. Waschen Sie die Membran dreimal mit 1x TBST. Inkubieren Membran mit dem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 1 Stunde (anti-Maus-IgG-HRP der Ziege). Waschen Sie die Membran. Entwickeln und Aufzeichnungssignal. </li></ol>

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Keine Interessenkonflikte erklärt.

lncRNAs und RBPs haben eine lebenswichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, aber die molekularen Mechanismen dieser Moleküle schlecht verstanden werden. Identifizierung von Proteinen, die mit lncRNA Molekülen interagieren ist ein wichtiger Schritt in Richtung auf die Regulationsmechanismen aufzuklären. Anreicherung von RBPs durch die RNA-Pull-Down-Assay-System wird in-Lösung auf Basis von Erfassung von komplexen interagieren, so dass Proteine, die aus einem Zelllysat selektiv extrahiert werden können biotinyliert...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs sind Proteine, die bei der Bildung von RNA-Protein-Komplexe in Zellen zur Doppel- oder Einzelstrang-RNA binden und zu beteiligen. RBPs kann eine Vielzahl von RNA-Spezies binden, einschließlich mRNA und lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) und deren Einfluss auf posttranskriptionales Ebenen ausüben. Beide RBPs und lncRNAs sind , sich als neue Aufsichtsbehörden bei adipösen Entwicklung und Funktion 1,2,3. Um zu verstehen, den Mechanismus der RBP- und lncRNA vermittelte Regulation der zellulären Wege, ist es oft notwendig ist, die Wechselwirkung zwischen einem spezifischen RNA-Moleküls und eines oder mehrere RBPs zu erfassen, und manchmal das gesamte Spektrum von Proteinpartner einer RNA zu identifizieren, Transkript. Jedoch kann der Versuch aufgrund des hohen Gehaltes an Lipiden in Adipozyten schwierig sein. Die RNA - Pull-Down - Protokoll hier beschrieben werden eingesetzt 4,5 die Proteinpartner eines spezifischen RNA aus den Adipozyten Lysaten von Primärkulturen zu erhalten. Rationale für dieses Protocol wird wie folgt zusammengefasst. Ein RNA - Köder in vitro aus einem DNA - Template transkribiert ist, Biotin-markierte und konjugiert an Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen 4. Die RNA Köder wird mit Zelllysaten inkubiert für die Bildung von RNA-Protein-Komplexen zu ermöglichen, die anschließend gezogen werden, auf einem Magnettreten. Mehr die RNA - Pull-Down - Protokoll unten beschrieben speziell, verwenden Sie ein RNA - Fragment von AR 3&#39;UTR als Köder HuR Protein, ein universell ausgedrückt RBP gebunden 3&#39;UTR von mRNAs 6,7, von theadipocytelysate der Primärkultur zu erhalten. Um die Bindungsspezifität dieses Assays testen, wurde eine nicht-relevanten RNAas auch blank Streptavidin-Kügelchen als Kontrolle eingeschlossen. Dieses Protokoll ist kompatibel mit Western - Blot oder Massenspektrometrie (MS) die Erfassung eines bestimmten RBP zu bestätigen oder das gesamte Repertoire der erfassten RBPs bzw. 8 zu identifizieren. Verschiedene Techniken sind verfügbar RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchens. Offenbaren RNAs gebunden durch eine gegebene RBP, RIP (RNA Immunpräzipitation) und CLIP (UV-Vernetzung und Immunpräzipitation) angewendet werden kann. Im Gegensatz dazu kann zu identifizieren angewendet werden Proteinpartner eines bestimmten RNA, RNA Pull-Down-Chirp (Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung), CHART (Capture-Hybridisierungsanalyse von RNA-Targets) und RAP (RNA-Antisense-Reinigung). Im Vergleich zu den späteren, RNA-Pull-down-Technik dauert weniger Aufwand einzurichten. Es kann zu erfassen Proteine ​​in vitro verwendet werden , und in vivo. Die in - vivo - Ansatz von RNA - Pull-down, die technisch anspruchsvoller als seine in - vitro - Gegenstück ist, RNA-Protein - Interaktionen bewahrt durch in Zellen Vernetzung erfasst Aptamer-markierte RNAs von Interesse von Zellen und erkennt anschließend gebunden RBPs. RNA - Pull-down kann zu bereichern niedrig reichlich RBPs verwendet werden, und die RNA-Protein - Komplexe zu isolieren und zu identifizieren , die bei der Kontrolle der zellulären Regulation 9,10 diversen funktionalen Rollen haben </sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Major materials used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript kit</td><td>&amp;nbsp;Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-CTP&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway spin columns&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&amp;nbsp;</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline (1&amp;times;PBS)</td><td>&amp;nbsp;HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&amp;nbsp;Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Major equipment used in this study.&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100 thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO rotator Multi Bio RS-24&amp;nbsp;</td><td>BOECO,Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnet&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) entstehen als regulatorischer Ebene in der Entwicklung und Funktion von Fettgewebe. RBPs spielen eine wichtige Rolle bei der Genregulation bei posttranskritionelle Ebenen durch die Stabilität und Translationseffizienz von Ziel-mRNAs beeinflussen. RNA pull-down-Technik weit verbreitet RNA-Protein-Wechselwirkung zu untersuchen ist, die notwendig ist, den Mechanismus zugrunde liegende RBPs &#39;sowie lange nicht-kodierenden RNAs&#39; (lncRNAs) Funktion aufzuklären. Jedoch stellt die hohe Lipid Fülle in Adipozyten eine technische Herausforderung, dieses Experiment in der Durchführung. Hier ist eine detaillierte RNA Pull-Down-Protokoll wird für die primäre Adipozyten Kultur optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptors (AR) 3 &#39;untranslatierten Region (3&#39;-UTR), die eine Adenylat-uridylat reichen elementwas verwendet als ein Beispiel enthält, zu zeigen, wie ihre RBP Partner HuR Protein von Adipozyten lystate abzurufen. Das hier beschriebene Verfahren kann um die Wechselwirkungen zu detektieren angewendet werden zwischenRBPs und nicht-kodierenden RNAs sowie zwischen RBPs und kodierenden RNAs.

In dieser Demo-Experiment wurde ein AR-RNA-Fragment als Köder verwendet, um seine bindende Protein HuR zu erfassen. Sowohl ein FL RNA Köder, die HuR Protein und ein Aliquot von unkonjugiertem blank Streptavidinbeads dienten als negative Kontrollen nicht relevant ist. RNA-Protein-Wechselwirkungen können entweder im Kern oder Cytoplasma auftreten, und das Pull-Down-Protokoll kann entweder insgesamt oder fraktionierte (Kern- oder cytoplasmatische) Zelllysate angewendet werden. Analyse vo...

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Ein RNA-Pull-down-Protokoll wird für den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteine ​​(RBPs) und nicht-codierende sowie kodierenden RNAs hier optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptor (AR) wurde als Beispiel verwendet, zu zeigen, wie ihre RBP aus lystate primärer braunen Fettzellen zu erhalten.

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA Pull-down in Adipocyte Kultur

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

23.5K Aufrufe.  Duke-NUS Medical School.  Ein RNA-Pull-down-Protokoll wird für den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteine ​​(RBPs) und nicht-codierende sowie kodierenden RNAs hier optimiert. Ein RNA-Fragment von Androgen-Rezeptor (AR) wurde als Beispiel verwendet, zu zeigen, wie ihre RBP aus lystate primärer braunen Fettzellen zu erhalten. 

Serie: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Forschung

Genetik

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Biochemie

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding RNA&#39;s family. Although their biological functions remain largely unknown, the number of these lncRNAs has steadily increased and it is now estimated that humans may have more than 10,000 such transcripts. Some of these are known to be involved in important regulatory pathways of gene expression which take place at the transcriptional level, but also at different steps of RNA co- and post-transcriptional maturation. In the latter cases, RNAs that are targeted by the lncRNA have to be identified. That&#39;s the reason why it is useful to develop a method enabling the identification of RNAs associated directly or indirectly with a lncRNA of interest.
This protocol, which was inspired by previously published protocols allowing the isolation of a lncRNA together with its associated chromatin sequences, was adapted to permit the isolation of associated RNAs. We determined that two steps are critical for the efficiency of this protocol. The first is the design of specific anti-sense DNA oligonucleotide probes able to hybridize to the lncRNA of interest. To this end, the lncRNA secondary structure was predicted by bioinformatics and anti-sense oligonucleotide probes were designed with a strong affinity for regions that display a low probability of internal base pairing. The second crucial step of the procedure relies on the fixative conditions of the tissue or cultured cells that have to preserve the network between all molecular partners. Coupled with high throughput RNA sequencing, this RNA pull-down protocol can provide the whole RNA interactome of a lncRNA of interest.

This RNA pull-down method allows identifying the RNA targets of a long non-coding RNA (lncRNA). Based on the hybridization of home-made, designed anti-sense DNA oligonucleotide probes specific to this lncRNA in an appropriately fixed tissue or cell line, it efficiently allows the capture of all RNA targets of the lncRNA.

RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Krebsforschung

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; untranslated region (UTR) of target mRNA to inhibit protein translation or in some instances cause mRNA degradation. The binding of the miRNA to the 3&#39; UTR of the target mRNA is mediated by a 2&#8211;8 nucleotide seed sequence at the 5&#39; end of miRNA. While the role of miRNAs as cellular regulatory molecules is well established, identification of the target mRNAs with functional relevance remains a challenge. Bioinformatic tools have been employed to predict sequences within the 3&#39; UTR of mRNAs as potential targets for miRNA binding. These tools have also been utilized to determine the evolutionary conservation of such sequences among related species in an attempt to predict functional role. However, these computational methods often generate false positive results and are limited to predicting canonical interaction between miRNA and mRNA. Therefore, experimental procedures that measure direct binding of miRNA to its mRNA target are necessary to establish functional interaction. In this report, we describe a sensitive method for validating direct interaction between the cellular miRNA miR-125b and the 3&#39; UTR of PARP-1 mRNA. We elaborate a protocol in which synthetic biotinylated-miRNA mimics were transfected into mammalian cells and the miRNA-mRNA complex in the cellular lysate was pulled down with streptavidin-coated magnetic beads. Finally, the target mRNA in the pulled-down nucleic acid complex was quantified using a qPCR-based strategy.

This report describes a fast and reliable method for validating mRNA targets of cellular miRNAs. The method uses synthetic biotinylated Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA mimics to capture target mRNA. Subsequently, streptavidin-coated magnetic beads are employed to pulldown the target mRNA for quantification by qPCR polymerase chain reaction.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights the need to better understand the molecular mechanism involved in adipocyte dysfunction to develop new therapies against obesity-related diseases. Modulating the expression of proteins and micro-RNAs in adipocytes remains highly challenging. This paper describes a protocol to differentiate murine fibroblasts into mature adipocytes and to modulate the expression of proteins and micro-RNAs in mature adipocytes through reverse-transfection using small-interfering RNA (siRNA) and micro-RNA mimicking (miR mimic) oligonucleotides. This reverse-transfection protocol involves the incubation of the transfection reagent and the oligonucleotides to form a complex in the cell culture plate to which the mature adipocytes are added. The adipocytes are then allowed to reattach to the adherent plate surface in the presence of the oligonucleotides/transfection reagent complex. Functional analyses such as the study of insulin signaling, glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis can be performed on the transfected 3T3-L1 mature adipocytes to study the impact of protein or micro-RNA manipulation on adipocyte function.

Presented here is a protocol to deliver oligonucleotides such as small-interfering RNA (siRNA), micro-RNA mimics (miRs), or anti-micro-RNA (anti-miR) into mature adipocytes to modulate protein and micro-RNA expression.

Ein Adipozyten-Zellkulturmodell zur Untersuchung des Einflusses der Protein- und Mikro-RNA-Modulation auf die Adipozytenfunktion

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

Nachweis von RNA-bindenden Proteinen durch

Zusammenfassung

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Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinität vermittelt Reinigung von RNA-wechselwirkenden Proteinen in Mesotheliomzellen

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Ein Adipozyten-Zellkulturmodell zur Untersuchung des Einflusses der Protein- und Mikro-RNA-Modulation auf die Adipozytenfunktion

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