Die Charakterisierung der Proteinbindung an RNA in vivo bleibt aufgrund der komplexen Natur der RNA und der vielen Faktoren, die ihre Interaktion mit Proteinen beeinflussen, eine große Herausforderung. RNA-Bindungsprotein oder RBP-RNA-Affinität wird in lebenden Bakterienzellen gemessen. Da die zelluläre Umgebung sowohl die Struktur der RNA als auch die daraus resultierende RBP-RNA-Bindung beeinflusst, ist die Messung der Affinität in vivo entscheidend für das Verständnis solcher Wechselwirkungen in natürlichen Systemen.

Das Geheimnis des Erfolgs liegt in der Gestaltung der Plasmide. Das Design sollte mehrere Deltawellen verwenden und das Einfügen von Stop-Codons und Frameshift-Mutationen vermeiden. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Bindungswebsitekassette entwerfen.

Jedes Mini-Gen enthält eine EagI-Restriktionsstelle, 40 Basen vom fünf Hauptende des Kanamycin-Resistenzgens, den pLac/Ara-Promotor, die Ribosome-Bindungsstelle, AUG des mCherry-Gens, einen Abstandsraum, eine RBP-Bindungsstelle, 80 Basen vom fünf Primende des mCherry-Gens und eine ApaLI-Einschränkungsstelle. Um die Erfolgsrate des Assays zu erhöhen, entwerfen Sie drei Bindungsplatzkassetten für jede Bindungsstelle mit Abstandshaltern, die aus mindestens einer, zwei und drei Basen bestehen. Verdauen Sie sowohl die Minigene als auch den Zielvektor mit EagI HF und ApaLI, bevor Sie die Kolonnenreinigung der Digests durchführen.

Ligate die verdauten Mini-Gene an das Bindungsstellen-Backbone, das den Rest des mCherry-Reportergens, den Terminator und ein Kanamycin-Resistenzgen enthält. Verwandeln Sie dann die Ligationslösung in Escherichia coli Top 10 Zellen. Nach der Identifizierung positiver Transformanten mittels Sanger-Sequenzierung speichern Sie gereinigte Plasmide im 96-Well-Format bei minus 20 Grad Celsius.

Bewahren Sie die Bakterienstämme auch als Glycerinbestände im 96-Gut-Format bei minus 80 Grad Celsius auf. Kundenspezifische Reihenfolge die erforderliche RBP-Sequenz ohne Stop-Codon als doppelsträngiges DNA-Mini-Gen mit Restriktionsstellen an den Enden. Verwandeln Sie die hergestellten Plasmide in chemisch kompetente Bakterienzellen, die bereits ein RBP mCerulean Plasmid enthalten.

Um Zeit zu sparen, platten Sie die Zellen mit einem Achtkanal-Pipetter auf acht Spurplatten, die Luria-Bertani-Agar mit relevanten Antibiotika enthalten. Kolonien sollten in 16 Stunden bei 37 Grad Celsius erscheinen. Wählen Sie für jedes Doppel-Transformant eine einzelne Kolonie aus und übertragen Sie sie auf 48 Wellplatten mit 1,5 Millilitern LB mit entsprechenden Antibiotika.

Wachsen Sie die Zellen über einen Zeitraum von 18 Stunden bei 37 Grad Celsius Schütteln bei 250 RPM. Lagern Sie die Übernachtungen als Glycerinvorräte bei minus 80 Grad Celsius in 96 Brunnenplatten. Am Morgen programmieren Sie den Roboter, um 180 Mikroliter Halbporenmedium oder SPM in 96 Brunnenplatten zu erwärmen.

Programmieren Sie den Roboter, um die Induktorplatte vorzubereiten. In einer sauberen 96 Brunnenplatte, bereiten Brunnen mit SPM bestehend aus 95%BA und 5%LB. Die Anzahl der Brunnen entspricht der gewünschten Anzahl von Induktorkonzentrationen.

Fügen Sie C4-HSL zu den Brunnen in der Induktorplatte hinzu, die die höchste Induktorkonzentration enthalten. Als nächstes programmieren Sie den Roboter, um das Medium von jedem der höchsten Konzentrationsbrunnen seriell in 23 niedrigere Konzentrationen von null bis 218 Nanomolar zu verdünnen. Das Volumen jeder Induktorverdünnung sollte für alle Stämme ausreichen.

Um die Nachtstämme zu verdünnen, programmieren Sie den Roboter, um den Faktor 10 zu verdünnen, indem Sie 20 Mikroliter Bakterien mit 180 Mikroliter SPM in 48 Brunnenplatten mischen. Dann wieder um den Faktor 10 verdünnen, indem man 20 Mikroliter aus der verdünnten Lösung in die vorgefertigte Stammplatte für die Fluoreszenzmessung nimmt. Programmieren Sie nun den Roboter, um den verdünnten Induktor von der Induktorplatte zu den 96 Brunnenplatten mit den verdünnten Stämmen entsprechend den Endkonzentrationen hinzuzufügen.

Schütteln Sie die 96 Brunnenplatten bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden. In dieser Zeit können Sie die optische Dichte oder OD mit 595 Nanometern sowie die mCherry- und mCerulean-Fluoreszenz alle 30 Minuten über einen Plattenleser messen. Messen Sie für Normalisierungszwecke das Wachstum von SPM, ohne dass Zellen hinzugefügt werden.

Hier sind dreidimensionale Diagramme für eine positive Dehnung dargestellt. Die Plots zeigen rohe OD-Werte, mCerulean-Fluoreszenz und mCherry-Fluoreszenz als Funktion der Zeit und Induktorkonzentration. mCerulean Steady-State-Expressions-Levels wurden für jede Induktorkonzentration sowohl für die positiven als auch für die negativen Stämme berechnet.

Die mCherry-Produktionsrate wurde auch für jede Induktorkonzentration für positive und negative Stämme berechnet. mCherry Produktionsrate wurde als Funktion der mittleren mCerulean Fluoreszenz gemittelt über zwei biologische Duplikate für zwei Stämme. Für die positive Dehnung mit einer spezifischen Bindungsreaktion wird die Passform KRBP unter Verwendung der Fitting-Formel angezeigt.

Für den negativen Stamm wurde kein KRBP-Wert extrahiert. Normalisierte Dosis-Wirkungskurven wurden für 30 verschiedene Stämme bestimmt, basierend auf zwei RBPs als 10 Bindungsstellen an verschiedenen Standorten. Drei Arten von Antworten werden beobachtet, hohe Affinität, geringe Affinität und keine Affinität.

Hier sind quantitative KRBP-Ergebnisse für zwei RBPs, MS2-Beschichtungsprotein und PP7-Beschichtungsprotein mit 10 verschiedenen Bindungsplatzkassetten zu sehen. Dosis-Wirkungs-Kurven für MS2-Beschichtungsprotein mit einer mutierten Bindungsstelle an vier verschiedenen Standorten werden hier gezeigt, um die Wirkung des Mutantenabstandes auf die mCherry-Produktion zu demonstrieren. Die Reihenfolge der getesteten mutierten Bindungsstelle wird angezeigt.

Es ist wichtig, eine Strukturtechnik wie Die Form zu verwenden, um die Struktur des Protein-RNA-Komplexes chemisch zu erforschen und zu visualisieren, welche mRNA-Regionen von der RNA-Bindung betroffen sind. Kürzlich haben wir diese Technik in einer Art und Weise mit hohem Durchsatz verwendet, um gleichzeitig die Affinität der RBPs zu 10.000 Bindungsstellen zu messen.