Dieses optimierte Protokoll verbesserte die Generierung von Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen, die für die Zelltherapie bei Diabetes und die Untersuchung molekularer Mechanismen verwendet werden können, die der Diabetesbiogenese zugrunde liegen. Dies ist eine praktikable Technik, da sie für 2D-Monolayer-Kulturen verwendet wird. Es ist einfach anzuwenden und konsistent über mehrere Kontroll- und patientenabgeleitete pluripotente Stammzelllinien.
Diese Betazellvorläufer können, wenn sie bei einem Diabetiker transplantiert werden, zu insulinsezernierenden Betazellen reifen und möglicherweise Hyperglykämie umkehren. Daher können die erhöhten Prozentsätze von Pankreasvorläufern, die mit unserem Protokoll erzeugt werden, für die Zelltherapie bei Diabetes verwendet werden. Dieses erweiterte Protokoll kann für die Untersuchung der frühen menschlichen Pankreasentwicklung sowohl bei gesunden Personen als auch bei Diabetikern verwendet werden, was aufgrund eines Mangels an Gewebeproben eine Herausforderung darstellt.
Wenn die menschlichen pluripotenten Stammzellen oder hPSC-Kolonien 70 bis 80% Konfluenz erreicht haben, waschen Sie sie zweimal mit warmem PBS in der Gewebekulturhaube. Anschließend saugen Sie den Puffer mit einem tragbaren Staubsauger ab. Als nächstes fügen Sie den Kolonien ein Differenzierungsmedium der ersten Stufe hinzu, das CHIR-99021 enthält, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden.
Ersetzen Sie am nächsten Tag die verbrauchten Medien durch ein Differenzierungsmedium der ersten Stufe ohne CHIR-99021. Nachdem Sie das verbrauchte Medium abgesaugt und die definitiven Endodermzellen zweimal mit warmem PBS gewaschen haben, schwenken Sie die Platte, um Zelltrümmer zu entfernen. Dann fixieren Sie die Zellen, indem Sie 4% Paraformaldehyd hinzufügen, und legen Sie die Platte auf einen zweidimensionalen Shaker.
Nach der Fixierung waschen Sie die Zellen mit TRIS-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,5% Tween enthält, und legen Sie die Platte auf den Shaker. Dann permeabilisieren Sie die festen Zellen durch Zugabe einer großzügigen Menge PBS mit 0,5% Triton X-100 und legen Sie die Platte wieder auf den Shaker. Als nächstes fügen Sie den permeabilisierten Zellen einen frisch zubereiteten Blockierpuffer hinzu und inkubieren die Platte für eine Stunde auf dem Shaker.
Dann fügen Sie den blockierten Zellen verdünnte primäre Antikörper hinzu und legen Sie die Platte bei vier Grad Celsius mit leichtem Schütteln auf den Shaker. Am nächsten Tag nach dem Absaugen der primären Antikörperlösung waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit TBST für jeweils 10 Minuten auf dem Shaker. Als nächstes fügen Sie die sekundären Antikörper hinzu.
Decken Sie die Platte zum Schutz vor Licht mit Aluminiumfolie ab und legen Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf den Shaker. Dann saugen Sie die sekundäre Antikörperlösung ab und waschen Sie die gefärbten Vertiefungen mit TBST 10 Minuten lang auf dem Shaker, wobei die Platte mit Folie bedeckt bleibt. Als nächstes, um die Kerne zu färben, fügen Sie Hoechst-Lösung in die Vertiefungen und legen Sie die Platte auf den Shaker.
Nach zwei bis drei Minuten saugen Sie die Hoechst-Lösung ab und spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS ab. Fügen Sie schließlich PBS zu den gefärbten Zellen hinzu und bilden Sie sie mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop im Dunkeln ab. Am ersten Tag des zweiten Stadiums dissoziieren Sie die hPSC-abgeleiteten endodermalen Zellen, indem Sie sie zuerst mit warmem PBS waschen und dann einen Milliliter warme Enzymlösung pro Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen hinzufügen.
Stellen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei bis fünf Minuten oder bis sich die Zellen voneinander lösen. Dissoziieren Sie die abgelösten Schichten oder Monoschichten von Zellen in den Vertiefungen und sammeln Sie die abgelösten Zellen zusammen in einem 15-Milliliter-Polypropylenrohr unter Verwendung von Halbmedien im Basalstadium. Dann drehen Sie die Zellen herunter, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit einem Milliliter sterilem PBS.
Nachdem Sie die Zellen mit einem automatisierten Zähler gezählt haben, drehen Sie die Zellen erneut und verwerfen Sie den Überstand. Dann resuspendieren Sie das Pellet im entsprechenden Volumen des Differenzierungsmediums der Stufe zwei, das einen Rockinhibitor enthält. Die resuspendierten Zellen auf eine bis 50 mit Membranmatrix beschichtete Platten auffüllen und bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren.
Nach 24 Stunden ersetzen Sie das Medium durch ein Differenzierungsmedium der Stufe zwei ohne den Rock-Inhibitor. Am Ende der vierten Stufe lösen Sie die Zellen, wie zuvor gezeigt, und sammeln Sie sie in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Dann drehen Sie die Zellen, verwerfen Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen mit PBS und dissoziieren Sie sie in einzelne Zellen.
Nach dem Zählen der Zellen mit einem automatisierten Zellzähler drehen Sie die Zellen erneut und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern gekühltem PBS. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter gekühltes 80% Ethanol mit dem Röhrchen auf einem Wirbel mit niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit hinzu. Schließen Sie die Kappe fest und legen Sie die Tube über Nacht leicht geneigt auf den Shaker bei vier Grad Celsius.
Am nächsten Tag drehen Sie die Zellen und waschen Sie das Pellet mit PBS, um alle Klumpen fester Zellen zu dissoziieren. Dann blockieren Sie die festen Zellen für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder vier Grad Celsius über Nacht auf dem Shaker. Als nächstes, um für die Pankreas-Vorläufermarker zu färben, verteilen Sie 200.000 Zellen pro Bedingung einschließlich geeigneter Isotypkontrollen, ungefärbter und sekundärer Antikörperkontrollen in einer 96-Well-V-Bodenplatte.
Drehen Sie dann die Platte kurz und drehen Sie die Platte mit einer schnellen Bewegung, um den Überstand zu verwerfen, ohne die Pellets zu verlieren. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in primären Antikörpern für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Shaker mit sanftem Schütteln. Dann waschen Sie die gefärbten Zellen dreimal mit TBST, indem Sie in den Vertiefungen auf und ab pipettieren.
Zentrifugieren Sie die Zellen erneut, verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie den Zellen sekundäre Antikörper hinzu. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur waschen Sie die gefärbten Zellen zweimal mit TBST. Dann drehen Sie die Platte, sammeln Sie die gefärbten Zellen in 100 Mikrolitern PBS in lichtgeschützten Faxröhren und lassen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometriegerät laufen.
Im Vergleich zur nicht optimierten Methode verbesserte das optimierte Protokoll die Differenzierungseffizienz des Vorläufers der Bauchspeicheldrüse durch Hochregulierung der PDX 1- und NKX 6.1-Koexpression. Insbesondere die Dissoziation endodermaler Zellen und ihre Replattierung auf frischer Membranmatrix sowie eine längere Dauer des dritten Stadiums verstärkten die NKX 6.1-Expression in hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläuferzellen im Vergleich zum nicht dissoziierten Protokoll. Pankreas-Vorläuferzellen, die mit dem optimierten Protokoll erzeugt wurden, erhöhten auch die Anzahl der SOX9-positiven Zellen im Vergleich zur nicht-dissoziierten Methode.
Darüber hinaus erzeugte die optimierte Methode auch einen höheren Anteil an proliferativen NKX 6.1-positiven Zellen, die den Proliferationsmarker Ki67 koexprimierten. Um die Effizienz zu steigern, ist es entscheidend, das HbA1-abgeleitete Endoderm zu dissoziieren und dann die Dauer der Behandlung im dritten Stadium mit FGF-Amyloid-Signalisierung und Hedgehog-Hemmung zu verlängern. Die skalierbare Generierung von Pankreas-Vorläuferzellen unter Verwendung dieses erweiterten Protokolls hat Studien zur Verbesserung der Effizienz und Reifung von aus humanen pluripotenten Stammzellen gewonnenen Pankreas-Betazellen erleichtert und die Modellierung verschiedener Arten von Diabetes ermöglicht.
