Wir erkennen dankbar an die Beta-Zellen-Biologie-Gruppe bei UMass Diabetes Center of Excellence für hilfreiche Ratschläge und Diskussionen. Menschlichen Pankreatische kleinen Inseln wurden durch die NIDDK finanzierte integrierte Islet Distribution Programm (IIDP) bei City of Hope zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von NIH/NIDDK finanziert: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) und von der American Diabetes Association gewähren #1-15-BS-003 (LCA) in Zusammenarbeit mit der Reihenfolge der Amaranth.

Alle Verfahren, bei denen Tiere wurden durch die University of Massachusetts Medical School institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt. Menschlichen Inselchen Studien wurden von UMass Institutional Review Board bestimmt, nicht für IRB Überprüfung oder Befreiung zu qualifizieren, weil sie nicht den Gebrauch von menschlichen Probanden einbeziehen.
1. Insel Isolation und Kultur
<ol><li>Inselchen zu isolieren und getrennt von kontaminierenden exokrinen und duktalen Gewebe mit der Methode Ihrer Wahl. Hinweis: Diese Methode wurde mit kleinen Inseln isoliert von Kollagenase duktale Insufflation und Ficoll Trennung12 (Nagetier) oder nach der Auslieferung Inselchen aus der integrierten Islet Vertriebsprogramm (IIDP13, Mensch) optimiert. Inselchen wurden mit einer Mikropipette P200 handverlesen.</li>
	<li>Zur Optimierung der Morphologie der Insel ermöglichen Sie Inselchen in 10 mL komplette Insel Medium (RPMI mit 10 % FBS, Penicillin/Streptomycin und 5,5 Mmol/L Glucose) in eine Feuchte Kammer, die mit 5 % CO2 bei 37 ° c über Nacht erholen Obwohl dieser Schritt nicht erforderlich ist, um Abschnitte zu erhalten, die Inseln sind nach einer Erholungszeit mehr intakt (siehe Abbildung 2).</li>
</ol>(2) Insel Fixierung
<ol><li>Mit einer Low-Bindung-P200-Spitze, ca. 250 Inselchen äquivalente (IEQ)13 mit einem kalibrierten Raster unter einem Stereomikroskop in ein 1,5 mL geringe Bindung Microfuge Rohr aussuchen. Low-Bindung Tipps und Röhren reduzieren Inselchen Verlust.</li>
	<li>Ermöglichen Sie Inselchen, sich an der Unterseite des Microfuge Rohres. Entfernen Sie die meisten überstand mit P200 pipettieren Spitze, kümmert sich nicht um alle Inseln zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS. Rohr in eine schwingende Eimer Zentrifuge zentrifugieren, bis die Geschwindigkeit 200 X g erreicht und dann Anhalten der Spins. Den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die PBS waschen, für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL 10 % Formalin-Lösung oder Paraformaldehyd 4 % frisch zubereitet. 30 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Für die Ergebnisse bei dieser Methode getestet waren diese Fixierung Methoden zu unterscheiden. Kürzere Fixierung kann auch möglich sein; Es wird empfohlen, die Dauer der Fixierung für gewünschtes Ergebnis zu optimieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fixiermittel mit P200 Spitze.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS. Zentrifugieren Sie Rohr, bis die Geschwindigkeit 200 X g erreicht und dann Anhalten der Spins. Den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die PBS waschen, für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen.</li>
	<li>Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Insel CD (Abbildung 1)
<ol><li>Schmelzen Sie bei der ersten Verwendung des Gels (z. B. Histogel) bei 70 ° C zu und Aliquote in 1,5 mL Microfuge Rohre für langfristige Lagerung. Aliquoten Volumen ist nicht kritisch, da Aliquote wiederverwendet werden können.</li>
	<li>Das Gel (ca. 100 µL pro Probe) bei 70 ° C warm, indem man Microfuge-Röhrchen mit Gel aliquoten in einem Heizblock eingestellt auf 70 ° c</li>
	<li>Übertragen Sie Agarose blaue Perlen (10 µL für jede Probe) in einem 1,5 mL sauber Microfuge Rohr. Gründlich Aufschwemmen der Perlen vor dem pipettieren. Hinweis: Blaue Perlen werden mit den Inseln um visuelle Identifizierung des eingebetteten Materials in der Agarose-Taste und der paraffinblock bei gemischt. Die Anzahl der blauen Perlen verwendet, ist nicht entscheidend für das Ergebnis, aber vermeiden Sie übermäßige Perlen (> 5 x die Anzahl der Inseln) ermöglichen optimale Verteilung der Inselchen in Abschnitten.</li>
	<li>Waschen Sie die blauen Perlen mit 1mL PBS, zweimal. Spinnen Sie für jedes waschen die Perlen 1 min bei 800 X g. Nach der zweiten Wäsche Aufschwemmen der Perlen im (n+ 2) x 10 µL PBS, wobei n die Anzahl der Probenröhrchen ist; zum Beispiel wäre das PBS-Volumen hinzu die Perlen für 2 Probenröhrchen 40 µL.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie der Microfuge Röhrchen mit Inselchen (kurze Spin 200 X g) und entfernen Sie die meisten des Überstands. Die Spitze einer 10 µL Mikropipette Spitze mit einer Schere oder einem Messer abgeschnitten und jedes Insel-Rohr, mit einer sauberen Spitze für jede Probe 10 µL Perlen verleihen. Verwechseln Sie nicht (zur Vermeidung von Inselchen zu verlieren).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Inselchen und Perlen (kurze Spin 200 X g). Entfernen Sie so viel PBS wie möglich mit unbeschnittenen 10 µL Mikropipette Spitze.</li>
	<li>Beschriften Sie den Objektträger für Probenidentifikation. Zwei bis drei Proben können auf jeder Folie zubereitet werden. Legen Sie die Folie, auf der Bank in der Nähe der Heizblock mit erwärmten Gel. Schneiden Sie die Spitzen der drei bis fünf 20 µL geringe Bindung Mikropipette Tipps pro Probe mit einer Rasierklinge oder Schere. Laden Sie zwei P20 Mikropipetten mit geschnittenen Tipps zum schnellen Wechsel von einem zum anderen ermöglichen.</li>
	<li>Mit der ersten mikropipette, 15-20 µL warme Gel fügen Sie das Inselchen/Perlen Microfuge Rohr hinzu; sofort zu mischen, Luftblasen zu vermeiden; und übernehmen Sie die flüssigen Agar/Inseln/Perlen-Mischung auf die Folie zu bilden ein < 1 cm Durchmesser Scheibe. Legen Sie die Disk am Rand der Folie, so dass Platz für den äußeren Gel-Ring (nächster Schritt). Tippen Sie auf die Folie vorsichtig ein paar Mal um zu den kleinen Inseln und Perlen zu begleichen.</li>
	<li>Fügen Sie mithilfe einer zweiten Mikropipette 20 µL warme Gel in das Probenröhrchen. Mit der ersten mikropipette, Mischung neue Gel mit alle verbleibenden Inseln/Perlen, wieder in den Heizblock Erwärmung, wenn es beginnt zu festigen, dann wenden Sie diese Mischung auf die Folie, um die original-CD. Wiederholen Sie bei Bedarf mit zusätzlichen vorgeschnittenen Tipps, bis die Disc die gewünschte Größe und Dicke ist. Hinweis: Handhabung der gelierten Disc ist einfacher, wenn der äußere Ring etwas dicker ist. 3 x 20 µL Gel ist in der Regel ausreichend. Dieser Schritt minimiert Verlust von kleinen Inseln durch Rohr Waschungen und fügt Insel-Armen Agarose an der Außenseite der Scheibe Scheibe Handhabung zu erleichtern.</li>
	<li>Bereiten Sie jede Scheibe einzeln und verfolgen Sie vorsichtig beispielauftrag wenn mehrere Disks auf jeder Folie zu platzieren.</li>
	<li>Legen Sie die Folien auf einer ebenen Fläche von nassem Eis, mit einem Deckel für 10 Minuten oder bis das Gel verfestigt sich. Es ist schwieriger, die Disc aus dem Glas zu schieben, wenn es trocknet.</li>
	<li>Label-Biopsie Verarbeitung/Einbettung Gewebe Kassetten mit Bleistift, eine pro Probe. Trocknen Sie die Rückseite der Folie zu vermeiden, das blaue Papier anfeuchten.</li>
	<li>Mit der stumpfen Kante einer Rasierklinge, schieben Sie die Disc in jede Richtung aus dem Glas zu befreien. Wenn es leicht gleitet, drücken Sie die Scheibe langsam aus den Mikroskop-Objektträger auf dem blauen Tissue-Papier. Legen Sie die Diskette, die flache Seite nach unten direkt auf dem Papier.</li>
	<li>Falten Sie die Scheibe flach halten, das Papier um die Scheibe zu Bewegung zu verhindern, legen Sie die Disk in gefaltetes Papier in der Kassette und schließen die Kassette. Wenn die Disc aus dem Glas nicht sauber schieben, fügen mehr Gel bzw. die Folie, um für ein paar Minuten Eis zurück.</li>
	<li>Tauchen Sie die Kassette mit PBS-Puffer in einen Becher füllen. Prozess für Paraffin einbetten am selben Tag für optimale Morphologie.</li>
</ol>(4) Paraffin einbetten
Hinweis: Prozess Scheiben das Inselchen Gel, Paraffin-Blöcke mit einer abgekürzten Dehydrierung Serie wie unten beschrieben. Diese Technik wurde durch eine automatisierte Prozessor optimiert, aber manueller Bearbeitung sollten ähnliche Ergebnisse produzieren.
<ol><li>Tauchen Sie Kassetten in 85 % Ethanol, 15 Minuten lang.</li>
	<li>Tauchen Sie Kassetten in 95 % igem Ethanol für 15 Minuten.</li>
	<li>Tauchen Sie Kassetten in 100 % igem Ethanol für 15 Minuten. Wiederholen Sie zweimal für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.</li>
	<li>Tauchen Sie Kassetten in Xylol für 15 Minuten. Wiederholen Sie zweimal für eine Gesamtmenge von drei Wäschen.</li>
	<li>Tauchen Sie Kassetten in geschmolzenem Paraffin für 10 Minuten.</li>
	<li>Transfer-Kassetten zum frisch geschmolzenem Paraffin für 10-30 Minuten.</li>
	<li>Vorsichtig öffnen der Kassette und packen Sie das Blaubuch. Entfernen Sie die Gel-Disc, die flache Oberfläche, die entgegengesetzt war auf dem Papier Überblick zu behalten. Die Scheibe in eine kleine Form mit (Insel-haltigen) Fläche nach unten, Parallel zu der Schnittfläche einbetten. Für den Stecker vorsichtig aus der Kassette herausnehmen und in eine kleine Form mit der Spitze in Richtung der Schnittfläche einbetten.</li>
</ol>(5) Paraffin-Schnitt und Färbung
<ol><li>Beschriften Sie Dias nacheinander, wenn Schnittserien erforderlich sind.</li>
	<li>Haben Sie 5 µm Paraffin Abschnitte durch eine erfahrene histotechnikers geschnitten. Um den Ertrag zu maximieren, speichern Sie alle Abschnitte, die Material enthalten. Im allgemeinen ermöglicht sammeln 20 Abschnitte Erfassung von die meisten des Materials.</li>
	<li>Lagern Sie Abschnitten bei Raumtemperatur. Abschnitte sind Routine histologischen Flecke (z. B. H & E) und Immunfluoreszenz (z. B. Insulin, Glukagon und DAPI) zugänglich. Fixierung für andere Antigene, bei Bedarf zu optimieren.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+architecture%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
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<li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li>
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<li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Induces+Mouse+%CE%B2-Cell+Proliferation+via+IRS2%2C+MTOR%2C+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li>
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<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li>
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<li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+cell+block+processing%3A+The+Cell-Gel+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li>
<li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+infusion+in+mice%3A+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li>
<li>Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://iidp.coh.org/">http://iidp.coh.org/</a> (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Diese modifizierte Gel-Disk-basierte Einbettungs-Methode bietet eine einfache, kostengünstige, und effiziente Möglichkeit, eine hohe Ausbeute an Inseln pro Abschnitt zu generieren. Bau der Gel-Disc auf einer flachen Glasoberfläche erleichtert Verbreitung Inselchen in eine gleichmäßige Verteilung über einen klar definierten Bereich. Verbreitung der Inseln in eine flache Scheibe bietet den Vorteil, setzen viele Inselchen in der Ebene des Abschnitts, Ertrag zu optimieren und damit weniger Inselchen verwendet werden. D...

Pankreas Langerhans-Inseln, die einzige Quelle des zirkulierenden Insulin, sind eine kritische Gewebe für Ermittler Diabetes Mellitus zu studieren. Aus jedem gegebenen Organismus haben Inselchen variabler Größe, Zelle Art Frequenz und Architektur1,2,3. Die konventionelle Strategie in Vivo Struktur und Zusammensetzung der endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse Inselchen zu studieren ist durch Pankreas Gewebe4,5-Schnitt. Da Inseln nur einen kleinen Bruchteil des Pankreas zellulären Gesamtgehalt bestehen, sind Molekulare Studien auf isolierte Inseln durchgeführt. Ex-Vivo Inselchen Kultur Experimente testen ansprechen auf Nährstoffe, bieten gen Modulation (Transfektion, Transduktion) oder experimentelle Behandlungen wichtige Einblicke in Mechanismen moduliert endokrine Zelle überleben, Verbreitung und Funktion 5 , 6.
Ex-Vivo Inselchen Experimente sind oft mit molekularen Studien der ganzen Inseln oder histologische oder Molekulare Studien der dispergierten Inselzellen gewachsen in monomolekularen Film5,6analysiert. Molekulare Analyse der ganzen Inseln führt die schwere Einschränkung der mehrfache Zelltypen, die falsch-negativen oder falsch-positiven Ergebnissen auf jede einzelne Zelle Art hochgerechnet führen kann. Zelle Dispersion auf Deckgläsern für Post-Kultur-Mikroskopie ermöglicht Handy-Typ-spezifische Ergebnis Messung, aber stört Inselchen Architektur, die Reaktion auf Intervention verändern kann und Identifizierung von architekturbezogenen Ergebnisse ausschließt. Darüber hinaus kann in der Regel nur ein einziges Ergebnis gemessen werden; zum Beispiel um Beta-Zell-Proliferation und Beta-Zelltod unter den gleichen Bedingungen zu messen, müssen zwei separate Experimente durchgeführt werden. Diese Ansätze sind auch blind für Inter Inselchen Variabilität, eine Fläche von zunehmendes Interesse im Bereich. Sortier Inselzellen durch Durchflusszytometrie für Zelle-Typ-spezifischen molekularen Studien oder einzellige RNA Studien sind elegant, aber teuer, zeitaufwändig, begrenzt durch Gewebe Fülle, Beseitigung von Architektur und nicht gut geeignet, um routinemäßige Zelle Kulturanalysen 5 , 7. konfokale Bildgebung des gesamten-Mount Immunostained Inselchen bietet qualitativ hochwertige Daten intakt-Architektur, aber ist sehr arbeitsintensiv, und von jeder Probe gewonnene Daten beschränkt sich auf Ergebnisse in einem einzigen Immunostaining8erkennbar.
Die Möglichkeit, qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des Post-Kultur ganze Inseln erzeugen würden viele dieser Bedenken ansprechen. Hohen Kosten, niedrig-Fülle Inselchen Gewebe von einzigartigen genetischen Modellen oder von menschlichen Organspendern oder Inselchen Status Post in Vivo oder in Vitro experimentelle Manipulation, sind kostbar. Erhalten mehrere Paraffin Abschnitte von den gleichen Inseln könnten mehrere Typ-zellspezifische intakt-Architektur Analysen aus dem gleichen Experiment.
Bestehende Techniken an Insel-Pellets für Schnitt erzeugen sind unvollkommen. Histologie-optimierte Agarose ist eine wässrige niedrigen Schmelzpunkt-Gel, die weit verbreitet ist in der Verarbeitung von histologischer und zytologischen Proben einschließlich fragmentierte oder kleine Gewebeproben, die schwer zu Prozess-9. Ein Inselchen Einbettung Ansatz ist, unterbrechen die Inselchen in Agarose in einem Microcentrifuge Schlauch, Zentrifugieren pellet-das Material, Abrufen des Agar-Steckers dann verarbeiten und embed für10,11-Schnitt. Extrahieren von verfestigten Probe von der Unterseite des Rohres ist zeitaufwändig und schwierig, was zu gelegentlichen Fragmentierung der Probe und Verletzungsgefahr. Die Inseln sind in der Spitze des Steckers, führt zu unzureichenden Inselchen Verteilung in Abschnitten, die von dieser Methode erhalten konzentriert. Der Runde Unterseite des Steckers erschwert einbetten, so dass eine kleine Insel-Armen Region für Schnitt dargestellt wird. Insgesamt führt diese Methode zu geringe Ausbeute und aufgehäuften Inselchen Verteilung in den sich daraus ergebenden Abschnitten.
Diese neue Methode ist eine vereinfachte und verbesserte Ansatz für die Vorbereitung der Insel Abschnitte. Inselchen sind konzentriert in einem kleinen Volumen und dann auf die glatte Oberfläche des einen Objektträger, eine kleine Scheibe mit den kleinen Inseln in einer Ebene zu bilden. Die Histogel-Insel-Scheibe ist für Paraffin, die Einbettung in eine verkürzte Dehydrierung und Xylol Infiltration Protokoll verarbeitet. Der bisherige Ansatz, der die Inseln in der Unterseite eines Microfuge Rohres konzentriert, wird auch als Vergleich durchgeführt. Diese neue Technik verbessert die Ausbeute an Inseln pro Abschnitt, die Aufteilung der Inseln in den einzelnen Abschnitten und nimmt weniger Zeit, die Insel-Blöcke auf Kassetten zu übertragen. Diese Technik eignet sich für kleine Insel Biologen oder andere Wissenschaftler studieren kleine Stücke des Gewebes, die Produktivität zu maximieren wollen verwenden eines Low-Fülle Gewebes durch die Messung mehrere Ergebnisse für ein einzelnes Sample in seiner nativen Gewebearchitektur.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf tube</td><td>Norgen Bioteck Corp</td><td>P/N 10113&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ranin Classic Starter Kit</td><td>ShopRanin</td><td>17008708</td><td></td></tr><tr><td>Ranin ClassicPipette PR-2</td><td>ShopRanin</td><td>17008648</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (1000 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (200 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (20 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>Low Binding Tip (10 &amp;mu;L)</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin solution</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Heatblock</td><td>VWR</td><td>949312</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>Agarose blue beads- Affi-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing cassette</td><td>Simport</td><td>M492-10</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Wraps</td><td>Leica-Surgipath</td><td>3801090</td><td></td></tr><tr><td>Citadel 2000 tissue processor</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>McCormick Scientific</td><td>39503002</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo-Shandon LLC</td><td>Finesse ME+</td><td></td></tr><tr><td>Insulin antibody</td><td>DAKO</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon antibody</td><td>Sigma</td><td>G2654</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td>A11076</td><td></td></tr><tr><td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td><td>Life technologies</td><td>A11001</td><td></td></tr></tbody></table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

Experimente mit isolierten pankreatischen kleinen Inseln sind wichtig für Diabetes-Forschung, aber Inselchen sind teuer und der begrenzten Fülle. Inselchen enthalten einer gemischten Zellpopulation in einer strukturierten Architektur, die Funktion auswirkt, und menschliche Inselchen sind weit verbreitet in Zelle Typ Zusammensetzung variabel. Aktuelle häufig verwendete Methoden der kultivierte Inselchen zu studieren zählen Molekulare Studien auf ganze Inseln, begehen disparaten Inselchen Zelltypen zusammen, oder Mikroskopie oder Molekulare Studien über verteilte Inselzellen Inselchen Architektur zu stören. Für in Vivo Inselchen Studien ist Paraffin-eingebetteten Pankreas-Schnitt eine leistungsfähige Technik zellspezifische Ergebnisse in der nativen Pankreas-Umgebung zu bewerten. Post-Kultur Inselchen von Paraffin-Schnitt studieren würde bieten mehrere Vorteile: Erkennung von mehrere Ergebnisse für gleichen Inselchen (möglicherweise sogar die exakt gleichen Inselchen, mit Schnittserien), Handy-Typ-spezifische Messungen und Erhaltung Eingeborener kleine Insel Zell-Zell und Zelle-Substrat Interaktionen während experimentelle Exposition und zur Analyse. Jedoch isoliert vorhandene Techniken für die Einbettung von Inselchen Post-Kultur sind ineffizient, zeitaufwändig, anfällig für Verlust von Material und in der Regel produzieren Abschnitte mit unzureichenden Inselchen Zahlen bis zur Quantifizierung der Ergebnisse nützlich sein. Klinische Pathologie Zelle Block Vorbereitung Laboreinrichtungen sind unzugänglich und unpraktisch für grundlegende Forschungslabors. Wir haben eine verbesserte und vereinfachte Benchtop-Methode entwickelt, die Abschnitte mit stabile Erträge und Verteilung der Inselchen generiert. Feste Inselchen sind Nukleinsäuretablette in warmen histologischen Agarosegel und pipettieren in eine flache Scheibe auf einer standard-Glas-Folie, so dass die kleinen Inseln in einer Ebene verteilt sind. Nach standard Dehydrierung und einbetten können mehrere (10 +) 4-5 µm Abschnitte aus dem gleichen Inselchen Block geschnitten werden. Mit dieser Methode können auf Maus, Ratte und menschlichen Inselchen histologische und immunofluorescent Analysen durchgeführt werden. Dies ist eine effektive, kostengünstige, zeitsparende Ansatz zur Zelle-typspezifischen, intakt-Architektur Resultate von den kultivierten Inseln zu beurteilen.

Eine illustrierte schematische Darstellung der Schritte zur Vorbereitung der Gel-Disc ist in Abbildung 1dargestellt. Dieses Gel Scheibe Methodenergebnisse in Paraffin-Abschnitte, die eine ausreichende Anzahl von Inseln verteilt in einer Ebene um sinnvolle Quantifizierung der Ergebnisse enthalten. Abbildung 2 zeigt niedrige Vergrößerung Bilder der daraus resultierenden Abschnitte um die Anzahl der Inseln erfasst pro Abschnitt zu...

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Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Ex-Vivo pancreatic Islet Studien sind wichtig für Diabetes-Forschung. Bestehende Techniken an kultivierte Inselchen in ihrer Muttersprache 3-dimensionale Architektur zu studieren sind zeitaufwendig, ineffizient und selten verwendete. Diese Arbeit beschreibt eine neue, einfache und effiziente Methode zur Erzeugung von qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des gesamten kultivierten Inselchen.

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

pancreatic-islet-embedding-for-paraffin-sections

Research

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Biology

12.7K Aufrufe.  UMass Medical School. Ex-Vivo pancreatic Islet Studien sind wichtig für Diabetes-Forschung. Bestehende Techniken an kultivierte Inselchen in ihrer Muttersprache 3-dimensionale Architektur zu studieren sind zeitaufwendig, ineffizient und selten verwendete. Diese Arbeit beschreibt eine neue, einfache und effiziente Methode zur Erzeugung von qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des gesamten kultivierten Inselchen.

Serie: Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

Sammlung Protokoll zur menschlichen Pankreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Forschung

Medizin

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Entwicklungsbiologie

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

Hochauflösende 3D Bildgebung des menschlichen Bauchspeicheldrüse Neuro-insularen Netzwerks

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

Biotechnik

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial companies have devised complex section transfer systems using fluid water. To simplify this technology, we created a simple method using homemade equipment that combines cutting and floating within a simple thermostatic chamber; therefore, the sections automatically enter the water bath on the water surface. The hippocampus from adult mouse brains, adult mouse kidneys, embryonic mouse brains, and adult zebrafish eyes were cut using both conventional paraffin sectioning and the presented method for comparison. Statistical analysis shows that our improved method saved time and produced higher quality sections. In addition, paraffin sectioning of a whole specimen in a short time is easy for junior operators.

Here, we present a protocol to improve paraffin sectioning. This method combines cutting and floating using a simple thermostatic chamber to avoid the transfer process required by the conventional method. As a result, the efficiency and the number of intact paraffin sections were greatly improved.

Das Schneiden und schwimmende Methode für Paraffin-eingebetteten Gewebe für Schneiden

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

Neurowissenschaften

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunologie und Infektion

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

Induktion einer Pankreasschädigung bei Mäusen durch intraperitoneale Medikamenteninjektion

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological changes associated with SAP using animal models can aid in identifying potential therapeutic targets and exploring novel treatment approaches. Previous studies primarily induced pancreatic injury through retrograde bile duct injection of sodium taviaurocholate, but the impact of surgical damage on the quality of the animal model remains unclear. In this study, we employed various frequencies of intraperitoneal Caerulein injections combined with different doses of LPS to induce pancreatic injury in C57BL/6J mice and compared the extent of injury across five intraperitoneal injection protocols. Regarding inducing acute pancreatitis in mice, an intraperitoneal injection protocol is proposed that results in a mortality rate as high as 80% within 5 days. Specifically, mice received ten daily intraperitoneal injections of Caerulein (50 &#181;g/kg), followed by an injection of LPS (15 mg/kg) one hour after the last Caerulein administration. By adjusting the frequency and dosage of injected medications, one can manipulate the severity of pancreatic injury effectively. This model exhibits strong controllability and has a short replication cycle, making it feasible for completion by a single researcher without requiring expensive equipment. It conveniently and accurately simulates key disease characteristics observed in human SAP while demonstrating a high degree of reproducibility.

Autor im Rampenlicht: Identifizierung der therapeutischen Ziele für die Entwicklung neuer Behandlungen für schwere akute Pankreatitis bei Mäusen

Intraperitoneal drug administration is a safe and effective non-invasive approach for inducing pancreatic injury. This study compared five distinct intraperitoneal injection protocols on mice to induce varying degrees of pancreatic injury and established a model of severe pancreatic injury to investigate the pathological changes and treatment strategies for severe acute pancreatitis (SAP).

Vorbereitung eines Mäusemodells für schwere akute Pankreatitis durch eine Kombination aus Caerulein und Lipopolysaccharid intraperitoneale Injektion

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Zusammenfassung

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Vorbereitung eines Mäusemodells für schwere akute Pankreatitis durch eine Kombination aus Caerulein und Lipopolysaccharid intraperitoneale Injektion