This work was funded by a grant from the National Institutes of Health (R15 AI117670) to B.M.S and P.J.W, as well as a Cottrell College Scholar Award from the Research Corporation (20185) to P.J.W. L.M.M. was supported by a Provost's Fellowship from CMU.

1. Expression und Reinigung von t Ret von E. coli Top10 HINWEIS: Bitte beachten Sie die Autoren Kontakt mit dem Tret-exprimierenden E. coli - Stamm zu verlangen (pBAD Tret - Plasmid, enthaltend das T. tenax tret - Gen unter der Kontrolle des AraC Protein, verwandelt in Top10 E. coli - 19) und die dazugehörige Materialübertragungsvereinbarung . Das folgende Protokoll gibt typischerweise eine Proteinausbeute von etwa 4 mg / L. <ol><li> Bereiten Sie eine 3 ml Übernachtkultur von Tret-exprimierenden E. coli. <ol><li> Streak Top10 E. coli , transformiert mit pBAD-Tret - Expressionsvektor auf einem LB-Medium (LB) Agarplatten enthaltend 100 ug / ml Ampicillin. </li><li> Inkubieren der Platte bei 37 ° C für etwa 48 Stunden. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte und Beimpfen von 3 ml LB-Flüssigmedium, enthaltend 100 ug / ml Ampicillin in einem Kulturröhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird in einem Schüttelinkubator bei 37 &amp; #176; C x über Nacht 175 Umdrehungen pro Minute. </li></ol></li><li> Induce Proteinexpression in Tret-exprimierenden E. coli. <ol><li> Hinzufügen 750 ml Terrific Broth mit 100 ug / ml Ampicillin zu einer 2.800 mL Fernbach-Kulturkolben ergänzt. 1 ml Brühe aus dem Kolben in eine Küvette für die spätere Verwendung als Rohling. </li><li> Fügen Sie die 3 ml über Nacht Kultur erzeugt in Schritt 1.1.4 an die Kulturflasche, dann wird der Kolben in einem Inkubator und schütteln bei 37 ° C x 200 Umdrehungen pro Minute. Prüfen Sie regelmäßig die Absorption der Kultur bei 600 nm im Vergleich zu dem Rohling in Schritt 1.2.1 gesammelt. </li><li> Sobald die Absorption bei 600 nm zwischen 0,5-1,0 erreicht, veran Tret-Expression durch Zugabe von 750 ul 1 M Arabinose-Lösung (1 mM Endkonzentration) zu der Kultur. Bringen Sie den Kolben in den Inkubator und schütteln über Nacht bei 37 ° C x 200 Umdrehungen pro Minute. </li></ol></li><li> Pellet und die t Ret-exprimierenden E. coli - Zellen zu lysieren. <ol><li> Übertragen, um die Kultur zu einem Polypropylen-bottle und zentrifugieren für 15 min bei 4000 × g bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und resuspendiere das Pellet in 15 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). </li><li> Übertragen die Zellsuspension in ein 50 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren für 15 min bei 4.000 × g bei 4 ° C. Überstand verwerfen und entweder gehen Lyse (Schritt 1.3.4) oder lagern Sie das Pellet auf unbestimmte Zeit bei -80 ° C zu Zelle. </li><li> Man löst 1 Protease - Inhibitor Minitablette in 20 ml Waschpuffer (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0) in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Übertragung der Protease-Inhibitor enthaltenden Waschpuffer zu dem konischen Rohr, das Pellet enthält. Vortexen, bis das Pellet resuspendiert. </li><li> Übertragen resuspendierten Zellen in ein 100 ml Becherglas gegeben und lysieren die Zellen durch Beschallung (Impulsfolge von 45 Sekunden, 45 Sekunden aus mit einer Laufzeit von 2 min und 15 Sekunden bei einer Amplitude von 75 Prozent). </li><li> Transfer des Lysats in ein 50 ml konisches Metallrohrund zentrifugieren für 60 min bei 15.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Klärung des Lysats durch Hindurchleiten durch einen 0,2-0,45 &amp; mgr; m-Spritzenfilter in ein konisches 50 ml-Röhrchen. HINWEIS: Die typische Konzentration von Lysat erhalten wird, 100 mg / mL. </li></ol></li><li> Reinige Tret aus E. coli Zelllysat unter Verwendung von Fast - Protein - Flüssigchromatographie (FPLC). <ol><li> Stellen Sie die FPLC mit einer Nickel-Affinitätssäule nach oben (5 ml Bettvolumen). Die Säule wird mit 10 ml entionisiertem Wasser oder bis die Kolonne sauber von Verunreinigungen. Äquilibrieren der Säule unter Verwendung von 20 ml Waschpuffer (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol, pH 8,0) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min. </li><li> Legen Sie das Lysat (20 ml), erhalten aus Schritt 1.3.8 auf die Säule und Eluieren unmarkierte Proteine ​​mit Waschpuffer bei einer Flussrate von 1 mL / min, bis die Extinktion Hintergrundwerte erreicht (typischerweise 80-100 ml Waschpuffer erforderlich) . </li><li> Eluieren His-markierte Tret durch einen linearen g unter Verwendung vonradient Elutionspuffer (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0) , 1 bis 100% über 60 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min. Sammeln Sie 4 ml-Fraktionen bis Tret eluiert wurde und die Absorption erreicht Basisniveau. HINWEIS: In der Regel werden 60 ml Elutionspuffer sind erforderlich, um das Protein zu eluieren, und das Protein eluiert im 60-100% Elutionspuffer Bereich. Etwa 10-15 ml reinem Tret in Elutionspuffer erhalten. </li><li> Bestimme die Konzentration von t Ret durch Extinktion bei 280 nm gegen einen Elutionspuffer blank messen. </li></ol></li><li> Austausch Tret in Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris) -Puffer durch Dialyse. <ol><li> Nach dem Dialyseschlauch Herstellung gemäß den Anweisungen des Herstellers, es prime durch Spülen mit deionisiertem Wasser und dann Tris-Puffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0). </li><li> Laden Sie die Tret Probe in den Dialyseschlauch mit einer Spritze und stumpfe Nadel. Dialysiere über Nacht eingainst 2 l Tris-Puffer. </li><li> Bestimme die Konzentration von t Ret durch Extinktion bei 280 nm gegen eine Blindprobe von der Dialyse Waschen gesammelt messen. </li><li> Übertragen Sie die Tret-Lösung zu einem 50 ml konischen Röhrchen und fahren Sie mit Trehalose analoge Synthese (Schritt 2) oder lagern Sie das Enzym bei 4 ° C. HINWEIS: Tret ist ein thermo Protein. Der Tret wurde in Tris-Puffer bei 4 ° C mehrere Monate gelagert, ohne signifikanten Aktivitätsverlust zu beobachten. </li></ol></li></ol> 2. Eine einstufige Synthese von Trehalose Analogues Verwendung Tret Enzyme HINWEIS: Das Protokoll unten beschreibt eine Reaktionsskala basierend auf 4 ml Volumen, das etwa 15 bis 30 mg Trehalose analog liefern kann je nach Reaktionseffizienz und das Molekulargewicht des Produkts. Die Reaktionskomponenten können skaliert werden, um mehr oder weniger Trehalose analog zu erhalten, falls gewünscht. <ol><li> Zugeben von Glukose Analogon (0,080 mmol, Masse wird von dem Molekulargewicht abhängen), UDP-Glucose (0.160 mmol, 97,6 mg) und MgCl 2 (0,080 mmol, 16,3 mg) in ein 15 ml konischen Röhrchen. Die Endkonzentrationen dieser Komponenten wird 20 mM, 40 mM und 20 mM betragen, respectively. </li><li> Hinzufügen Tret in Tris-Puffer (erhalten aus Schritt 1.5.4), und, falls erforderlich, ein geeignetes Volumen von Tris-Puffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0), um eine endgültige Enzymkonzentration von 300 &amp; mgr; g / mL und einem letzten zu erreichen Volumen von 4 mL. Pipettieren das Gemisch nach oben und unten sanft oder das Rohr invertieren die Feststoffe zu lösen. </li><li> Inkubieren der Reaktion bei 70 ° C mit bei 300 Upm für 1 Stunde Schütteln, dann das Reagenzglas auf Eis zu kühlen. </li></ol> 3. Reinigung von Trehalose-Analoga aus Roh-enzymatische Reaktionsgemisch <ol><li> Vorspülen eine Zentrifugal-Filtereinheit (Nennmolekulargewichtsgrenze (NWML) 10 kDa) durch Zugabe von 3 ml entionisiertem Wasser zu der Zentrifugenfiltereinheit und Zentrifugieren bei 3.000 xg trace Glycerin in der Membran zu entfernen, bis die gesamte Flüssigkeit durch den Filter passiertin das Rohr (ca. 20 min). Wiederholen Sie zwei weitere Male. Führen Sie diesen Schritt unmittelbar vor oder während der Reaktion (Schritt 2.3). </li><li> Nach dem Abkühlen der enzymatischen Reaktionsmischung (aus Schritt 2.3) erhaltenen, überträgt es auf die vorgespült Zentrifugalfiltereinheit. Spülen Sie das Reaktionsrohr mit 1 ml deionisiertem Wasser und Transfer zum Zentrifugalfiltereinheit. Wiederholen Spülen des Reaktionsrohres für eine maximale Rückgewinnung des Produkts. </li><li> Zentrifugieren der Zentrifugalfiltereinheit bei 3000 xg, bis die gesamte Flüssigkeit durch den Filter in das Rohr (ca. 20 min). Spülen Sie die obere Kammer des Zentrifugenfiltereinheit mit 3 mL entionisiertem Wasser und Zentrifuge bei 3000 xg, bis die gesamte Flüssigkeit den Filter in das Rohr durchläuft (ungefähr 20 min). Wiederholen Sie dies für eine maximale Rückgewinnung von Produkt zu spülen. </li><li> Entsorgen Sie die obere Kammer des Zentrifugenfiltereinheit. Hinzufügen Mischbett-Ionenaustauschharz (3 g) zu dem Filtrat am Boden des Röhrchens (typisch Filtrat volume ist 8-15 mL auf die Anzahl der Spülgänge abhängig). Rühre bei Raumtemperatur 1 Stunde lang mit einem magnetischen Rührstab mit einer Geschwindigkeit ausreichend, um die Harzkügelchen in der Lösung suspendiert zu halten. </li><li> Dekantiert den Überstand und filtern sie das Harz zu entfernen. 5 ml entionisiertes Wasser, um das restliche Harz zu spülen. Dekantiert den Überstand und filtern sie es mit der Produktlösung aus der ersten Dekantierung kombiniert. Wiederholen Spülen des Harzes für eine maximale Rückgewinnung des Produkts. </li><li> Analyse der Reaktion durch Dünnschichtchromatographie (TLC) oder HPLC, um zu bestimmen, ob eine vollständige Umwandlung des Glucoseanalogausgangsmaterial zur Trehalose analogen Produkt erzielt wurde. Siehe Schritt 4.1 für DC-Analyse und Schritt 4.2 für die HPLC-Analyse. </li><li> Entfernung von Wasser durch Gefriertrocknung oder Rotationsverdampfung des getrockneten Produkts. Wenn kein nicht umgesetzten Glucoseanalog während TLC oder HPLC-Analyse, Reinigung durch Chromatographie beobachtet wurde, ist nicht erforderlich. Wiegen Sie das Produkt der Reaktion yie zu erhaltenld und führen Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie-Analyse (Schritt 4.3) Produktstruktur und Reinheit zu bestätigen. </li><li> Wenn nicht umgesetzten Glucose-Analogon während die DC-Analyse beobachtet wurde, trennen es vom Trehalose-Analogon mit einer Größenausschluss-Spalte. <ol><li> Bereiten Sie eine 1 x 100 cm Säule mit entsalztem Wasser gesättigt, extrafein P2 Polyacrylamid Wulstgröße Ausschluss Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die Größenausschluss-Säule kann nach dem Waschen mit deionisiertem Wasser wiederverwendet werden. </li><li> Wieder aufzulösen das getrocknete enzymatische Reaktionsprodukt (erhalten aus Schritt 3.7) in 0,5 ml entionisiertem Wasser. Tragen Sie die Produktlösung auf die Größenausschlusssäule manuell oder durch einen Säulenfluss-Adapter. Spülen Sie das Fläschchen, die das Rohprodukt mit weiteren 0,5 ml entsalztes Wasser enthalten ist, und laden Sie es in die Größenausschlusssäule. </li><li> Eluieren das Produkt mit entionisiertem Wasser durch Schwerkraftfluss und sammeln Fraktionen von ca. 2 mL Volumen. </li><li> Analysieren Sie die Fraktionen durch TLC (Schritt 4.1). Pool der Fraktionen, die reines Trehalose-Analogon. </li><li> Entfernung von Wasser durch Gefriertrocknung oder Rotationsverdampfung des getrockneten Produkts. Wiegen Sie das Produkt die Reaktionsausbeute und gehen Sie auf die NMR-Analyse zu erhalten (siehe Schritt 4.3). </li></ol></li></ol> 4. Analyse von Trehalose Analoge Produkte <ol><li> Führen Sie Dünnschichtchromatographie (TLC) Analyse von Tret - Reaktion. Hinweis: Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um Grßenausschlusssäule Fraktionen zu analysieren. Es kann notwendig sein, die Reaktionsmischung oder Säulenfraktionen vor der TLC-Analyse zu konzentrieren Verbindung Färbung auf der DC-Platte zu beobachten. <ol><li> Mark Spuren auf der Oberfläche DC-Platte mit einem Bleistift und anwenden Analyt (en) und relevanten Norm (en) auf die entsprechenden Spuren, einschließlich der Glucoseanalog Standard, der Trehalose analogen Standard (falls vorhanden), dem Reaktionsgemisch (oder Fraktionen gesammelt aus Größe exclusion Säulenreinigung), und ein Co-Spot. jede Probe auf die DC-Platte Nach dem Auftragen kann der Platte zu trocknen. HINWEIS: Bei Reaktionsanalyse, typischerweise 2 &amp; mgr; l der Probe auf die DC-Platte aufgebracht wird. </li><li> Entwickeln Sie die DC - Platte unter Verwendung von n - Butanol / Ethanol / VE - Wasser (5: 3: 2). </li><li> Trocknen Sie die entwickelte DC - Platte, dann tauchen sie in 5% H 2 SO 4 in Ethanol (Zucker - Färbung) und Hitze auf einer heißen Platte auf hohe Einstellung , bis zuckerhaltigen Flecken können ( in der Regel 5 min) sichtbar gemacht werden. </li></ol></li><li> Führen HPLC - Analyse von Tret Reaktionsgemische unter Verwendung einer beliebigen HPLC System, das zur Trennung und Detektion Kohlenhydrate. Dieses Protokoll beinhaltet Kohlenhydrat Trennung eine aminopropyl - HPLC - Säule und Detektion unter Verwendung von Brechungsindex verwendet wird . <ol><li> Bringen Sie Aminopropyl-Säule (4,6 x 250 mm) mit einer Vorsäule Guard zur HPLC enthält. </li><li> Aminopropyl-Säule mit 80% Acetonitril in deionisiertem Wasser mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,4 äquilibrierenml / min. </li><li> Laden Sie die Lösung des Reaktionsprodukts (oder Standard) auf die aminopropyl Spalte. </li><li> Eluieren des Produkts (oder Standard) mit 80% Acetonitril in deionisiertem Wasser mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,4 ml / min und einer Säulentemperatur von 50 ° C. Üblicherweise werden die Laufzeit beträgt 40 min. HINWEIS: Sowohl die Glucoseanalogausgangsmaterial und die Trehalose analogen Produkt kann durch Brechungsindex nachgewiesen werden, obwohl andere Verfahren wie beispielsweise Verdampfungslichtstreuungsdetektion (ELSD) verwendet werden könnten. Unter Verwendung der beschriebenen Bedingungen, Glucose-Analoga typischerweise eluieren zwischen 10-15 Minuten und Trehalose Analoga zwischen 15-25 min eluieren. </li></ol></li><li> NMR - Analyse des gereinigten Trehalose Analoga. <ol><li> Man löst gereinigte Trehalose - Analogon in D 2 O (700 &amp; mgr; l) und die Lösung in einem NMR - Röhrchen. </li><li> Erwerben 1 H und 13 C NMR - Spektren gemäß entsprechenden NMR Anlage Protokollen. </li></ol></li></ol><ol><li> Synthesize, zu reinigen und zu verwalten , 6-TreAz auf M. smegmatis (Msmeg). <ol><li> Liste 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-Glucose (0,040 mmol, 24,4 mg) und MgCl 2 (0,020 mmol, 4,1 mg) in ein 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Hinzufügen Tret in Tris-Puffer (erhalten aus Schritt 1.5.4) eine endgültige Enzymkonzentration von 300 &amp; mgr; g / ml und einem Endvolumen von 1 ml zu erreichen. Pipettieren das Gemisch nach oben und unten sanft oder das Rohr invertieren die Feststoffe zu lösen. </li><li> Inkubieren der Reaktion bei 70 ° C mit 15 min schütteln. </li><li> Verdünne die enzymatische Reaktionsmischung mit 3 ml entionisiertem Wasser und überträgt es auf einen vorgewaschenen Zentrifugalfiltereinheit (NMWL 10 kDa). Zentrifugieren der Filtereinheit bei 3.000 xg bis der größte Teil der Flüssigkeit durch den Filter in das Rohr, etwa 10 min. </li><li> Verwerfen the obere Kammer des Zentrifugenfiltereinheit. Hinzufügen Mischbett-Ionenaustauscher-Harz (0,75 g) in das Röhrchen und umrühren / schütteln bei Raumtemperatur für 25 min. Dekantiert den Überstand und filtern sie das Harz zu entfernen. Hinweis: Die Schritte 5.1.1-5.1.5 liefern eine wässrige Lösung von 6-Azido-Trehalose (6-TreAz) bei etwa 5 mM Konzentration in weniger als 1 Stunde. Die 5 mM-Konzentration wird basierend auf der quantitativen Umwandlung von Substrat zu Produkt und dem Verdünnungs geschätzt, dass Orte während der Reinigungsschritte erfolgt unter der Annahme, minimalen Verlust an Produkt während dieser Schritte. Die Lösung kann steril filtrierten vor der Zugabe zu einer biologischen Probe sein, falls gewünscht. </li><li> Füge das entsprechende Volumen von 6-TreAz Produktlösung zu einer log-Phasen - Kultur von M. smegmatis (Msmeg), typischerweise eine endgültige Kulturvolumen von 100-1000 &amp; mgr; l zu erreichen , und eine endgültige 6-TreAz Konzentration von ~ 25 uM. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C für die gewünschte Zeitdauer, in der Regel 60 min. </li></ol></li><li> Führen Chemie klicken , um ein Fluorophor an Azid-markierte Zellen zu konjugieren. In diesem Protokoll verwenden , Cu-katalysierte Azid-Alkin - Cycloaddition (CuAAC) ein Fluorophor an Zelloberflächen Aziden in Msmeg zu liefern. <ol><li> Zentrifugieren der Zellen bei 3.900 × g für 5 min und anschließend Waschen der Zellen mit PBS 0,5% Rinderserumalbumin enthält. Wiederholen Sie zweimal. </li><li> Re-suspend die pelletierten Zellen in 4% para-Formaldehyd in PBS, sie zu beheben. Nach Inkubation für 10 min, wiederholen Sie Schritt 5.2.1 um die Zellen zu waschen. </li><li> Re-suspend pelletierten Zellen in 138 &amp; mgr; l PBS. </li><li> In 3 ul einer 1 mM Stammlösung von Alkin-Carboxyrhodamin 110 (Alkin-488) in DMSO. </li><li> Werden 3 &amp; mgr; l einer frisch hergestellten 60 mM Stammlösung von Natriumascorbat in deionisiertem Wasser. </li><li> Werden 3 ul einer 6,4 mM Stammlösung von Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (TBTA) in tert - Butanol / Dimethylsulfoxid (DMSO) 4: 1. </li><li> In 3 &amp; #956; l einer 50 mM Stammlösung von CuSO 4 in entmineralisiertem Wasser. </li><li> Pipettieren die Suspension bis Zelle und ab, dann für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.2.1, um die Zellen zu waschen. Wieder die Zellen in 150 &amp; mgr; l PBS. </li></ol></li><li> Führen zelluläre Fluoreszenzanalyse. In diesem Protokoll verwenden , Fluoreszenzmikroskopie zelluläre Fluoreszenz von markiertem Msmeg zu visualisieren. <ol><li> In 10 ul bakterieller in PBS suspendierten Zellen auf einen Objektträger und leicht die Flüssigkeit in einer dünnen Schicht ausgebreitet den Rand eines Deck verwenden. Lassen Sie im Dunkeln an der Luft trocknen. </li><li> In 10 ul Eindeckmedium über die getrocknete Probe, dann legen Abdeckung gleitet über die Probe und den Klebstoff (zB Nagellack) zu immobilisieren. </li><li> Bild die Folien ein Fluoreszenzmikroskop bei 100-facher Vergrößerung verwendet wird. </li></ol></li></ol>

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Microbiol. 190, 355-369 (2008).</li><li>Urbanek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+of+trehalose+analogues:+rapid+access+to+chemical+probes+for+investigating+mycobacteria.">Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria.</a> ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+Huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Torn&#248;e, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(I)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li><li>Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose-recycling+ABC+transporter+LpqY-SugA-SugB-SugC+is+essential+for+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Trehalose - Analoga haben das Potenzial , verschiedene Felder zu beeinflussen, von Konservierung von Lebensmitteln und Arzneimitteln zur Diagnose und Behandlung von mikrobiellen Infektionen 6. Bestehenden vielstufige chemische Syntheseverfahren sind nützlich für komplexe Trehalose Analoga mit mehreren Standorten Modifikations Herstellung (beispielsweise natürlich vorkommende komplexe mykobakterielle Glykolipide). Jedoch sind diese Verfahren immer langwierig und ineffizient, auch wenn ...

Trehalose ist ein symmetrisches nicht reduzierenden Disaccharid , bestehend aus zwei Glucose - Einheiten, die von einem 1,1-α, α-glycosidische Bindung (1A) verbunden sind. Während Trehalose von Menschen und anderen Säugetieren nicht vorhanden ist, ist es häufig in Bakterien, Pilzen, Pflanzen und wirbellosen Tieren 1 gefunden. Die primäre Rolle von Trehalose in den meisten Organismen ist gegen Umwelteinflüsse zu schützen, wie Austrocknungs 1. Darüber hinaus erfordern einige menschliche Pathogene Trehalose für die Virulenz, einschließlich der Tuberkulose verursachende Mycobacterium tuberculosis, die für den Bau von immunmodulatorischen Glycolipide 2 Trehalose als Mediator der Zellhülle Biosynthese und als Baustein verwendet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg" /> Abbildung 1: Trehalose Trehalose und Analoga. (A) Strukturen der natürlichen Trehalose und eine unnatürliche Trehalose-Analogon, wobei X eine strukturelle Modifikation ist. (B) Beispiele für Trehalose - Analoga in der Literatur berichtet , dass mögliche Anwendungen in Biokonservierung und bioimaging haben. Aufgrund seiner einzigartigen Struktur und physiologischen Funktionen hat Trehalose 3 große Aufmerksamkeit für den Einsatz in Bio (techno) logischer und biomedizinische Anwendungen gezogen. Die schützenden Eigenschaften von Trehalose beobachtet in natur- zB seine auffällige Fähigkeit in &quot;Auferstehung&quot; Pflanzen Leben erhalten zu helfen , die extreme Austrocknung 4 -Haben spornte seine umfangreichen Einsatz in Biokonservierung Anwendungen unterzogen wurden. Trehalose wurde 3 eine Vielzahl von biologischen Proben, wie Nukleinsäuren, Proteine, Zellen und Gewebe zu erhalten , verwendet. So wird beispielsweise Trehalose als Stabilisierungszusatz in einer Reihe von Arzneimitteln verwendet tHut auf dem Markt sind , darunter mehrere Anti-Krebs - monoklonalen Antikörpern 3. Wie gut, Trehalose als Süßstoff in der Lebensmittelindustrie verwendet werden, und es ausgiebig für Produktschutz sowohl in der Lebensmittel- und Kosmetikindustrie verwendet wird. Die Annahme von Trehalose für diese Arten von kommerziellen Anwendungen wurde zunächst durch die Unfähigkeit beschränkt auf größere Mengen von reinem Trehalose, die aus natürlichen Quellen oder durch Synthese erhalten. Jedoch hat ein effizientes enzymatisches Verfahren zur wirtschaftlichen Herstellung von Trehalose aus Stärke vor kurzem entwickelt worden, die ihre weit verbreitete kommerzielle Nutzung angespornt hat 5. Chemisch Derivate von Trehalose modifiziert, die hierin als Trehalose Analoga bezeichnet werden , gewonnen haben zunehmende Aufmerksamkeit für verschiedene Anwendungen (generische Struktur gezeigt in 1A; spezifische Beispiele für Trehalose - Analoga in 1B gezeigt) 6. Beispielsweise Lacto-Trehalose ist ein Trehalose-Analogon mit einem seiner Glucose-Einheiten mit Galactose ersetzt, wodurch seine 4-Stellung eine Hydroxylgruppe hat eine invertierte stereochemische Konfiguration. Lacto-Trehalose hat die gleichen Eigenschaften wie Stabilisierungs Trehalose ist jedoch beständig gegenüber Abbau durch Verdauungsenzyme, wodurch es attraktiv als nicht-kalorischen Lebensmittelzusatzstoff 6, 7. Unsere Gruppe Interesse an Trehalose-Analoga bezieht sich in erster Linie auf ihren Wert als Mykobakterien-spezifischen Sonden und Inhibitoren. Die Barry und Davis Gruppen entwickelten ein Fluorescein-konjugiertes keto-Trehalose - Analogon, genannt FITC-keto-Trehalose, die metabolisch gezeigt wurde , die Zellwand von lebenden M. tuberculosis beschriften, so dass seine Detektion durch Fluoreszenzmikroskopie 8. Das Bertozzi Labor entwickelte kleinere Azido-Trehalose (TreAz) Analoga, die metabolisch die Zellwand bezeichnen könnte und anschließend det seinektiert mit Klick - Chemie und Fluoreszenzanalyse 9. Diese Fortschritte weisen auf die Möglichkeit der Verwendung von Trehalose-basierten Sonden als diagnostische Bildgebungsmittel für Tuberkulose. Trehalose - Analoga wurden auch als Inhibitoren von M. tuberculosis aufgrund ihres Potentials zu stören Wege in dem Bakterium verfolgt worden , die mit 10 für die Lebensfähigkeit und Virulenz wesentlich sind, 11, 12. Bisher ist das Haupthindernis für Trehalose-Analoga bio (Techno) logisch und biomedizinische Anwendungen zu entwickeln, ist der Mangel an effizienten Synthesemethoden. Die beiden traditionellen Routen zu produzieren Trehalose - Analoga verlassen sich auf die chemische Synthese (Abbildung 2). Ein Weg beinhaltet Desymmetrisierung / Modifizierung von natürlichen Trehalose, während die andere beinhaltet mit geeignet funktionalisierten Monosaccharid-Bausteine ​​Starten und Durchführen der chemischen Glykosylierungschmieden, um die 1,1-α, α-Glykosid-Bindung. Diese Ansätze, die vor kurzem in Übersichtsartikeln diskutiert 13, 14, haben sich als nützlich erwiesen , für die Erfüllung mehrstufige Synthese kleiner Mengen komplexer Trehalose haltige Naturprodukte, wie Sulfolipids-1 von M. tuberculosis 15. Allerdings sind beide Ansätze im allgemeinen ineffizient, zeitaufwendig, unzugänglich nicht-Chemiker, und zusätzlich werden nicht als umweltfreundlich angesehen. So sind bestimmte Arten von Trehalose-Analoga zu synthetisieren, sind diese Strategien nicht ideal. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg" /> Abbildung 2: Ansätze zur Trehalose analoge Synthese. Chemische Ansätze zur Trehalose analoge Synthese, auf der linken Seite gezeigt, verwenden mehrstufige Verfahren, die schwer protec beinhaltention / Entschützen Desymmetrisierungen und / oder Glykosylierungsschritte. Die enzymatische Synthese, auf der rechten Seite gezeigt, verwendet Enzym (en) zu konvertieren stereoselektiv einfache, ungeschützte Substrate Analoga in wässriger Lösung zu Trehalose. Die enzymatische Protokoll berichtet hierin verwendet eine Trehalose-Synthase (t Ret) Enzym Glucose-Analoga und UDP-Glucose in Trehalose-Analoga in einem einzigen Schritt zu konvertieren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Eine effiziente biokatalytische Route zu Trehalose-Analoga würde die Produktion, Auswertung und Anwendung dieser vielversprechenden Klasse von Molekülen ermöglichen. Während die kommerzielle enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Trehalose 5 bis Synthetisieren Analoga nicht anpassungsfähig ist , weil es Stärke als Substrat nutzt, gibt es andere biosynthetische WegWege in der Natur, die für Trehalose analoge Synthese ausgenutzt werden kann. Die Forschung in diesem Bereich, die vor kurzem 6 überprüft wurde, begrenzt. Ein Bericht über ein Verfahren , durch das coli Trehalose Biosyntheseweg Escherichia inspiriert eine einzige Fluor-Trehalose zuzugreifen analog aus den entsprechenden Fluor-Glucose. Allerdings erfordert dieser Ansatz ein Drei-Enzym - System , das die Effizienz und Allgemeinheit 8 begrenzt ist. Ein weiterer Ansatz, der untersucht worden ist , ist zu Trehalose - Phosphorylase (TREp) in der umgekehrten Richtung zu verwenden, die im Prinzip erlaubt die einstufige Synthese von Trehalose Analoga von Glucose - Analogen und Glucose-1-phosphat 6, 16, 17. Obwohl dieser Ansatz künftig Versprechen haben kann, beide Invertierung und Halte TREP noch Nachteile für analoge Synthese. Zum Beispiel haben invertierende TREP einen prohibitiv expensive Donatormolekül (β-D-Glucose-1-Phosphat) und Halte TREP schlechte Enzym Expressionsausbeuten / Stabilität und begrenzte Substratpromiskuität. Signifikante Verbesserungen (zB über Enzym - Engineering) werden vor dem Trep-vermittelte analoge Synthese benötigt werden , ist praktisch. Derzeit ist die praktischste Vorgehensweise für die enzymatische Synthese von Trehalose - Analoga ist eine Trehalose - Synthase (t Ret) Enzym zu verwenden, die Glucose umwandelt und Uridindiphosphat (UDP) -Glucose in Trehalose in einem einzigen Schritt 6. Wir berichteten vor kurzem die Verwendung von Thermoproteus tenax Tret-und einer thermostabilen Enzyms unidirektionale 18 -bis Trehalose Analoga von Glucose - Analoga und UDP-Glukose (Abbildung 3) 19 synthetisieren. Dieses Enzym wirkt nur in der synthetischen Richtung und vermeidet das Problem von Trehalose Abbau im Trep System nicht gefunden. Dieses einstufige Reaktions could in 1 Stunde abgeschlossen werden, und eine Vielzahl von Trehalose - Analoga wurden in hoher Ausbeute zugänglich aus leicht verfügbaren Glucoseanalog Substrate (siehe Tabelle 1 in den Repräsentative Ergebnisse (bis wie durch Hochleistungs - Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt&gt; 99%) Abschnitt). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg" /> Abbildung 3: t Ret-katalysierte Ein-Schritt - Synthese von Trehalose - Analoga. Der Tret - Enzym von T. tenax stereoselektiv beitreten leicht verfügbar Glukose - Analoga und UDP-Glucose Trehalose - Analoga in einem Schritt zu bilden. R 1 -R 4 = Variable strukturelle Modifikation, beispielsweise Azido-, Fluoro-, Deoxy-, Thio- stereochemischen oder Isotopenmarkierung Modifikationen; Y = variable Heteroatom, beispielsweise Sauerstoff oder Schwefel, oder isotopenmarkierten Heteroatom. Hier bieten wir adETAILLIERTE Protokoll für den Tret - Syntheseverfahren, einschließlich der Expression und Reinigung von t Ret von E. coli, optimierte Tret Reaktionsbedingungen und ein verbessertes Reinigungsverfahren , die vollständig in der wäßrigen Phase durchgeführt wird. Dieses modifizierte Protokoll ermöglicht die zweckmäßige und effiziente Synthese und Reinigung von Trehalose verschiedenen Analoga auf einer semi-präparativen Maßstab (10-100 mg). Wir zeigen auch die Verwendung dieses Protokolls für die Zubereitung und eine Trehalose-basierenden Sonde mit Mycobakterien in weniger als 1 Stunde verabreicht, die die schnelle Fluoreszenzdetektion von mykobakteriellen Zellen aktiviert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate,</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">S374</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base ultrapure</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing, MWCO 12&#8211;14,000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-152-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Glucose analogues</td>
			<td>CarboSynth,</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Examples of vendors that offer numerous glucose analogues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Aldrich,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MA02620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-Glucose</td>
			<td>abcam Biochemicals</td>
			<td>ab120384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>444-9999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-Fine Bio-Gel P2 media</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>150-4118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1056280001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AX0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide, 99.8%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>351430075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopropyl HPLC column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-formaldehyde</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyne-488</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>761621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern Biotechnology</td>
			<td>10001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid one-step enzymatic synthesis and all-aqueous purification of trehalose analogues

Chemisch-Versionen von Trehalose modifiziert oder Trehalose-Analoga, haben Anwendungen in der Biologie, Biotechnologie und der pharmazeutischen Wissenschaft, unter anderen Bereichen. Zum Beispiel haben Trehalose - Analoga Lager nachweisbar Tags verwendet worden Mycobacterium tuberculosis zu erkennen und können Anwendungen wie Tuberkulose diagnostische Bildgebungsmittel haben. Hydrolysestabile Versionen von Trehalose sind auch für die Verwendung als nicht-kalorische Süßstoffe und biologische Schutzmittel aufgrund ihres Potentials verfolgt. Trotz der Attraktivität dieser Klasse von Verbindungen für verschiedene Anwendungen, bleibt ihr Potenzial unerfüllt aufgrund des Fehlens eines robusten Weg zu ihrer Herstellung. Hier berichten wir ein detailliertes Protokoll für den schnellen und effizienten Ein-Schritt-biokatalytische Synthese von Trehalose-Analoga, die die Probleme im Zusammenhang mit der chemischen Synthese umgeht. Durch die Verwendung der thermo Trehalose - Synthase (Tret) Enzym aus Thermoproteus Tenax, Trehalose - Analoga können generat seined in einem einzigen Schritt aus Glucose-Analoga und Glucose Uridindiphosphat in hoher Ausbeute (bis zu Umsatz) in 15-60 min. Eine einfache und schnelle nicht-chromatographischen Reinigungsprotokoll, das von Spindialyse und Ionenaustausch besteht, können viele Trehalose Analoga bekannter Konzentration in wässriger Lösung in weniger als 45 min zu liefern. In Fällen, in denen nicht umgesetzten Glucoseanalog noch chromatographische Reinigung des Trehalose analogen Produkt verbleibt, kann durchgeführt werden. Insgesamt bietet dieses Verfahren eine &quot;grüne&quot; biokatalytische Plattform für die beschleunigte Synthese und Reinigung von Trehalose-Analoga, die auf nicht-Chemiker effizienter und leichter zugänglich ist. Um die Anwendbarkeit dieses Verfahrens veranschaulichen, beschreiben wir ein Protokoll für die Synthese, die alle wässrigen Reinigung und Verwaltung eines Trehalose-basierten Klick-Chemie-Sonde Mycobakterien, von denen alle dauerte weniger als 1 Stunde und ermöglicht Fluoreszenzdetektion von Mykobakterien. In Zukunft stellen wir uns, dass unter OTHer Anwendungen kann dieses Protokoll zur schnellen Synthese von Trehalose-basierte Sonden für Tuberkulose-Diagnostik eingesetzt werden. Zum Beispiel kurzlebigen Radionuklid-modifizierte Trehalose - Analoga (zB 18 F-modifizierte Trehalose) könnte für fortgeschrittene klinische Bildgebungsverfahren wie die Positronen - Emissions - Tomographie-Computertomographie (PET-CT) eingesetzt werden.

T. tenax Tret wurde aus E. coli in einer Ausbeute von etwa 4 mg / L unter Verwendung von Standard - Proteinexpression und Reinigungstechniken erhalten. Eine einzelne Nickel - Affinitätschromatographie Schritt war ausreichend Tret aus E. coli - Lysat (a repräsentativen FPLC trace gezeigt in 4) zu reinigen. Wie in unserer ersten Veröffentlichung auf dem Syntheseverfahren Tret gegründet, ist rekombinantes T. tenax Tret der Lage , eine...

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Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Schnelle Ein-Schritt-enzymatische Synthese und All-wässrige Reinigung von Trehalose Analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

rapid-one-step-enzymatic-synthesis-all-aqueous-purification-trehalose

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.3K Aufrufe.  Central Michigan University. Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Serie: Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Labormaßstab Herstellung und Reinigung eines therapeutischen Antikörpers

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Forschung

Biochemie

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

Schnelle Isolierung von Mitoribosome von HEK Zellen

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

Koffein-Extraktion, enzymatische Aktivität und Genexpression von Koffein-Synthase aus Anlage Zellsuspensionen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Ein anpassbarer Ansatz für die enzymatische Produktion und Reinigung von Diterpenoid Naturprodukten

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug targets. Yet, a major barrier to their characterization and exploitation in academic or industrial settings is that most biochemical, biophysical, and drug screening strategies require these proteins to be in a water-soluble state. Our laboratory recently developed the peptidisc, a membrane mimetic offering a &#8220;one-size-fits-all&#8221; approach to the problem of membrane protein solubility. We present here a streamlined protocol that combines protein purification and peptidisc reconstitution in a single chromatographic step. This workflow, termed PeptiQuick, allows for bypassing dialysis and incubation with polystyrene beads, thereby greatly reducing exposure to detergent, protein denaturation, and sample loss. When PeptiQuick is performed with biotinylated scaffolds, the preparation can be directly attached to streptavidin-coated surfaces. There is no need to biotinylate or modify the membrane protein target. PeptiQuick is showcased here with the membrane receptor FhuA and antimicrobial ligand colicin M, using biolayer interferometry to determine the precise kinetics of their interaction. It is concluded that PeptiQuick is a convenient way to prepare and analyze membrane protein-ligand interactions within one&#160;day in a detergent-free environment.

We present a method that combines membrane protein purification and reconstitution into peptidiscs in a single chromatographic step. Biotinylated scaffolds are used for direct surface attachment and measurement of protein-ligand interactions via biolayer interferometry.

PeptiQuick, ein Ein-Schritt-Einbindung von Membranproteinen in biotinylierte Peptidiscs für optimierte Proteinbindungstests

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...