This work was funded by a grant from the National Institutes of Health (R15 AI117670) to B.M.S and P.J.W, as well as a Cottrell College Scholar Award from the Research Corporation (20185) to P.J.W. L.M.M. was supported by a Provost's Fellowship from CMU.

Top10 E.coli&#39;den 1. Ekspresyonu ve Saflaştırılması tRet NOT: Tret-ifade eden E. coli suşu istemek için yazarları irtibata geçiniz ve beraberindeki malzeme transferi anlaşması (Top10 E. dönüştü AraC proteinin kontrolü altında T. tenax tret geni içeren, pBAD Tret plazmid 19 coli) . Aşağıdaki protokol, tipik olarak, yaklaşık 4 mg / L&#39;lik bir protein verimi verir. <ol><li> E. coli Tret ifade eden bir 3 mL gecede kültür hazırlayın. <ol><li> Bir lizojeni etsuyu (LB), 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden agar plaka üzerine pBAD-tRet ifade vektörü ile transforme edilen bir çizgi Top10 E.coli. </li><li> yaklaşık 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> plakadan tek bir koloni almak ve bir kültür tüpü içinde 100 ug / ml ampisilin içeren LB sıvı ortam 3 ml inoküle. </li><li> 37 &amp; # bir sallayarak inkübatör tüp yerleştirin176 C gecede 175 rpm x. </li></ol></li><li> E. coli tRet salgılayan protein ifadesini teşvik eder. <ol><li> Ekle 750 mL Terrific Broth 2.800 ml Fernbach kültürü şişesine 100 ug / ml ampisilin ile takviye edilmiştir. boş olarak, daha sonra kullanılmak üzere bir küvete şişeye transfer 1 ml suyu. </li><li> Kültür şişeye aşama 1.1.4 üretilen 3 ml gecelik kültürden ekleyin, sonra bir kuluçka içine yerleştirilir ve 37 ° C x 200 rpm&#39;de çalkalanır. Periyodik adım 1.2.1 toplanan boş karşı 600 nm kültürünün absorbansı kontrol edin. </li><li> 0.5-1.0 arasında ulaşan 600 nm&#39;de absorbans sonra, kültüre 1 M arabinoz çözeltisi (1 mM nihai konsantrasyon), 750 uL eklenmesiyle tRet ifadesini teşvik eder. inkübatör için şişeyi dönün ve x 200 rpm, 37 ° C&#39;de gece boyunca çalkalanır. </li></ol></li><li> Pelet tRet-ifade eden E. coli hücreleri lize edildi ve. <ol><li> Bir polipropilen b kültürü aktarınottle ve 4 ° C&#39;de 4000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüje tabi tutun. </li><li> Süpernatant atılır ve fosfat tamponlu tuz 15 mL (PBS) içinde pelet yeniden askıya. </li><li> 4 ° C&#39;de 4,000 x g&#39;de 15 dakika boyunca 50 ml konik bir tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın. Süpernatantı atın ve her iki lizis (adım 1.3.4) hücre veya -80 ° C&#39;de süresiz pelet saklamak için devam edin. </li><li> 50 ml konik bir tüp içinde, yıkama tamponu (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCI, 20 mM imidazol, pH 8.0) içinde 20 mL 1 proteaz inhibitörü, mini tablet içinde çözülür. </li><li> topaklarını içeren konik tüp proteaz inhibitörü ihtiva eden yıkama tamponu aktarın. pelet kadar Vorteks yeniden askıya alındı. </li><li> (Yüzde 75 bir amplitüd 2 dakika ve 15 saniyelik bir çalışma süresi ile kapalı, 45 saniye ile 45 saniye arasında puls dizisi) 100 ml beher yeniden süspansiyon haline hücreleri aktarın ve sonikasyon ile hücrelerin lize. </li><li> 50 ml metal konik tüp lizat aktarınve 4 ° C de 15,000 x g&#39;de 60 dakika boyunca santrifüje tabi tutun. </li><li> 50 ml konik bir tüp içine 0.2-0.45 um şırınga filtresinden geçirilerek lizat açıklık getirmektedir. Not: Elde edilen lizat, tipik konsantrasyonu 100 mg / mL olduğunu. </li></ol></li><li> Hızlı protein sıvı kromatografi (FPLC) kullanılarak E. coli hücre lizatından tRet saflaştınlır. <ol><li> Bir nikel afinite kolonuna (5 ml yatak hacmi) ile FPLC ayarlayın. iyonu giderilmiş su 10 mL ya da sütun, kirletici maddelerden arınmış kadar sütun yıkayın. Yıkama tamponu 20 mL kullanılarak kolon dengeye (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8.0), 1 mL / dakikalık bir akış hızında püskürtülür. </li><li> kolona aşama 1.3.8 elde edilen lizat (20 mL) yükleyin ve absorbans, arka plan seviyeleri ulaşıncaya kadar 1 ml / dk&#39;lık bir akış oranında yıkama tamponu ile etiketsiz proteinleri elüte (yıkama tamponu tipik olarak 80-100 ml gereklidir) . </li><li> Zehir doğrusal gramı kullanılarak tRet His-etiketli1 ml / dk&#39;lık bir akış hızında 60 dakika boyunca% 1-100 arasında elüsyon tamponu (50 mM NaH 2 PO 4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8.0) radient. Tret yıkanan ve absorbans temel seviyeye ulaşana kadar 4 mL kesirler toplayın. Not: Genellikle, elüsyon tamponu 60 ml protein elüt edilmesi için gerekli olan ve protein% 60-100 elüsyon tamponu aralığında elüt edilmektedir. Yaklaşık elüsyon tampon maddesi içinde saf tRet 10-15 ml elde edilir. </li><li> bir elüsyon tamponu boşluğa karşı 280 nm&#39;de absorbans ölçülerek tRet konsantrasyonunu belirler. </li></ol></li><li> Tris Değişim tRet diyaliz ile (hidroksimetil) aminometan (TRIS) tamponu. <ol><li> üreticinin talimatlarına göre diyaliz tüpüne hazırladıktan sonra, iyonu giderilmiş su ve sonra Tris tamponu (50 mM Tris, 300 mM NaCI, pH 8.0) ile durulama Asal. </li><li> Bir şırınga ve künt bir iğne kullanılarak diyaliz tüp içine Tret örnek yükleyin. gece boyunca diyalizTris tamponu 2 L aykırı. </li><li> Diyaliz yıkama toplanan bir boşluğa karşı 280 nm&#39;de absorbans ölçülerek tRet konsantrasyonunu belirler. </li><li> 50 ml konik tüp Tret çözüm aktarın ve trehaloz analog sentezi (adım 2) devam ya da 4 ° C&#39;de enzim saklayın. Not: tRet termostabil bir proteindir. TRet aktivitesinde belirgin bir kayıp uygulanmaksızın birkaç ay boyunca 4 ° C sıcaklıkta Tris tamponu içinde saklandı. </li></ol></li></ol> TRet enzim kullanılarak Trehaloz Analoglarının 2. tek aşamalı sentezi NOT: protokolü aşağıdaki reaksiyon verimliliği ve ürünün moleküler ağırlığına bağlı olarak trehaloz analoğunun yaklaşık 15-30 mg sağlayabilir 4 mL hacmine bağlı olarak bir reaksiyon ölçeği, tarif eder. reaksiyon bileşenleri istenirse daha fazla veya daha az trehaloz analog elde etmek için ölçeklenebilir. <ol><li> (0.080 mmol, kütle moleküler ağırlığına bağlıdır) glikoz analog ekleme, UDP-glikoz (0.15 ml konik bir tüp 160 mmol, 97.6 mg) ve (0.080 mmol MgCI2, 16.3 mg) eklenmiştir. Bu bileşenlerin son konsantrasyonları sırası ile 20 mM, 40 mM ve 20 mM olacaktır. </li><li> gerektiğinde Tris tamponu uygun bir hacmi (50 mM Tris, 300 mM NaCI, pH 8.0), 300 ug / ml ve son bir son enzim konsantrasyonu elde etmek için, (aşama 1.5.4 de elde edilmiş) Tris tamponu tRet ekleyin ve 4 mL hacim. Pipetleyin Karışım yukarı ve aşağı yavaşça veya katıların çözünmesi için tüp ters. </li><li> 1 saat süre ile 300 rpm&#39;de çalkalanarak 70 ° C&#39;de reaksiyon inkübe, daha sonra soğuması için buz üzerinde tüp yerleştirin. </li></ol> Ham enzimatik tepkime karışımından Trehaloz Analoglarının 3. saflaştırılması <ol><li> Tüm sıvı filtre içinden geçinceye kadar santrifüj filtre ünitesine deiyonize su 3 mL ekleme ve 3000 x g&#39;de santrifüj zar eser gliserol ayrılması için bir santrifüjlü filtre ünitesi (nominal moleküler ağırlık limitli (NWML), 10 kDa) ön-durulamatüpe (yaklaşık 20 dakika). iki ek kez tekrarlayın. hemen önce ya da reaksiyon (adım 2.3) sırasında bu adımı tamamlayın. </li><li> (Adım 2.3 de elde edilmiş), enzimatik reaksiyon karışımı soğutulduktan sonra, önceden durulanmıştır santrifüj filtre birimine aktarmak. santrifüj filtre ünitesine iyonu giderilmiş su ve transfer 1 ml reaksiyon tüpü durulayın. ürünün maksimum geri kazanımı için reaksiyon tüpünün tekrarlayın durulama. </li><li> Tüm sıvı tüpün (yaklaşık 20 dakika) içine filtreden geçer kadar 3.000 xg&#39;de santrifüj filtre ünitesi santrifüj. Tüm sıvı borusu (yaklaşık 20 dakika) içine filtre geçene kadar 3,000 x g&#39;de iyonu giderilmiş su ve santrifüj 3 mL santrifüj filtre ünitesinin üst bölmeyi durulayın. ürünün maksimum iyileşme için durulama tekrarlayın. </li><li> Santrifüj filtre ünitesinin üst bölmeyi atın. Tüp (tipik süzülen madde hacim altındaki süzüntüye karma-yataklı iyon-değişim reçinesi (3 gr) ilaveume durulama sayısına bağlı olarak 8-15 ml) &#39;dir. çözeltisi içinde süspansiyon haline getirilmiş reçine boncuklarını tutmak için yeterli bir hızda Manyetik bir karıştırma çubuğuna sahip olan, 1 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırılır. </li><li> Süpernatantı Durusu ve reçine çıkarmak için filtre. Geri kalan reçine durulama iyonu giderilmiş suyun 5 mL ekleyin. süpernatant süzün ve birinci dekantasyon ürün çözeltisi ile birleştirerek, süzün. ürünün maksimum geri kazanımı için reçine tekrarlayın durulama. </li><li> trehaloz analog ürünün başlangıç ​​malzemesinin glükoz analoğu tam dönüşüm elde olup olmadığını belirlemek için ince katman kromatografisi (TLC) veya HPLC vasıtasıyla reaksiyonun analiz edin. TLC analizi için adım 4.1 ve HPLC analizi için 4.2 adım. </li><li> kurutuldu ürün elde liyofilizasyon veya döner buharlaştırma ile suyun çıkarılması. tepkimeye girmemiş glükoz analoğu TLC ya da HPLC analizi sırasında gözlenmediğinde, kromatografi ile saflaştırma gereksizdir. Reaksiyon Yie elde etmek üzere ürün tartılırld ve nükleer manyetik rezonans gerçekleştirmek (NMR) spektroskopik analizi (adım 4.3) ürün yapısı ve saflığını teyit etmek. </li><li> reaksiyona girmemiş glükoz analoğu TLC analizi gözlenen ise, bir ebat eksklüzyon kolonu kullanılarak trehaloz analog ayırın. <ol><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak deiyonize suya doymuş, ekstra-ince P2 poliakrilamid kordon boyut dışlama ortam içeren 1 x 100 cm kolon hazırlanmıştır. Not: ebat eksklüzyonlu kolon, iyonu giderilmiş suyla yıkandıktan sonra yeniden kullanılabilir. </li><li> Yeniden çözülür kurutuldu enzimatik tepkime ürünü iyonu giderilmiş su, 0.5 mL (adım 3.7 de elde edilmiş). El ile boyut dışlama sütununa veya bir sütun akış adaptör ile bir ürün çözeltisi uygulanır. deiyonize su bir başka 0.5 mL ham ürünü ihtiva şişeyi yıkayın ve boyut dışlama sütununa yüklemek. </li><li> yerçekimi akışı ile, iyonu giderilmiş su ile ürün elde edilmiştir ve yaklaşık 2 m fraksiyonlarım toplamakL hacmi. </li><li> TLC (adım 4.1) ile kesirler analiz edin. Saf trehaloz analog içeren kesirler Havuzu. </li><li> kurutuldu ürün elde liyofilizasyon veya döner buharlaştırma ile suyun çıkarılması. Reaksiyon verimi elde etmek ve NMR analizi geçmek için ürünü tartılır (adım 4.3). </li></ol></li></ol> Trehaloz benzer ürünler 4. analizi <ol><li> TRet reaksiyon ince tabaka kromatografisi (TLC) analizi gerçekleştirebilir. NOT: Bu prosedür, aynı zamanda ebat eksklüzyonlu kolon fraksiyonları analiz etmek için kullanılabilir. TLC plaka bileşik lekeleme gözlemlemek için TLC analizi öncesinde reaksiyon karışımı ya da sütun fraksiyonları konsantre gerekli olabilir. <ol><li> Mark bir kalem ile TLC plakası yüzeyinde şeritleri ve toplanan uygun glikoz analog standart, trehaloz analog standart (varsa), reaksiyon karışımına dahil şerit, (ya da fraksiyonlara analit (ler) ve ilgili standart (lar) uygulanır boyut exclusion kolon saflaştırması), ve bir ko-Noktası. TLC plakasına her bir örnek uygulandıktan sonra, levha kurumaya bırakın. Not: Reaksiyon analizi için numune tipik olarak 2 uL TLC plakasına uygulanır. </li><li> N-butanol / etanol / deiyonize su kullanılarak TLC plakası geliştirmek (5: 3: 2). </li><li> Şeker içeren noktalar (genellikle 5 dakika) görüntülenebilir kadar sonra yüksek ayarda bir sıcak plaka üzerinde etanol (şeker leke) ve ısı% 5 H 2 SO 4 daldırın, geliştirilen TLC plakası kurutun. </li></ol></li><li> Ayrılması ve karbonhidrat saptayabilen bir HPLC sistemi kullanılarak tRet Reaksiyon karışımlarının HPLC analizi yapın. Bu protokol kırılma indeksi kullanan bir aminopropil HPLC kolonu ve algılama kullanarak karbonhidrat ayrılmasını gerektirir. <ol><li> HPLC için bir ön-sütun guard içeren aminopropil sütunu (4.6 x 250 mm) takın. </li><li> 0.4 bir akış oranında, deiyonize su içinde% 80 asetonitril ile aminopropil sütun dengeyemL / dakika. </li><li> aminopropil kolonuna reaksiyon ürünü (veya standart) çözeltisi yerleştirin. </li><li> 0.4 ml / dakikalık bir akış oranı ve 50 ° C kolon sıcaklığı deiyonize su içinde% 80 asetonitril ile ürün (veya standart) yıkayın. Tipik olarak, kullanılan çalışma süresi 40 dakikadır. NOT: buharlaştırıcı ışık saçma tespiti (ELSD) gibi diğer yöntemler kullanılabilir, ancak glükoz analoğu başlangıç ​​malzemesi ve trehaloz analog ürünün her ikisi de, kırılma endeksi ile tespit edilebilir. dk ve trehaloz analogları 15-25 dakika arasında Zehir 10-15 arasında tarif edilen koşullar kullanılarak, glikoz benzerleri genellikle Zehir. </li></ol></li><li> Saflaştınldı trehaloz analoglarının NMR analizi. <ol><li> D 2 O (700 uL) içinde arıtılmış trehaloz analog çözülür ve bir NMR tüpüne çözeltisi aktarın. </li><li> 1 H NMR ve uygun tesisin protokollerine göre 13C NMR spektrumları elde edin. </li></ol></li></ol><ol><li> , Sentez arındırmak, ve M. smegmatis 6-TreAz (Msmeg) yönetmek. <ol><li> 15 ml konik bir tüp 6-azido-6-deoksi glukopiranoz (6-GlcAz, 0.020 mmol, 4.1 mg), UDP-glikoz (0.040 mmol, 24.4 mg) ve MgCl2 (0.020 mmol, 4.1 mg) eklenir. </li><li> 300 ug / mL&#39;lik bir son enzim konsantrasyonu 1 ml&#39;lik bir nihai hacim elde etmek için (adım 1.5.4 de elde edilmiş) Tris tamponu tRet ekleyin. Pipetleyin Karışım yukarı ve aşağı yavaşça veya katıların çözünmesi için tüp ters. </li><li> 15 dakika boyunca çalkalayarak 70 ° C &#39;de reaksiyon inkübe edin. </li><li> iyonu giderilmiş su, 3 mL ile enzimatik tepkime karışımı seyreltik bir önceden yıkanmış, santrifüj, filtre ünitesinin (NMWL 10 kDa) aktarın. sıvının çoğu, yaklaşık tüp içine filtre üzerinden 10 dakika geçinceye kadar 3.000 xg&#39;de filtre ünitesini santrifüj. </li><li> Sil incisantrifüj filtre ünitesinin e üst bölme. 25 dakika için oda sıcaklığında tüp ve bir karıştırma / titremesi karma yataklı iyon-değişim reçinesi (0.75 g) ekleyin. Süpernatantı Durusu ve reçine çıkarmak için filtre. Not: Adım 5.1.1-5.1.5 az 1 saat, yaklaşık 5 mM konsantrasyonda 6-azido-trehaloz (6-TreAz) sulu bir çözüm sağlar. 5 mM konsantrasyonu, ürünün alt tabaka kantitatif dönüşüm ve bu adımlar sırasında ürünün asgari seviyede kayıp varsayarak, saflaştırma adımları sırasında yer alır seyreltme göre tahmin edilir. Çözelti steril olarak filtrelenir, istenirse, bir biyolojik numuneye eklenmeden önce olabilir. </li><li> 100-1,000 uL nihai kültür hacmi ve 25 uM aralığında bir son 6-TreAz konsantrasyon elde etmek için, tipik olarak, M. smegmatis bir log-faz kültürünü (Msmeg) 6-TreAz ürün çözeltisinin uygun bir hacim. istenen süre, tipik olarak 60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol></li><li> Azid etiketli hücrelere bir flüorofor konjuge için kimya tıklayın gerçekleştirin. Bu protokol, Msmeg hücre yüzeyi azidler bir florofor sağlamak için bakır ile katalize edilen azit-alkin sikloadisyon (CuAAC) kullanın. <ol><li> 5 dakika boyunca 3,900 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri, ve daha sonra PBS,% 0.5 sığır serum albümini ihtiva eden hücreleri yıkayın. İki kez tekrarlayın. </li><li> bunları düzeltmek için PBS içinde% 4 para-formaldehit pelet hücreleri yeniden askıya. 10 dakika süreyle kuluçkalandıktan sonra hücreler, yıkama adımı 5.2.1 tekrarlayın. </li><li> 138 uL PBS içinde pelet hücreleri yeniden askıya. </li><li> DMSO içinde alkin karboksirodamin 110 (Alkin-488) &#39;in bir 1 mM stok çözelti 3 mcL. </li><li> iyonu giderilmiş su içinde sodyum askorbat taze hazırlanmış bir 60 mM stok solüsyonu 3 uL ekleyin. </li><li> Tert-butanol / dimetilsülfoksit Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA) içindeki bir 6.4 mM stok çözeltisi (DMSO) 3 mcL 4: 1 arasındadır. </li><li> 3 &amp; # ekle956; deiyonize su içinde CuSO 4 bir 50 mM stok solüsyonu ilave. </li><li> Pipet Hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı, daha sonra 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edilir. </li><li> Adımı tekrarlayın 5.2.1 hücreleri yıkamak için. 150 ul PBS hücrelerin yeniden askıya. </li></ol></li><li> Hücresel floresan analizi yapın. Bu protokol, etiketli Msmeg hücresel floresan görselleştirmek için floresan mikroskobu kullanın. <ol><li> Bir mikroskop lamı PBS içinde süspansiyon haline getirilmiş bakteri hücreleri 10 ul ekleyin ve hafifçe lamel kenarına kullanılarak ince bir tabaka halinde sıvı yayıldı. karanlıkta kuru hava için izin verin. </li><li> Daha sonra yapıştırıcı kapak numunesi üzerinde kayıyor yerleştirin ve uygulamak, kurutulmuş numune üzerinde montaj orta 10 uL ekleyin (örneğin, oje) hareketsiz hale getirmek. </li><li> Görüntü 100X büyütmede bir floresan mikroskop kullanılarak slaytlar. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+on+trehalose:+a+multifunctional+molecule.">New insights on trehalose: a multifunctional molecule.</a> Glycobiology. 13, 17-27 (2003).</li><li>Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+trehalose+in+pathogenicity:+some+general+rules,+yet+many+exceptions.">Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions.</a> PLoS Pathog. 9, 1003447 (2013).</li><li>Ohtake, S., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose:+Current+use+and+future+applications.">Trehalose: Current use and future applications.</a> J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).</li><li>Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+free+sugars+in+growing+and+desiccated+plants+of+Selaginella+lepidophylla.">Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla.</a> Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).</li><li>Kubota, M., Ohnishi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Glycoenzymes. , (2000).</li><li>Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+analogues:+latest+insights+in+properties+and+biocatalytic+production.">Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).</li><li>Kim, H. -. M., Chang, Y. -. K., Ryu, S. -. I., Moon, S. -. G., Lee, S. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+a+galactose-containing+trehalose+analogue+disaccharide+by+Pyrococcus+horikoshii+trehalose-synthesizing+glycosyltransferase:+Inhibitory+effects+on+several+disaccharidase+activities.">Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities.</a> J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).</li><li>Backus, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uptake+of+unnatural+trehalose+analogs+as+a+reporter+for+Mycobacterium+tuberculosis.">Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).</li><li>Swarts, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mycobacterial+trehalome+with+bioorthogonal+chemistry.">Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).</li><li>Rose, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+biological+evaluation+of+trehalose+analogs+as+potential+inhibitors+of+mycobacterial+cell+wall+biosynthesis.">Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis.</a> Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+trehalose-based+compounds+and+their+inhibitory+activities+against+Mycobacterium+smegmatis.">Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis.</a> Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).</li><li>Gobec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis,+biochemical+evaluation+and+antimycobacterial+action+of+phosphonate+inhibitors+of+antigen+85C,+a+crucial+enzyme+involved+in+biosynthesis+of+the+mycobacterial+cell+wall.">Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall.</a> Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).</li><li>Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regioselective+protection+and+functionalization+of+trehalose.">Regioselective protection and functionalization of trehalose.</a> Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).</li><li>Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereoselective+construction+of+1,1-alpha,alpha-glycosidic+bonds.">Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds.</a> Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).</li><li>Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+studies+toward+Mycobacterium+tuberculosis+sulfolipid-I.">Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I.</a> J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).</li><li>Chaen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+enzymatic+synthesis+of+disaccharide,+alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside,+by+trehalose+phosphorylase+from+Thermoanaerobacter+brockii.">Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii.</a> J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).</li><li>Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+acceptor+specificity+of+trehalose+phosphorylase+for+the+production+of+trehalose+analogs.">Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs.</a> Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).</li><li>Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+trehalose+synthesizing+pathway+in+the+hyperthermophilic+Crenarchaeon+Thermoproteus+tenax:+the+unidirectional+TreT+pathway.">A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway.</a> Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).</li><li>Urbanek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+of+trehalose+analogues:+rapid+access+to+chemical+probes+for+investigating+mycobacteria.">Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria.</a> ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+Huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Torn&#248;e, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidotriazoles+on+solid+phase:+[1,2,3]-triazoles+by+regiospecific+copper(I)-catalyzed+1,3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides.">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li><li>Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose-recycling+ABC+transporter+LpqY-SugA-SugB-SugC+is+essential+for+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Trehaloz analogları gıda ve ilaç korunması mikrobiyal enfeksiyonların 6 tanı ve tedavi, çeşitli alanları etkileme potansiyeline sahiptir. Mevcut çok basamaklı kimyasal sentez yöntemi (doğal karmaşık mikobakteriyel glikolipitler ortaya çıkan gibi) modifikasyon birden fazla site kompleks trehaloz analoglarını üretmek için de yararlıdır. Bununla birlikte, bu yöntemler, nispeten basit bir tekli ikame edilmiş trehaloz analogları 9, ...

Trehaloz, bir 1,1-α, α-glikosidik bağ (Şekil 1A) ile bağlanmış iki glukoz gruplarından oluşan simetrik indirgeyici olmayan disakkarittir. Trehaloz, insan ve diğer memelilerde eksik olsa da, bakteri, mantar, bitki ve omurgasız 1 yaygın olarak bulunur. En organizmalarda trehaloz birincil rolü, kuruma 1 ile çevresel strese karşı korumaktır. Buna ek olarak, bazı insan patojenleri hücre kılıfı sentezi bir aracısı olarak ve bağışıklık glikolipitler 2 yapımı için bir yapı bloğu olarak trehaloz kullanan tuberculosis neden Mycobacterium tuberculosis dahil olmak üzere, hastalık oluşturma etkisi için trehaloz gerektirir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg" /> Şekil 1: Trehaloz, trehaloz analogları. (AX, yapısal değişiklik doğal trehaloz ve doğal olmayan bir trehaloz analog, bir) Yapıları. Bio ve bio potansiyel uygulamalara sahip literatürde trehaloz analogları (B) Örnekler. Kendine özgü yapısı ve fizyolojik fonksiyonları, trehaloz mantıksal biyo (tekno) kullanım ve biyomedikal uygulamalarda 3 önemli dikkat çekti. Doğa-örneğin gözlenen trehaloz koruyucu özellikleri, çarpıcı yeteneği 4 sahibi olur Biyokoruma uygulamalarında geniş kullanım mahmuzlu aşırı dehidratasyon uğramıştır &quot;diriliş&quot; Bitkilerde yaşam sürdürebilmek yardımcı olur. Trehaloz, örneğin nükleik asitler, proteinler, hücre ve doku 3 arasındaki biyolojik örnekler, geniş bir dizi korumak için kullanılmıştır. Örneğin, trehaloz ilaç t sayısında bir stabilize edici katkı maddesi olarak kullanılırşapka birçok anti-kanser monoklonal antikorlar 3 olmak üzere, piyasada bulunmaktadır. Yanı sıra, trehaloz gıda sektöründe tatlandırıcı olarak kullanılır ve bu kapsamlı hem gıda ve kozmetik sanayiinde ürün korunması için kullanılır. Ticari Bu tür uygulamalar için trehaloz kabul ilk doğal kaynaklardan ya da sentez yoluyla saf trehaloz toplu miktarlarının elde edilmesi için yetersizlik ile sınırlıydı. Bununla birlikte, nişasta trehaloz ekonomik üretimi için etkin bir enzimatik proses son zamanlarda yaygın ticari kullanımı teşvik ettiği geliştirilmiştir 5. 6; kimyasal trehaloz değiştirilmiş türevleri, (Şekil 1B de gösterilen trehaloz analoglarının spesifik örnekleri, genel yapısı Şekil 1A&#39;da gösterilen), çeşitli uygulamalar için giderek artan bir ilgi kazanmıştır, trehaloz analogları olarak adlandırılan. Örneğin, lakto-trehaloz böylece 4-pozisyonunda hidroksil grubu, bir ters stereokimyasal konfigürasyona sahiptir, galaktoz ile ikame onun glikoz birimleri ile bir trehaloz analogudur. Lacto-Trehaloz aynı stabilize edici özelliklere sahip fakat kalorisiz gıda katkı maddesi 6, 7 gibi cazip hale bağırsak enzimleri bozunmaya karşı dayanıklı olmaktadır. trehaloz analogları Bizim Grubun faiz öncelikle mikobakteriler-spesifik problar ve inhibitörleri olarak değeri ile ilgilidir. Barry ve Davis grupları floresan mikroskobu 8 tarafından algılama sağlayan metabolik canlı M. tuberculosis hücre duvarını etiketlemek için gösterilen FITC-keto-trehaloz adında bir floresan konjuge keto-trehaloz analog, geliştirdi. BERTOZZI laboratuvar metabolik det olmak sonradan hücre duvarını etiket olabilir ve küçük azido-trehaloz (TreAz) analogları geliştirdiyansıtılmaktadır tıklama kimya ve floresan analizi 9 kullanarak. Bu gelişmeler, tüberküloz için tanısal görüntüleme maddeleri olarak trehaloz-dayanan problar kullanılarak olasılığına işaret etmektedir. Trehaloz analogları da canlılığı ve ölümcüllüğün 10, 11, 12 için gerekli olan bakteri yollarının bozmaya nedeniyle potansiyel M. tuberculosis inhibitörleri olarak takip edilmiştir. Şimdiye kadar, biyo (tekno) mantıksal ve biyomedikal uygulamalar için trehaloz analogları geliştirmek için ana engel verimli sentetik yöntemlerin olmaması. Trehaloz analogları üreten iki geleneksel yolları kimyasal sentez üzerinde (Şekil 2) güveniyor. Diğer düzgün fonksiyonelleştirilmiş monosakkarit yapı taşları ile başlayan ve kimyasal glikosilasyonu kullanılmasını içermektedir ise bir rota, doğal trehalozun desymmetrization / modifikasyonunu içerir1,1-α, α-glikosidik bağ oluşturmak. En son derlemelerde 13, 14 tartışılmıştır Bu yaklaşımlar, M. tuberculosis 15 bu tür sulfolipid-1 gibi kompleks bir trehaloz içeren doğal ürünler, küçük miktarlarda çok adımlı bir sentez gerçekleştirilmesi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, her iki yaklaşım olmayan kimyagerler genellikle zaman alıcı, verimsiz erişilemez ve buna ek olarak, çevre dostu olarak kabul edilmez. Bu nedenle, trehaloz analoglarının belirli türleri sentezlenmesi için, bu stratejiler ideal değildir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg" /> Şekil 2: trehaloz analog sentezi Yaklaşımlar. Kimyasal solda gösterilen, trehaloz analog sentezi yaklaşımlar, zor korumanız içeren çok adımlı prosedürleri kullanmakma / korumanın kaldırılması, desymmetrization ve / veya glikosilasyon adımları. sağda gösterilen enzimatik sentezi, stereoselektif olarak, sulu çözelti içinde analogları trehaloza basit korumasız substratlar dönüştürme enzim (ler) kullanır. Burada rapor enzimatik protokolü tek bir aşamada trehaloz analogları glikoz analogları ve UDP-glikoz dönüştürmek için bir trehaloz sintaz (tRet) enzimini kullanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> trehaloz analogları etkin bir biyokatalitik rota moleküllerinin bu umut verici sınıfının üretim, değerlendirme ve uygulama kolaylaştıracaktır. Trehaloz üretimi 5 ticari enzimatik işlem, bir alt-tabaka olarak nişasta kullandığı için analoglarını sentez için uyumlu değildir, diğer biyosentetik yolu vardırtrehaloz analog sentezi için istismar edilebilir doğada yolları. Ancak, son zamanlarda 6 gözden geçirilmiştir, bu alanda, araştırma, sınırlı olmuştur. Bir rapor ilgili floro-glikoz tek floro-trehaloz analog ulaşmak için Escherichia coli trehaloz biyosentetik yolunun esinlenerek bir yöntem kullanılır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, verimlilik ve genelliğini 8 sınırlı üç enzim sistemi gerektirir. Araştırılmış olan bir başka yaklaşım, ilke olarak glükoz analogları ve glükoz-1-fosfat 6, 16, 17 trehaloz analoglarının bir-adımlık sentez izin ters yönde, trehaloz fosforilaz (TREP) kullanmaktır. Bu yaklaşım, gelecekte söz var olsa da, her ikisi de eviren ve istinat TrePs şu anda analog sentezi için dezavantajları var. Örneğin, tersini TrePs yasaklı deneyimlerini varnsive verici molekül (β-D-glikoz 1-fosfat) ve tutma TrePs düşük enzim sentezleme verimler / kararlılık ve belirli alt-tabaka karışıklık sahiptir. (Enzim mühendisliği yoluyla, örneğin) önemli gelişmeler TREP-aracılı analog sentezi önce gerekli olacak pratik. Şu anda, trehaloz analoglarının enzimatik sentezi için en pratik yaklaşım, kan şekeri ve üridin difosfat (UDP), tek bir aşama 6&#39;da trehaloza -glükoz dönüştüren bir trehaloz sintaz (tRet) enzimi kullanılmasıdır. Son zamanlarda glükoz analogları ve UDP-glikoz (Şekil 3) 19 trehaloz analoglarını sentez -to Thermoproteus Tenax tRet-termostabil ve tek yönlü enzim 18 kullanımını bildirmiştir. Bu enzim sadece sentetik yönde çalışır ve TREP sisteminde bulunan trehaloz bozulması problemini önler. Bu tek-aşamalı bir reaksiyon coul1 saat içinde tamamlanması d ve hazır glükoz analoğu substratlar (Örnek Sonuçlar Tablo 1 den (yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile tespit edildiği üzere&gt;% 99 kadar) trehaloz analogları geniş bir çeşitliliği yüksek verimde erişilen Bölüm). <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg" /> Şekil 3: trehaloz analoglarının tRet katalizörlü tek aşamalı sentezi. T. Tenax gelen Tret enzimi stereoselektif tek adımda trehaloz analogları oluşturmak için hazır glikoz analogları ve UDP-glikoz katılabilirsiniz. R1 -R4 dün = Değişken yapısal değişiklik, örneğin, azido, floro, deoksi, tiyo, stereokimyasal veya izotopik etiketli modifikasyon; Y, örneğin, oksijen ya da kükürt ya da izotopik olarak etiketlenmiş heteroatom değişken heteroatom, =. Burada, biz reklamı sağlamaktRet reaksiyon koşulları optimize E.coli&#39;den ekspresyonu ve tRet saflaştırılması dahil olmak üzere, tRet sentez işlemi için etailed protokol, ve sulu faz içinde tamamen gerçekleştirilir geliştirilmiş bir saflaştırma yöntemi. Bu modifiye protokol, yarı-preparatif skala (10-100 mg) üzerinde, çeşitli trehaloz benzerlerinin uygun ve verimli bir sentezi ve saflaştırılması sağlar. Biz de hazırlanması ve mikobakteri hücrelerin hızlı floresan algılama özellikli az 1 saat, mikobakterinin bir trehaloz tabanlı prob uygulanması için bu protokolün kullanımını göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>L24045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-Arabinose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered Saline</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate,</td>
			<td rowspan="2">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2">S374</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter, 0.45 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09719D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor mini-tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP nickel affinity column, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base ultrapure</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing, MWCO 12&#8211;14,000</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-152-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Glucose analogues</td>
			<td>CarboSynth,</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Examples of vendors that offer numerous glucose analogues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Aldrich,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz)</td>
			<td>CarboSynth</td>
			<td>MA02620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UDP-Glucose</td>
			<td>abcam Biochemicals</td>
			<td>ab120384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rex RG 501-X8 mixed-bed ion-exchange resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>444-9999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-Fine Bio-Gel P2 media</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>150-4118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-backed silica gel thin-layer chromatography plates</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1056280001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Butanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25310A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>AX0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide, 99.8%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>351430075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopropyl HPLC column</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-formaldehyde</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>18505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkyne-488</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>761621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>360538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W387520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern Biotechnology</td>
			<td>10001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid one-step enzymatic synthesis and all-aqueous purification of trehalose analogues

Kimyasal trehaloz veya trehaloz analogları sürümlerini değiştirilmiş, diğer alanlar arasında biyoloji, biyoteknoloji ve ilaç bilimi uygulamaları var. Örneğin, tespit etiketleri taşıyan trehaloz analoglan Mycobacterium tuberculosis tespit etmek için kullanılmıştır ve tüberküloz tanısal görüntüleme maddeleri gibi uygulamalar olabilir. trehalozun hidrolitik olarak kararlı versiyonları da bağlı kalorisiz tatlandırıcılar ve Bio koruyucu maddeler olarak kullanım için potansiyel takip edilmektedir. Çeşitli uygulamalar için bileşikler sınıfının itiraz rağmen, potansiyel nedeniyle bunların üretimi için güçlü bir yol olmadığı için tamamlanmamış kalır. Burada, kimyasal sentez ile ilgili sorunlarını ortadan trehaloz analoglarının hızlı ve etkili bir tek-aşamalı biyokatalitik sentezi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Thermoproteus Tenax gelen ısı ayarlı trehaloz sintaz (tRet) enzimini kullanarak, trehaloz analoglan generat olabilirEd glükoz analogları ve yüksek verimle üridin difosfat glukozdan tek bir aşamada (kantitatif dönüşüme kadar) 15-60 dakika içinde. sıkma diyaliz ve iyon değişim oluşur basit ve hızlı bir sigara kromatografik saflaştırma protokolü gibi az 45 dakika içinde sulu bir çözelti içinde bilinen konsantrasyonda bir çok trehaloz analoglarını sağlayabilir. reaksiyona girmemiş glükoz analoğu hala devam durumlarda, trehaloz analog ürününün kromatografik saflaştırması gerçekleştirilebilir. Genel olarak, bu yöntem olup, özelliği kimyagerler etkin ve erişilebilir hızlandırılmış sentezi ve trehaloz analogları saflaştırılması için bir &quot;yeşil&quot; biyokatalitik bir platform sağlar. Bu yöntemin uygulanabilirliği örnek için, sentez seyahati sulu arıtma bir protokol açıklar ve mikobakterilerin floresens az 1 saat sürdü ve etkinleştirilmiş her biri mikobakteriler için trehaloz-bazlı tıklama kimyası prob uygulanması. Gelecekte, oth arasında, o tasavvurUygulamalar er, bu protokol, tüberküloz teşhis için trehaloz-bazlı prob hızlı sentezi uygulanabilir. Böyle pozitron emisyon tomografisi-bilgisayarlı tomografi (PET-BT) olarak (örneğin, 18 F-modifiye trehaloz) ileri klinik görüntüleme yöntemleri için kullanılan olabilir Örneğin, kısa ömürlü radyonüklid modifiye trehaloz analogları.

T. Tenax tRet yaklaşık 4 mg, standart protein ekspresyonu ve saflaştırma teknikleri kullanılarak / L&#39;lik bir verimle elde etmek üzere, E. coli &#39;den elde edilmiştir. Tek bir nikel afinite kromatografisi adım (a Örnek FPLC izleme Şekil 4&#39;te gösterilmiştir), E. coli lizattan tRet saflaştırmak için yeterliydi. TRet sentez işlemi üzerindeki ilk yayında kurulmuş olarak, yeniden birleştirici T. Tenax tRet çeş...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues at JoVE.com

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Hızlı Bir adım enzimatik sentezi ve Trehaloz Analoglarının All-sulu Arıtma

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

rapid-one-step-enzymatic-synthesis-all-aqueous-purification-trehalose

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.3K Görüntüleme.  Central Michigan University. Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Video: Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Biyokimya

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

Hızlı izole edilmesi HEK hücrelerden Mitoribosome

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug targets. Yet, a major barrier to their characterization and exploitation in academic or industrial settings is that most biochemical, biophysical, and drug screening strategies require these proteins to be in a water-soluble state. Our laboratory recently developed the peptidisc, a membrane mimetic offering a &#8220;one-size-fits-all&#8221; approach to the problem of membrane protein solubility. We present here a streamlined protocol that combines protein purification and peptidisc reconstitution in a single chromatographic step. This workflow, termed PeptiQuick, allows for bypassing dialysis and incubation with polystyrene beads, thereby greatly reducing exposure to detergent, protein denaturation, and sample loss. When PeptiQuick is performed with biotinylated scaffolds, the preparation can be directly attached to streptavidin-coated surfaces. There is no need to biotinylate or modify the membrane protein target. PeptiQuick is showcased here with the membrane receptor FhuA and antimicrobial ligand colicin M, using biolayer interferometry to determine the precise kinetics of their interaction. It is concluded that PeptiQuick is a convenient way to prepare and analyze membrane protein-ligand interactions within one&#160;day in a detergent-free environment.

We present a method that combines membrane protein purification and reconstitution into peptidiscs in a single chromatographic step. Biotinylated scaffolds are used for direct surface attachment and measurement of protein-ligand interactions via biolayer interferometry.

PeptiQuick, Aerodinamik Protein Bağlayıcı Tahliller için Biyotinylated Peptidiskler içine Membran Proteinlerin Bir Adım Dahil

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...