Dr. Rawi Ramautar would like to acknowledge the financial support of the Veni grant scheme of the Netherlands Organization of Scientific Research (NWO Veni 722.013.008).

HINWEIS: Das Protokoll hier für die Verwendung von sheathless CE-MS für metabolischen Profils Studien beschrieben ist nur für den Einsatz im Labor. Die unten beschriebenen Verfahren werden auf kürzlich veröffentlichte Arbeit 4,5 basiert. Weitere experimentelle Details finden sich in diesen Papieren zu finden. Vor dieses Protokoll zu verwenden, finden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Bitte verwenden Sie alle geeigneten Laborsicherheitsverfahren, einschließlich Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhe, wenn die Experimente in diesem Protokoll beschriebenen durch. 1. Vorbereitung der Reagenzien-Lösungen und Proben <ol><li> Herstellung des Hintergrundelektrolyten (BGE) <ol><li> Bereiten Sie eine neue BGE-Lösung (10% (v / v) Essigsäure, pH 2,2) jeden Tag. </li><li> In 9,0 ml Wasser in einen 10-ml-Glasfläschchen und 1,0 ml Essigsäure, um das Wasser in einem Abzug. Mischen Sie die Lösung gründlich einen Wirbel verwenden. </li></ol></li><li> Herstellung von Metaboliten standard Mischung <ol><li> Man löst 50 ul einer 50 uM Kation Standardmischung 60 kationischen Metaboliten in 50 &amp; mgr; l Wasser enthielt, und die Lösung gründlich mischen. Bei -80 ° C, wenn sie nicht in Gebrauch ist. </li><li> Man löst 50 ul einer 50 uM Anion Standardmischung 30 anionische Metaboliten in 50 &amp; mgr; l Wasser enthielt, und die Lösung gründlich mischen. Bewahren Sie diese Lösung, in Aliquots Frost / Tau-Zyklen der gleichen Standardmischung, bei -80 ° C, wenn sie nicht in Gebrauch zu verhindern. HINWEIS: Der Metabolit Standardmischungen für 3 Monate stabil sind, wenn sie richtig bei -80 ° C gelagert. </li></ol></li><li> Herstellung von Extrakten aus der Glioblastom - Zelllinie <ol><li> Waschen Sie die adhärenten menschlichen U-87 MG Glioblastom - Zellen dreimal mit 1 ml eiskaltem 0,9% Natriumchloridlösung 21. </li><li> 2 ml eiskaltem Methanol / Wasser - Lösung (8/2, v / v) zu den anhaftenden Zellen und kratzen mit einem Gummizellschaber 21 gekippt. </li&gt; <li> Sammeln Sie die Methanol / Wasser-Lösung in einem Rohr und ultrasonicate für 2 min. </li><li> In Chloroform zu dem Methanol / Wasser-Fraktion (endgültige Verhältnis 8/8/2, v / v / v) und Zentrifuge die Probe für 10 Minuten bei 16.100 × g und 4 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Methanol / Wasser-Schicht und verdampfen diese Fraktion ein Vakuum-Konzentrators. Rekonstitution des getrockneten Materials in 50 &amp; mgr; l Wasser für die Analyse von sheathless CE-MS. Wenn nicht in Gebrauch speichern Sie die Probe bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Einstellen der sheathless CE-MS-System nach oben <ol><li> Die Installation der nackten Quarzglas Patrone mit der porösen Spitze Emitter <ol><li> Legen Sie eine neue nackten Quarzglas Patrone mit einer porösen Spitze Emitter (30 &amp; mgr; m Innendurchmesser x 90 cm Gesamtlänge) in der CE-Gerät. </li><li> Tragen Sie eine Vorwärtsspülung bei 50 psi für 15 Minuten mit der Software das CE-Gerät mit 100% Methanol zu steuern und visuell prüfen, ob Flüssigkeit aus dem capil ausströmendenLary Ausgang während dieser Spülschritt. Auch eine Spülung in die entgegengesetzte Richtung für 5 min bei 50 psi führen die BGE-Lösung visuell zu untersuchen, ob Flüssigkeit aus der leitfähigen Kapillare fließt aus. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 bei einem Druck von 100 psi, falls keine Flüssigkeit Tropfenbildung hat am Kapillarauslaß beobachtet. Installieren Sie einen neuen nackten Quarzglas Patrone, wenn keine Flüssigkeit Tropfenbildung während dieses Schritts beobachtet wurde. </li><li> Spülen Sie die Trennkapillare mit Wasser bei 50 psi für 10 min, gefolgt von 0,1 M NaOH bei 50 psi für 10 min, dann mit Wasser bei 50 psi für 10 Minuten und schließlich mit BGE bei 50 psi für 10 min. HINWEIS: Die Schritte 2.1.1 bis 2.1.4 nur für die Installation einer neuen kapillaren Kassette erforderlich sind. </li></ol></li><li> Die Kopplung der Kapillar - poröse Spitze Emitter ESI-MS HINWEIS: Vor der CE-Kapillare zu MS zu koppeln, sicherzustellen, dass die MS Instrument kalibriert worden ist und mit dem CE-System verbunden. Stellen Sie die ESI-Spannung an0. Den MS-Gerät mit einer Nanospray-Quelle. Gas 1, Gas 2 und Schnittstelle Heizungstemperatur wurden als ESI bei sehr niedrigen Flussraten erfolgt nur durch die Anwendung der Ionensprayspannung eingestellt bei 1500 V. Stellen Sie den Vorhang bei 5 psi nicht angewendet. <ol><li> Entfernen Sie die sprayer Spitze des Quarzglas Patrone aus dem Wasserrohr und installiert es im Nanospray Quellenadapter zum Koppeln mit dem MS Instruments. Stellen Sie sicher, dass die Höhe der BGE Fläschchen in der CE-Instrument, um die Höhe der Spritze Spitze entsprechen. </li><li> Prüfen, für die Strömung von Flüssigkeit durch die leitfähige Kapillare durch 5 min bei 50 psi mit BGE Spülen. Während dieser Spülung eine Tropfenbildung an der Basis des Zerstäubers ESI Schritt Nadel beobachtet werden sollte. </li><li> Spülen Sie die Trennkapillare mit BGE bei 50 psi für 10 Minuten in der Vorwärtsrichtung. Tropfenbildung sollte sich an der Spitze des porösen Spitzenemitter (sprayer Spitze) bei diesem Schritt zu beachten. </li><li> Positionieren Sie die poröse Spitze Emitter mit dem Eingang des MS-Einlass in einem Abstand von cIRCA 2 bis 3 mm. </li><li> Tragen Sie eine Spannung von 30 kV eine Rampenzeit von 1 min und starten Sie den Erwerb MS - Daten in der m / z - Bereich von 65 bis 1000 m / z für Studien des metabolischen Profils zunächst eine ESI - Spannung von 0 verwenden. HINWEIS: Das Massenspektrum des Signals ungültig sein sollte, wie es sollte kein Elektro sein. </li><li> Stellen Sie die ESI-Spannung bis 1000 V, während tragen die Daten zu messen. Erhöhen Sie die ESI-Spannung in Schritten von 200 V bis zu einer konstanten Hintergrundsignal wird für mindestens 15 min beobachtet. </li><li> Optimieren Sie die poröse Spitze Emitter Position in Bezug auf die Mitte des MS-Einlass, indem er in der x, y oder z-Richtung bewegt, um zu sehen, welche Position die maximale und stabilsten MS-Signal (Gesamtionen Elektropherogramm) zur Verfügung stellt. </li><li> Nachdem die Position der porösen Spitze Emitter zu optimieren und die optimale ESI Spannung zu bestimmen, stellen Sie die ESI-Spannung auf 0 V und der CE-Spannung von 30 kV bis 1 kV verringern, um eine Rampenzeit von 5 min mit. </li><li> Erstellen Sie eine MS-Methode using die optimale ESI Spannung und eine CE-Verfahren zur Analyse von Metaboliten-Standards und biologischen Proben auf dem CE-Gerät. </li></ol></li></ol> 3. Analyse der Metabolit Standards und biologischen Proben <ol><li> Leistungsbewertung des sheathless CE-MS - System <ol><li> Transfer 20 ul des anionischen Metaboliten Standardmischung in eine leere 100 ul Microvial (PCR Fläschchen), die in einem CE-Phiole passt und setzen diese Fläschchen in der Einlassprobenschale. HINWEIS: Das Mindestvolumen erforderlich im Microvial für eine zuverlässige Einspritzung 2 ul. <ol><li> Starten Sie den MS Erwerb Negativ-Ionen-Modus Verfahren während Schritt erstellt 2.2.9 und anschließend die CE-Sequenz starten Sie die Software die Steuerung des CE-Instrument. </li><li> Spülen Sie die Trennkapillare mit BGE bei 50 psi für 3 min, gefolgt von Injektion bei 2,0 psi für 60 sec (20 nl bis 3% des Kapillarvolumens entspricht) und anschließend durch BGE Injektion bei 1,0 psi für 10sek. HINWEIS: Anschließend MS Datenerfassung ausgelöst. </li><li> Übernehmen einer Spannung von -30 kV mit einer Anstiegszeit von 1,0 min mit einem Druck von 0,5 psi für 30 min am Einlass. Nach 30 min elektrophoretische Trennung, MS die Datenerfassung zu stoppen und die CE-Spannung auf -1 kV verringern, um eine Rampenzeit von 5 min unter Verwendung (eine graduelle Abnahme der CE Spannung nach der elektrophoretischen Trennung um die Haltbarkeit der porösen Spitze kapillaren Emitters verbessert). </li></ol></li><li> Zwischen Probeninjektionen, spülen Sie die Kapillare mit Wasser, 0,1 M Natriumhydroxid, Wasser und BGE jeweils bei 30 psi für 3 min. </li><li> Analysieren der aufgezeichneten Daten durch die Migrationszeiten zu bestimmen und die Signalintensität des untersuchten anionischen Metabolit-Gemisch. </li><li> Beurteilen Sie, ob die anionische Metabolit Standards in der Region erscheinen zwischen 10 und 28 min. </li><li> Prüfen , ob drei strukturell verwandten Isomeren, das heißt, D-Glucose-1-phosphat, D-Glucose-6-phosphat und D-Fructose-6-phosphatteilweise getrennt, das heißt, die Auflösung zwischen den beiden ersten Spitzen circa 0,75 und der letzten beiden Peaks ist circa 0,50 (siehe Abbildung 1). ANMERKUNG: Eine Auflösung von 1,5 weist auf eine Basislinientrennung von zwei benachbarten Spitzen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 und 3.1.2 für die kationische Metabolit-Gemisch. Stellen Sie sicher, dass MS-Detektion ist jetzt in positive Ionen-Modus und CE-Spannung ist 30 kV. </li><li> Analysieren der aufgezeichneten Daten durch die Migrationszeiten zu bestimmen und die Signalintensität des untersuchten kationischen Metabolit-Gemisch. </li><li> Beurteilen Sie, ob die kationischen Metaboliten Standards in der Region erscheinen zwischen 8 und 22 min. Überprüfen Sie, ob Isoleucin und Leucin sind zwischen 15 und 15,5 min Migration und bestimmen, ob die Auflösung circa 0,5 ist. </li></ol></li><li> Analyse von biologischen Proben <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 und 3.1.2 für anionische metabolischen Profils des Extrakts der Glioblastom-Zelllinie. HINWEIS: Die metabolische conZelt nach der Probenvorbehandlungs daher entspricht einer Zelldichte von 20 Zellen / nl, erhalten circa, 20 nl Injektion ist das Äquivalent von 400 Zellen pro Analyse. . </li><li> Erstellen eines extrahierten Ionen Elektropherogramm für den Metaboliten Milchsäure (m / z 89,0243) unter Verwendung von 5 mDa Massengenauigkeit und prüfen Sie, ob die Signalintensität über 100.000 Zählungen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 und 3.1.2 für kationische metabolischen Profils des Extrakts der Glioblastom-Zelllinie. HINWEIS: Eine sehr informationsreiche Gesamtionen Elektropherogramm sollte für eine 20 nl Injektion in diesem Modus beobachtet werden. </li><li> Nach den Analysen oder wenn nicht in Gebrauch, spülen Sie die Kapillare mit Wasser bei 50 psi für 15 min und speichern den Einlaßteil der Kapillare in ein Fläschchen mit Wasser und dem porösen Abschnitt (Auslassteil) in einem Rohr auch Wasser enthält. </li></ol></li></ol>

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We have nothing to disclose.

A sheathless CE-MS-Verfahren eine poröse Spitze Emitters Verwendung wurde für die Analyse von hochpolaren und geladenen Metaboliten dargestellt. Ein einzigartiges Merkmal dieses Ansatzes ist, dass anionische oder kationische Metaboliten nur profiliert werden können, indem die MS-Detektion und CE Spannungspolarität umgeschaltet wird. Eine breite Palette von hochpolaren und geladenen Metaboliten in biologischen Proben mit einem hohen Abscheidegrad analysiert werden, die strukturell ähnlichen Metaboliten von entscheidender Bedeutung ist, und mit Nachweisgrenzen in der (niedrig) nanomolaren Bereich. Das dargestellte Protokoll konzentrierte sich auf die Verwendung von sheathless CE-MS für metabolische Profilieren von Zellextrakten, um die Brauchbarkeit des Verfahrens zur metabolischen Profils einer biologischen Probe zu veranschaulichen. Der hier beschriebene Ansatz kann auch für die metabolische Profilieren von anderen Arten von biologischen Proben verwendet werden, wie beispielsweise menschlichem Urin 5, da eine richtige Probenvorbehandlungsverfahren verwendet wird. Die sheathless CE-MS method basiert auf einer porösen Spitze Emitters, der die Nutzung des eigen Low-Flow-Eigenschaft CE ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist ein stabiles ESI-Signal eine Voraussetzung für eine reproduzierbare metabolischen Profils Studien. Somit ist es wichtig, dass der Sprüher Spitze richtig vor dem MS Einlass positioniert ist. In diesem Set-up ist der ESI-Prozess in erster Linie abhängig von der Art des BGE und daher ist BGE Optimierung von entscheidender Bedeutung. Die sheathless Konfiguration ist weniger vielseitig im Vergleich zu hülsen Flüssigkeit CE-MS-Systemen, wo eine Vielzahl von Mantel-flüssigen Zusammensetzungen zugesetzt werden, um die Ionisationseffizienz zu verbessern. Die sheathless ESI Sprayer Nadel muss vollständig mit leitfähigen Flüssigkeit (dh BGE - Lösung) gefüllt werden. Eine instabile ESI-Signal von einem teilweise oder vollständig verstopft Kapillare führen kann. Spülen bei hohen Drücken mit BGE kann dieses Problem lösen. Anderenfalls muss die Trennkapillare ersetzt werden. Vor der Beurteilung der analytischen Leistung, ein stabiles ESI Hintergrundsignalsollte zuerst erzeugt wird, welche von einem Tag auf den anderen konsistent ist. Die analytische Leistungsfähigkeit des sheathless CE-MS-Methode für metabolischen Profils Studien muss geprüft werden täglich Metabolit Standardmischungen verwenden. Unter den gleichen experimentellen Bedingungen, konsistente Migrationszeiten, dh Variation unter 3% für within-Tag (n = 10) und zwischen-Tag (n = 5) 20 nl Injektion eines Metaboliten Standardmischung unter Verwendung von (12.5 uM), peak Höhen / Bereiche (Variation von weniger als 15%) und Bodenzahlen (im Bereich zwischen 60.000 und 400.000) sollte erhalten werden. Die Nachweisgrenzen im nanomolaren Bereich für die meisten Metaboliten Standards sein sollte. Nur wenn diese Kriterien erfüllt sind, ist die Methode bereit für metabolischer Profile von biologischen Proben. Wenn nicht, muss die MS Instrument abgestimmt werden und neu kalibriert oder die poröse Spitze kapillaren Emitter geändert werden muss. Eine wirksame Spülschritt zwischen CE-MS-Analysen ist von großer Bedeutung, nicht nur umPotentialverschleppung zu verhindern, sondern auch die Trennleistung zu erhalten. Potentialverschleppung kann mit der Probe und somit durch Ersatz mit neuen BGE Fläschchen gelöst kontaminiert durch BGE Fläschchen verursacht werden. Wenn die sheathless CE-MS-Verfahren nicht verwendet wird, ist es wichtig, die Trennkapillare zu trennen und die Einlaßseite der Kapillare in Wasser zu speichern und mit der Außenseite der Schutzhülle in einem Rohr untergetauchten Wasser enthält Kapillare Lebensdauer zu verlängern. Zusammenfassend zeigt die vorgeschlagene sheathless CE-MS-Methode ein starkes Potential für metabolische Profilierung von biologischen Proben, wenn sie gemäß den in diesem Protokoll angegeben verwendet. In diesem Stadium werden Interlabor-Vergleichsdaten auf jeden Fall erforderlich für sheathless CE-MS, um die (langfristige) Reproduzierbarkeit und Robustheit dieses Ansatzes für Metabolomik zu beurteilen. Dieses Protokoll kann eine solche Studie stimulieren. Verschiedene analytische Herausforderungen müssen noch berücksichtigt werden. Für eine optimale performance sollte der CE Strom vorzugsweise unter 5 &amp; mgr; A gehalten werden, und in diesem Stadium die kapillaren porösen Spitze Emitter nur auf einer Länge von 91 cm vorgesehen ist, welche die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays beeinträchtigen kann. Außerdem wurde ein niedriger pH Trennungspuffer für anionische Metabolic Profiling verwendet, der nicht der optimalste zum Erreichen einer Basislinientrennung von strukturell verwandten Zuckerphosphaten sein. Wichtig ist auch, dass nur anionische Metaboliten analysiert werden können, die (teilweise) negativ unter den verwendeten Trennbedingungen berechnet. Der nächste Schritt ist, wie es derzeit die Brauchbarkeit der sheathless CE-MS-Methode für klinische Studien metabolischen Profils zu bewerten, eine einzige poröse Spitze kapillaren Emitter nur für die Analyse von bis zu 100 biologischen Proben verwendet werden. Insgesamt Weiterentwicklung im sheathless CE-MS - Ansatz wird eine neue Richtung im Bereich der Metabolomics öffnen, dh zu einem tieferen Verständnis der biologischen Funktionen in sreichlich eingeschränkten Fällen.

In der zeitgenössischen Metabolomik, High - End - analytische Trennverfahren ein breites Spektrum von Metaboliten Klassen , um einen Vertreter zu erhalten zu analysieren Auslesen des physiologischen Status eines Organismus 1. Das ultimative Ziel einer Metabolomics-Studie ist eine Antwort auf eine bestimmte biologische / klinischen Fragestellung zu erhalten. Derzeit wird die Human Metabolome Datenbank von mehr als 40.000 Einträge Metaboliten enthalten repräsentieren sowohl endogene und exogene Verbindungen (letztere mit Ursprung aus Nährstoffen, Mikrobiota, Drogen und anderen Quellen) 2. In Anbetracht der großen Vielfalt in physikalisch-chemischen Eigenschaften und Konzentrationsbereich dieser Metaboliten, mehrere Analysetechniken mit unterschiedlichen Trennmechanismen verwendet werden, in Verbindung, um so viele Metaboliten wie möglich Profil in einer bestimmten biologischen Probe. Zum Beispiel Psychogios et al. Verwendeten eine Kombination von fünf analytische Trennverfahren für metabolische profe ling von humanem Serum , was zur Detektion von mehr als 4.000 chemisch unterschiedlichen Metaboliten 3. In diesem Papier wird die Aufmerksamkeit auf neu entwickelte CE-MS Strategien zur metabolischen Profils von biologischen Proben 4,5 bezahlt werden. In CE, spezifischer Kapillarzonenelektrophorese (CZE, normalerweise als CE bezeichnet), sind Verbindungen auf der Basis ihrer Ladung-zu-Größenverhältnis getrennt und daher diese analytische Technik ist sehr geeignet für die Analyse von polaren und geladenen Metaboliten. Der Trennmechanismus von CE ist grundsätzlich verschieden von chromatographischen basierte Techniken, wodurch eine komplementäre Sicht auf die metabolische Zusammensetzung von biologischen Proben 6-8 bereitstellt. Soga und Mitarbeiter waren die ersten , die Nützlichkeit der CE-MS für die weltweite Profilierung von Metaboliten in biologischen Proben 9,10 zu zeigen. Bis jetzt hat die Machbarkeit und Nützlichkeit der CE-MS für Metabolomik worden 11-15 weit unter Beweis gestellt.CE wird in der Regel über einen Mantel-Flüssigkeit zu MS gekoppelt Technik Schnittstelle 16,17; Jedoch aufgrund der Verdünnung des kapillaren Abstrom durch die Mantel-Flüssigkeit wird die Detektionsempfindlichkeit intrinsisch beeinträchtigt. Vor kurzem wurde gezeigt , dass die Verwendung einer sheathless Schnittstelle signifikant die Nachweis Abdeckung von Metaboliten verbessert , die in verschiedenen biologischen Proben im Vergleich mit CE-MS 5,18,19 eine klassische Mantel-Flüssig - Grenzfläche verwendet wird . Zum Beispiel, circa 900 molekularen Eigenschaften wurden in menschlichem Urin durch sheathless CE-MS detektiert , während etwa 300 molekularen Eigenschaften mit Mantel-Flüssig - CE-MS 5 beobachtet wurden. Die sheathless Schnittstelle verwendet wurde auf einer porösen Spitze Emitter basiert, die durch Moini 20, erfunden wurde , die effektive Nutzung des eigen niedrigem Fließeigenschaft von CE in Kombination mit nano-ESI-MS ermöglicht. Um die Verwendung von sheathless CE-MS im Bereich der Metabolomik zu stimulieren,ein Protokoll beschreibt dargestellt, wie dieser Ansatz für die Analyse von stark polaren Metaboliten in biologischen Proben verwendet werden, wie für die Analyse von Extrakten aus der Glioblastom-Zelllinie veranschaulicht. Es wird gezeigt, dass die sheathless CE-MS-Verfahren für die Profilierung von kationischen Metaboliten können auch für die Profilierung von anionischen Metaboliten genau die gleichen Kapillare und Trennungsbedingungen unter Verwendung verwendet werden, wodurch die Analysezeit reduziert und eine einzige Analyseplattform für die globale Profilierung der Bereitstellung berechnet Metaboliten. Das Protokoll beschreibt auch eine Strategie für die effektive Ausrichtung der sheathless poröser Spitze Emitter mit dem MS-Instrument.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI 8000 instrument</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">A98089</td>
			<td style="width:395px;">OptiMS adapter required to couple CESI to MS</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">OptiMS Fused-Silica Cartridge, 30 &#956;m ID x 90 cm total length</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B07363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CESI vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">B11648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro vials</td>
			<td style="width:167px;">Sciex</td>
			<td style="width:181px;">144709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">A6283</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Cationic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-3034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Anionic metabolite mixture</td>
			<td style="width:167px;">Human Metabolome Technologies</td>
			<td style="width:181px;">H3304-1031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Methanol (LC-MS Ultra Chromasolv)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">14262</td>
			<td>Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium hydroxide solution</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">72079</td>
			<td>0.1 M</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">U-87 MG Glioblastoma cell line</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td>89081402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:181px;">650498</td>
			<td>Toxic; use in fume hood</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sheathless capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry for metabolic profiling of biological samples

In Metabolomics wird für die weltweite Profilierung (endogen) Metaboliten in komplexen Proben eine Vielzahl von analytischen Techniken verwendet. In diesem Beitrag wird ein Protokoll für die Analyse von anionischen und kationischen Metaboliten in biologischen Proben durch Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie (CE-MS) präsentiert. CE ist gut geeignet für die Analyse von hochpolaren und geladenen Metaboliten als Verbindungen auf der Basis ihrer Ladung zu Grßenverhältnis getrennt sind. Eine kürzlich entwickelte sheathless Schnittstellenentwurf, dh ein poröser Spitze Schnittstelle zur Kopplung CE Elektrospray - Ionisation (ESI) MS verwendet. Diese Schnittstelle Ansatz ermöglicht die effektive Nutzung des eigen Low-Flow-Eigenschaft von CE in Verbindung mit MS, für ein breites Spektrum von polaren Metaboliten Klassen in Nanomol Nachweisgrenzen führt. Das Protokoll hier vorgestellten basiert einem nackten Fused-Silica-Kapillare mit einer porösen Spitze Emitters bei niedrigen pH-Trennbedingungen für die Analyse einer auf den Einsatzbreite Palette von Metabolitenklassen in biologischen Proben. Es wird gezeigt, dass die gleiche sheathless CE-MS-Methode kann für die Profilierung von kationischen Metaboliten verwendet werden, einschließlich Aminosäuren, Nukleoside und kleine Peptide oder anionische Metaboliten, einschließlich Zuckerphosphaten, Nukleotide und organische Säuren, indem nur die MS-Erfassungsschalt und Trennspannung Polarität. Hochinformationsreichen metabolischen Profilen in verschiedenen biologischen Proben, wie Urin, können Zerebrospinalflüssigkeit und Extrakte der Glioblastom-Zelllinie, die von diesem Protokoll in weniger als 1 h CE-MS-Analyse erhalten werden.

Die vorgeschlagene sheathless CE-MS - Methode ist in der Lage hocheffiziente Bereitstellung dh Plattennummern im Bereich von 60.000 bis 400.000, Profile für die anionische und kationische Metaboliten bei nanomolaren Nachweisgrenzen unter Verwendung von 10% Essigsäure (pH 2,2) als BGE. Die Trennleistung des Verfahrens für die Analyse von stark polaren anionischen Metaboliten für drei strukturell verwandten Zuckerphosphat - Isomeren (1) gezeigt. Obwohl eine Basislinientrennung nicht für diese drei Analyten erhalten wurde, ist eine teilweise Trennung ausreichend ihre selektiven Nachweis von MS zu ermöglichen, da diese Analyten exakt das gleiche Masse haben. Das Potential des sheathless CE-MS Methode zur metabolischen Profils der begrenzten Anzahl von Zellen, dh ein 20 nl Injektion entspricht 400 Zellen (Zelldichte etwa 20 Zellen / nl), wird für die Analyse der kationischen Metaboliten in einem Extrakt nachgewiesen der Glioblastom-Zelllinie (Abbildung 2), in denen mehr als 300 molekularen Eigenschaften über einem S / N-Verhältnis ≥ 5 detektiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig1.jpg" /> Abbildung 1. Analyse der Zucker - Phosphat - Isomeren durch sheathless CE-MS. Extrahiert Ion Elektropherogramm für drei Zucker - Phosphat - Isomere (25 &amp; mgr; M) , erhalten mit sheathless CE-MS im Negativ - Ionen - Modus. Versuchsbedingungen: BGE, 10% Essigsäure (pH 2,2); Trennspannung von -30 kV (+0,5 psi am Einlass der CE-Kapillare angelegt); Probeninjektions, 2,0 psi für 60 sec. Mit Genehmigung 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig2.jpg" /> Abbildung 2. Analyse von Isoleucin und Leucine durch sheathless CE-MS. Extrahierte Ionen - Elektropherogramm von zwei Aminosäure Isomeren (25 uM) , erhalten mit sheathless CE-MS in positiven Ionenmodus. Versuchsbedingungen: BGE, 10% Essigsäure (pH 2,2); Trennspannung, +30 kV; Probeninjektion, 2,0 psi für 60 sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54535/54535fig3.jpg" /> Abbildung 3. Potential von sheathless CE-MS zur Profilierung kationischen Metaboliten in einer Zelllinie Extrakt. Metabolic Profil (Gesamtionen Elektropherogramm) beobachtet in einem Extrakt eines Glioblastom - Zelllinie mit sheathless CE-MS im Positiv - Ionen - Modus. Versuchsbedingungen: BGE, 10% Essigsäure (pH 2,2); Trennspannung, +30 kV; Probeninjektions, 2,0 psi für 60 sec. 4 Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung </sup&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54535/54535fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Ein Protokoll zur metabolischen Profils von biologischen Proben mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie eine sheathless poröse Spitze Interface-Design unter Verwendung vorgestellt.

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

sheathless-capillary-electrophoresismass-spectrometry-for-metabolic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.6K Aufrufe.  Leiden University.  Ein Protokoll zur metabolischen Profils von biologischen Proben mittels Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie eine sheathless poröse Spitze Interface-Design unter Verwendung vorgestellt. 

Serie: Sheathless Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Forschung

Biochemie

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and isobaric labeling multiplexing capacity. Here, we introduce a deep-proteomics profiling protocol that combines 10-plex tandem mass tag (TMT) labeling with an extensive LC/LC-MS/MS platform, and post-MS computational interference correction to accurately quantitate whole proteomes. This protocol includes the following main steps: protein extraction and digestion, TMT labeling, 2-dimensional (2D) LC, high-resolution mass spectrometry, and computational data processing. Quality control steps are included for troubleshooting and evaluating experimental variation. More than 10,000 proteins in mammalian samples can be confidently quantitated with this protocol. This protocol can also be applied to the quantitation of post translational modifications with minor changes. This multiplexed, robust method provides a powerful tool for proteomic analysis in a variety of complex samples, including cell culture, animal tissues, and human clinical specimens.

We present a protocol to accurately quantitate proteins with isobaric labelling, extensive fractionation, bioinformatics tools, and quality control steps in combination with liquid chromatography interfaced to a high-resolution mass spectrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of redox-regulated signaling in biological settings. Electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR) is the only direct method to assess free radicals unambiguously. Its advantage is that it detects physiologic levels of specific species with a high specificity, but it does require specialized technology, careful sample preparation, and appropriate controls to ensure accurate interpretation of the data. Cyclic hydroxylamine spin probes react selectively with superoxide or other radicals to generate a nitroxide signal that can be quantified by EPR spectroscopy. Cell-permeable spin probes and spin probes designed to accumulate rapidly in the mitochondria allow for the determination of superoxide concentration in different cellular compartments.
In cultured cells, the use of cell permeable 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) along with and without cell-impermeable superoxide dismutase (SOD) pretreatment, or use of cell-permeable PEG-SOD,&#160;allows for the differentiation of extracellular from cytosolic superoxide. The mitochondrial 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) allows for measurement of mitochondrial ROS (predominantly superoxide).
Spin probes and EPR spectroscopy can also be applied to in vivo models. Superoxide can be detected in extracellular fluids such as blood and alveolar fluid, as well as tissues such as lung tissue. Several methods are presented to process and store tissue for EPR measurements and deliver intravenous 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin probe in vivo. While measurements can be performed at room temperature, samples obtained from in vitro and in vivo models can also be stored at -80 &#176;C and analyzed by EPR at 77 K. The samples can be stored in specialized tubing stable at -80 &#176;C and run at 77 K to enable a practical, efficient, and reproducible method that facilitates storing and transferring samples.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy is an unambiguous method to measure free radicals. The use of selective spin probes allows for detection of free radicals in different cellular compartments. We present a practical, efficient method to collect biological samples that facilitate treating, storing, and transferring samples for EPR measurements.

Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of the RNA produced during a brief period of labelling. This is done by attaching a biotin moiety to the incorporated thio group and affinity purifying, using streptavidin coated beads. Achieving a good yield of pure, newly synthesized RNA that is free of pre-existing RNA makes shorter labelling times possible and permits increased temporal resolution in kinetic studies. This is a protocol for very specific, high yield purification of newly synthesized RNA. The protocol presented here describes how RNA is extracted from the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the protocol for purification of thiolated RNA from total RNA should be effective using RNA from any organism once it has been extracted from the cells. The purified RNA is suitable for analysis by many widely used techniques, such as reverse transcriptase-qPCR, RNA-seq and SLAM-seq. The specificity, sensitivity and flexibility of this technique allow unparalleled insights into RNA metabolism.

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

The use of thiolated uracil to sensitively and specifically purify newly transcribed RNA from the yeast Saccharomyces cerevisiae.

Extrem schnelle und spezifische metabolische Kennzeichnung von RNA In Vivo mit 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

Etikettenfreier Immunpräzipitations-Massenspektrometrie-Workflow für großangelegtes Nuklear-Interactome-Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...