Wir möchten bitte Prof. Dr. Lothar Willmitzer für sein Engagement im Projekt, produktive Diskussionen und tolle Betreuung anerkennen. Wir sind dankbar, Dr. Daniel Veyel für die Hilfe bei Proteomik-MS-Messungen. Wir schätzen Frau Änne Michaelis, die uns wertvolle technische Hilfe mit LC-MS-Messungen. Darüber hinaus möchten wir Dr. Monika Kosmacz und Dr. Ewelina Sokołowska für ihre Hilfe und Beteiligung an der Arbeit auf dem Originalmanuskript und Weronika Jasińska für technische Unterstützung zu danken.

<ol>
	<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+as+global+regulators:+A+new+view+of+protein+regulation.">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li><li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch.">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, M. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUBAcon:+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome.">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li><li>Katajamaa, M., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics.">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STITCH+5:+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data.">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li><li>Tanaka, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells.">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li><li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+A+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li><li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity.">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorgestellte Protokoll ermöglicht parallele Identifikation von PP und PM-komplexe an ein Zielprotein. Von Klonen zur endgültigen Ergebnisse, kann das Experiment in weniger als 8 bis 12 Wochen abgeschlossen werden. Komplette AP dauert ca. 4-6 h für eine Gruppe von 12 bis 24 Proben, Rendern unser Protokoll für mittleren Durchsatz Analyse geeignet.
Das Protokoll, trotz insgesamt einfach, hat eine Reihe von kritischen Schritte. (i) ausreichende Menge an input Protein und Affinität Perlen ist entscheidend für einen dynamischen Bereich von Metaboliten Erkennung zu erreichen. Effiziente Zelle Lysis ist daher ein entscheidender Schritt im Verfahren. Armen Protein Erträge können eine Folge der unzureichenden Pulverisierung des Materials oder der suboptimalen Lyse-Puffer/Material-Verhältnis sein. (Ii) Vorsicht geboten, dass die verwendeten Reagenzien MS-freundlich sind. Starke Reinigungsmittel, Glycerin oder übermäßige Mengen von Salz sollte vermieden werden, da sie mit MS-Detektion stören. (Iii) Agarose Korne sollte nicht über getrocknete während Waschschritte, und bei Vakuum vielfältige Verwendung ist es wichtig, einen langsamen Durchfluss um nicht zu zerstören die Perlen oder beeinflussen Komplexstabilität anzuwenden.
Es gibt einige wichtigen möglichen Änderungen des vorliegenden Protokolls: (i) Wir verwenden die konstitutive CaMV35S Promotor Köder Eiweißmenge zu maximieren. Überexpression, kann zwar sehr nützlich, ernsthafte Auswirkungen auf Zelle Homöostase28 haben und führen zur Bildung von physiologisch irrelevant Interaktionen. Ausdruck der tagged Proteine mit native Promotoren und wo möglich in einem Verlust der Funktion zum Abrufen der wahre biologische Interaktoren überlegen ist. Für Proteine, die normalerweise nicht in pflanzlichen Zellkulturen ausgedrückt könnte ein Pflanze Hintergrund notwendig, um relevante Interaktoren identifizieren. (Ii) bei der Arbeit mit Membranproteine muss der Lyse Puffer mit einer MS-kompatible Reinigungsmittel ergänzt werden. (Iii) Einführung eines zweiten Affinitätsreinigung Schritts Fehlalarme wahr-positive Verhältnis verbessern und beseitigen die Notwendigkeit für EV Steuerelemente29. Ein neuartiger Tandem-Tag mit zwei unabhängigen Protease-spaltstellen stellt eine attraktive Alternative zu der Größe-Ausschluss Chromatographie Schritt hinzugefügt von Maeda Et Al. 201411, das ist mühsam und zeitaufwendig.
Der schwerwiegendste Nachteil des AP ist die hohe Rate falsch positiver Ergebnisse. Die Gründe sind zahlreich. Konstitutive Überexpression wurde bereits erwähnt. Eine weitere Quelle für physiologisch irrelevant Interaktionen ist, wenn Arbeit mit isolierten Organellen, Vorbereitung der gesamten Zelle Lysates mit Mischungen von Proteinen und Metaboliten aus verschiedenen subzelluläre Kompartimente. Subzelluläre Lokalisation sollte für wahre Interaktoren Filtern verwendet werden. Dennoch ergeben sich die Mehrheit der Fehlalarme durch unspezifische Bindung zwischen Proteinen und Agarose Harze. Einführung einer zweiten Reinigungsstufe, wie oben beschrieben, bietet die beste Lösung für das Problem, geht jedoch auf Kosten der Zeit und Durchsatz. Darüber hinaus können schwächere Interaktion verloren gehen, da das Protokoll verlängert. Ein weiterer Nachteil von AP ist, dass trotz der umfassenden bereitgestellten Informationen über die Interaktom an ein Zielprotein, Unterscheidung zwischen direkten und indirekten Ziele des eifrigen Proteins unmöglich. Gezielte Bimolekulare Ansätze sind notwendig, um Interaktionen zu bestätigen.
AP in Verbindung mit MS-basierte Metabolomik wurde verwendet, um Proteinkomplexe in S. Cerevisiae12. zu studieren Dieser Arbeit, zusammen mit unseren früheren Beobachtung13 , dass ähnlich, Lipide, polar und semi-polare Verbindungen isoliert von zellulären Lysates Proteinkomplexe gebunden bleiben vorgesehen konzeptionelle Vorarbeit für die vorgestellten Protokoll. Unser Protokoll zeichnet sich durch drei einzigartige Punkte: (i) im Gegensatz zu der Hefe arbeiten12, es zeigt, dass AP geeignet für das Abrufen von nicht nur wasserabweisend, aber auch hydrophile Protein Liganden. (Ii) durch die Einführung eines drei-in-One-Extraktion-Protokolls, ist eine einzelne AP einsetzbar, Proteinen und Metaboliten Interaktoren des Proteins Köder zu studieren. (Iii) Wir haben das Protokoll zur Pflanzenzellen angepasst.
Zukünftige Bemühungen konzentrieren sich auf einen neuartige Tandem-Tag mit zwei unabhängigen Protease-spaltstellen erstellen. Wir würden auch gerne Eignung des Protokolls zu niedrig-Fülle kleine Moleküle wie pflanzlichen Hormonen zu erkunden.

Hier beschriebenen Methode zielt auf die Identifizierung von Metaboliten und Protein Partnern eines Proteins der Wahl in den zellulären lysate Bedingungen in der Nähe vonin-Vivo . Es wurde spekuliert, dass viele weitere Metaboliten als heute charakterisiert eine wichtige regulatorische Funktion1. Metaboliten fungieren als biologische Schalter, verändern die Aktivität, die Funktionalität sowie die Lokalisierung ihrer Rezeptor Proteine2,3,4. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere bahnbrechende Methoden, die Identifizierung des PMI in Vivo oder in nahe -in-Vivo -Bedingungen ermöglichen entwickelten5. Verfügbaren Ansätze können in zwei Gruppen aufgeteilt werden. Die erste Gruppe umfasst Techniken, die mit einem bekannten-Metabolit Köder zu starten, um neues Protein Partner zu fangen. Methoden umfassen Affinität Chromatographie6, Medikament Affinität reagiert Ziel-Stabilität Assay7, Chemo-Proteomics8und thermische Proteom Profilerstellung9. Die zweite Gruppe besteht aus einer einzigen Methode, die mit einem bekannten Protein beginnt um kleine Molekül Liganden10,11zu identifizieren.
AP in Verbindung mit MS-basierte Lipidomics wurde zum Analysieren der Protein-Lipid-komplexe in Saccharomyces Cerevisiae12. Als Ausgangspunkt die Autoren verwendeten Hefestämme mit dem Ausdruck 21 Enzyme Ergosterin-Biosynthese beteiligt und 103 Kinasen verschmolzen zu einem Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) Tag. 70 % der Enzyme und 20 % von der Kinasen fanden sich verschiedene hydrophobe Liganden, Licht in das komplizierte Protein-Lipid-Interaktion-Netz zu binden.
Bisher konnten wir nachweisen, dass ähnlich wie Lipide, polar und semi-polare Verbindungen auch Proteinkomplexe isoliert von der zellulären Lysates13verpflichtet bleiben. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wir beschlossen, die AP optimieren Methode vorher10,11 für Pflanzenzellen und hydrophilen Verbindungen14veröffentlicht. Zu diesem Zweck haben wir TAP Vektoren von Van Leene Et Al. 2010, erfolgreich im Einsatz im Werk PPI Studien15beschrieben. Um den Zeitaufwand zu transgenen Linien zu verkürzen, haben wir uns entschieden auf Arabidopsis Zellkulturen. Wir Beschäftigten eine einstufige Methyl- Tert-Butyl-Ether, (MTBE) / Methanol/Wasser Extraktions-Verfahren, so dass die Charakterisierung von Proteinen (Pellet), Lipide (organische Phase) und hydrophilen Metaboliten (wässrige Phase)16 in einem einzigen Affinitätsreinigung Experiment. EV-Steuerleitungen wurden eingeführt, um Fehlalarme, z.B. Proteine binden an dem Tag allein auszuschließen. Als Proof of Concept wir markiert drei (von fünf) Nukleosid Diphosphat Kinasen präsentieren in Arabidopsis Genom (NDPK1-NDPK3). Unter anderem Erkenntnisse konnten wir nachweisen, dass NDPK1 mit Glutathion S interagiert-Transferase und Glutathion. Folglich konnten wir beweisen, dass Glutathionylation14NDPK1 ausgesetzt ist.
Zusammenfassend lässt sich sagen, die vorgestellte Protokoll ist ein wichtiges Werkzeug zur Charakterisierung von Protein-Protein und Protein-Small-Molecule Interaktion Netze und stellt einen großen Fortschritt gegenüber bestehenden Methoden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64 protease inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AcTEV Protease</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>12575015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#160;Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-101595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>V5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>138906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>136806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>232106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>12006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>202341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>69141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unimax 2010 Platform Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>5421002000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &#181;M, thickness 55 &#181;M, open area 14%)</td>
			<td>Prosepa</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td>
			<td>Restek</td>
			<td>KT953751-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &#181;M Pes St</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>514-0340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 400</td>
			<td>Retsch GmbH</td>
			<td>207450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0969-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobicol &#34;&#34;Classic&#34;&#34; with 2 different screw caps without filters</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (small) 35 &#181;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &#38; M1053</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary dishes for rotators SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y555.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td>
			<td>Restek&#160;</td>
			<td>26080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td>
			<td>Teknokroma</td>
			<td>TR-F034000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler&#160;Vials</td>
			<td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&#246;r</td>
			<td>40 11 01 740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>LC120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &#181;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>186003533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>RK 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genedata Expressionist</td>
			<td>Genedata</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>NaN</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

Zelluläre Prozesse werden durch Wechselwirkungen zwischen biologischen Molekülen wie Proteinen, Metaboliten und Nukleinsäuren geregelt. Während die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) keine Neuheit ist, bilden experimentelle Ansätze mit dem Ziel, endogene Protein-Metabolit Interaktionen (PMI) charakterisieren eine relativ neue Entwicklung. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das gleichzeitige Charakterisierung der PPI und PMI eines Proteins Wahl, bezeichnet als Köder erlaubt. Unser Protokoll wurde optimiert für Arabidopsis Zelle Kulturen und Affinitätsreinigung (AP) kombiniert mit der Massenspektrometrie (MS)-basierte Erkennung von Protein und Metaboliten. Kurz gesagt, sind transgene Arabidopsis-Linien, mit dem Ausdruck Köder Protein verschmolzen zu einem Affinität-Tag zunächst lysiert, um eine native zellulären Extrakt zu erhalten. Anti-Tag Antikörper werden verwendet, um die pull-down-Protein und Metabolit Partner des Proteins Köder. Die Affinität gereinigt-komplexe werden extrahiert, mit einer One-Step-Methyl- Tert-Butyl-Äther (MTBE) / Methanol/Wasser-Methode. Während Metaboliten in der polaren oder hydrophoben Phase zu trennen, können Proteine in das Pellet enthalten. Metaboliten und Proteine werden dann von Ultra-Performance liquid Chromatography-Massenspektrometrie (UPLC-MS oder UPLC-MS/MS) analysiert. Leer-Vektor (EV) Steuerleitungen werden verwendet, um Fehlalarme auszuschließen. Der große Vorteil unserer Protokoll ist, dass es ermöglicht die Identifizierung von Proteinen und Metaboliten Partnern ein Zielprotein parallel in der Nähe von physiologischen Bedingungen (Mobilfunk lysate). Die vorgestellte Methode ist einfach, schnell und leicht an biologische Systeme als Pflanze Zellkulturen angepasst werden kann.

In der ursprünglichen Studie wurden drei A. Thaliana NDPK Gene in Zellkulturen Aussetzung PSB-L unter der Kontrolle der konstitutiven 35 s-Promoter14 (Abbildung 1) überexprimiert. Tandem-Affinität-Tag war an entweder Carboxy oder amino-terminalen Ende eines Köder-Proteins fusioniert. Die komplexe Affinität gereinigt wurden MTBE/Methanol/Wasser-Extraktion16unterzogen. Affinität zog Proteinen und kleinen Molekülen wurden mit MS (Tabellen S2 und S3) identifiziert.
Um Fehlalarme zu beheben, wurden leere Proben verwendet, um kleine Molekül Verunreinigungen aus der Chemie- und Labor-Verbrauchsmaterialien auszuschließen. Darüber hinaus wurden Metaboliten und Proteine, die entweder einen Affinität Tag binden oder Harz allein entfielen mit EV Steuerleitungen. Zum Abrufen von wahren positiven, zweiseitige nicht gepaart Schülers t-Test und Benjamini & Hochberg false Discovery Rate wurde Korrektur angewandt, um Metaboliten (Tabelle S4) und Proteine (Tabelle S5) wesentlich bereichert, in der NDPKs AP zu identifizieren Experimente (N - und C-Terminal NDPKs markiert) im Vergleich zu den EV-Steuerleitungen (FDR < 0,1). Beachten Sie, dass in den früheren arbeiten wir Abwesenheit/Präsenz Kriterien, Protein und kleine Molekül Interaktoren abzugrenzen.
Repräsentative Ergebnisse erhalten für NDPK1, während auf Dipeptide, einer neuartigen Klasse der kleinen Molekül Regulierungsbehörden studierte in unserer Gruppe Metabolit Daten konzentrieren. Proteomic Analyse ergab 26 vermeintliche Protein-Partner des NDPK1. Durch weitere Filterung für Proteine, die gemeinsam im selben subzelluläre Raum als NDPK1 lokalisiert (Zytosol), die Liste verengt sich auf 13 mutmaßliche Protein Interaktoren. Unter den identifizierten Proteine waren Glutathion S-Transferase, zwei Dehnung Einleitung Faktoren, Tubulin und aconitate Hydratase. Metabolomic Analyse ergab vier Dipeptide Val-Leu, Ile-Glu Leu-Ile und Ile-Phe, die speziell Co eluiert mit NDPK1 (Abbildung 2). Beachten Sie, dass alle vier Dipeptide einen hydrophoben Rest in ihrem N-Terminus, was auf gemeinsame verbindliche Spezifität teilen.
Suchen Sie nach bekannten Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe wir identifiziert abgefragten 13 Proteine und vier Dipeptide gegen den Stich Datenbank25 (Abbildung 3). Mehrere Beobachtungen gemacht werden könnte: (i) keines der interagierenden wurde zuvor für NDPK1 gemeldet. (Ii) APX1 Ortholog wurde berichtet, dass Aldehyde Dehydrogenase Familienmitglied ALDH7B4, während der Einleitung Übersetzungsfaktor FBR12 mit einer anderen Übersetzung Einleitung Faktor kodiert durch das Gen AT2G40290 interagieren. (Iii) die identifizierten Dipeptide haben kein Protein Partner berichtet. Co eluierten Dipeptide wurden früher als alle abgerufenen pflanzlichem Eiweiß verbunden nicht gemeldet. Allerdings spielen sie eine wichtige Rolle in anderen Organismen: Leu-Ile, z. B.hat eine Neurotrophin-aktivierende Wirkung in einer menschlichen Zelle Zeile26. Beachten Sie, dass das Experiment nicht erlaubt die genaue Topologie des Systems zu identifizieren. Zum Beispiel ein Dipeptid kann direkt mit NDPK1 interagieren aber kann auch im Zusammenhang mit einem der Co gereinigter Proteine.
Zusammen genommen, unsere Ergebnisse zeigen, dass das festgelegte Verfahren, Einsatz von AP zusammen mit Massenspektrometrie, erleichtert die Identifizierung von Protein-Protein und Protein-Small-Molecule Interaktoren und hilft umfassende Informationen über generieren die Interaktom des Zielproteins.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Abbildung 1: Schema des AP-MS-Workflow. (A) Vorbereitung einer native lösliche Fraktion aus pflanzlichen Zellkultur. (B) die nächsten Schritte in der AP-Prozedur. Nach dem Laden der Probe auf die Säule, bindet das Protein von Interesse (POI) verschmolzen zu einem TAP-Tag an der IgG-Antikörper auf die Agarose-Perlen immobilisiert. Waschen der Spalte erleichtert die Entfernung von ungebundenen Proteinen und Metaboliten. Nach der Durchführung entwicklelt Spaltung, sind POI Protein-Metabolit komplexe eluiert. (C) Trennung von komplexen in Protein und Metabolit Fraktion gefolgt von semi-quantitativen MS-Analyse. Teil dieser Figur wird von Luzarowski Et Al. 201714wiedergegeben. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Abbildung 2: Dipeptide speziell Co eluierenden mit NDPK1. Durchschnittliche Intensität von vier Dipeptide Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)und Ile-Phe (D) in AP Experiment gemessen wurden aufgetragen. Alle vier Dipeptide zeigen deutliche Bereicherung in NDPK1 Proben im Vergleich zur Kontrolle der EV (Sternchen darstellen FDR < 0,1). Fehlerbalken darzustellen Standardfehler für 6 Messungen (3 Wiederholungen von N- und C-Terminal 3 markiert Proteine). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Abbildung 3. Interaktion-Netzwerk aller Moleküle zusammen mit NDPK1, eluierenden abgefragt gegen Stich-Datenbank unter Berücksichtigung nur frühere experimentelle und Datenbank Beweise (Vertrauen > 0,2). Mehr Zuversicht zeigt höhere Chancen von Interaktion und errechnet sich anhand der hinterlegten Daten. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Tabelle S1. MaxQuant output-Tabelle "parameters.txt". Tabelle enthält Grenzwerte für die Identifizierung und Quantifizierung sowie Informationen über die verwendeten Datenbanken. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S2. Ausgabe von Informationen aus MaxQuant Tabelle "proteinGroups.txt". Tabelle enthält eine Liste aller identifizierten Protein Gruppen, Intensitäten und zusätzliche Informationen wie Anzahl der einzigartigen Peptide und Partitur. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S3. Ausgabedatei, die Analyse der polaren Metaboliten. Tabelle enthält eine Liste aller identifizierten Masse Features zeichnet sich durch spezifische m/Z, RT und Intensität. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S4. Dipeptide in AP Proben gefunden, in denen NDPK1, NDPK2 oder NDPK3 als Köder verwendet wurden. Dipeptide im leeren Proben wurden aus der Liste ausgeschlossen. Zwei unabhängige Linien (gekennzeichnet in beiden N - oder C-Terminus) für jede NDPK wurden in dreifacher Ausführung ausgeführt. Schülers t-test und weitere Korrektur der p-Wert mit Benjamini & Hochberg Methode wurden verwendet, um deutlich bereichert interactor Partner des NDPKs zu bestimmen (FDR < 0,1). ΔRT errechnet sich in Bezug auf die Referenzverbindungen und Δppm in Bezug auf die Monoisotopic Masse in Metlin27gegeben gegeben. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Tabelle S5. Proteine, die gemeinsam mit NDPK1 gereinigt. Zwei unabhängige Linien (gekennzeichnet in beiden N - oder C-Terminus) für jede NDPK in dreifacher Ausfertigung ausgeführt wurden. Schülers t-test und weitere Korrektur der p-Wert mit Benjamini & Hochberg Methode wurden verwendet, um deutlich bereichert interactor Partner des NDPKs zu bestimmen (FDR < 0,1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

2-1-one-step-affinity-purification-for-parallel-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.2K Aufrufe.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

Serie: 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other fields. For instance, trehalose analogues bearing detectable tags have been used to detect Mycobacterium tuberculosis and may have applications as tuberculosis diagnostic imaging agents. Hydrolytically stable versions of trehalose are also being pursued due to their potential for use as non-caloric sweeteners and bioprotective agents. Despite the appeal of this class of compounds for various applications, their potential remains unfulfilled due to the lack of a robust route for their production. Here, we report a detailed protocol for the rapid and efficient one-step biocatalytic synthesis of trehalose analogues that bypasses the problems associated with chemical synthesis. By utilizing the thermostable trehalose synthase (TreT) enzyme from Thermoproteus tenax, trehalose analogues can be generated in a single step from glucose analogues and uridine diphosphate glucose in high yield (up to quantitative conversion) in 15-60 min. A simple and rapid non-chromatographic purification protocol, which consists of spin dialysis and ion exchange, can deliver many trehalose analogues of known concentration in aqueous solution in as little as 45 min. In cases where unreacted glucose analogue still remains, chromatographic purification of the trehalose analogue product can be performed. Overall, this method provides a &#34;green&#34; biocatalytic platform for the expedited synthesis and purification of trehalose analogues that is efficient and accessible to non-chemists. To exemplify the applicability of this method, we describe a protocol for the synthesis, all-aqueous purification, and administration of a trehalose-based click chemistry probe to mycobacteria, all of which took less than 1 hour and enabled fluorescence detection of mycobacteria. In the future, we envision that, among other applications, this protocol may be applied to the rapid synthesis of trehalose-based probes for tuberculosis diagnostics. For instance, short-lived radionuclide-modified trehalose analogues (e.g., 18F-modified trehalose) could be used for advanced clinical imaging modalities such as positron emission tomography-computed tomography (PET-CT).

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Schnelle Ein-Schritt-enzymatische Synthese und All-wässrige Reinigung von Trehalose Analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Forschung

Biochemie

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Ein G-Quadruplex-DNA-Affinität Ansatz zur Reinigung von enzymatisch aktiven G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Affinitätsreinigung der Chloroplasten Translocon Proteinkomplexe mit dem TAP-Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

Einzelschritt-Reinigung der makromolekularen komplexe mit RNA an Biotin und ein Foto-spaltbaren Linker befestigt

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...