Herstellung von siRNA-beladenen Lipid-Nanopartikeln mit einem mikrofluidischen Gerät

Die Größe der Lipid-Nanopartikel beeinflusst die Bioverteilung, den Anti-Tumor-Effekt und die Gen-Silencing-Leistung. Daher ist die LNP-Größenkontrollmethode eine effektive Technik zur Herstellung von Nanoarzneimitteln, einschließlich RNA-Abgabesystemen. Dieses ursprüngliche mikrofluidische Gerät, das als iLiNP-Gerät bezeichnet wurde, war in der Lage, die LNP-Größe von 20 bis 100 Nanometern in 10 Nanometer-Intervallen zu kontrollieren.

Das iLiNP-Gerät kann nicht nur siRNA-beladene LNPs produzieren, sondern auch mRNA-beladene LNPS und Ribonukleoprotein-geladene LNPs. Nehmen Sie zunächst die Lipidethanollösungen und produzieren Sie die siRNA-beladenen LNPs, indem Sie DOTAP-, DSPC-, Cholesterin- und DMG-PEG2k-Lösungen in einem molaren Verhältnis von 50 zu 10 zu 38,5 zu 1,5 mischen. Stellen Sie die Gesamtlipidkonzentration auf acht Millimolar ein.

Dann nehmen Sie die wässrigen Lösungen von 154 Millimol-Kochsalzlösung und 25 Millimolar-Acetatpuffer bei pH 4 und filtern Sie sie durch 0,2 Mikrometer Membranfilter oder Spritzenfilter. Bereiten Sie die siRNA-Pufferlösung vor, indem Sie 70 Mikrogramm siGL4 in einen Milliliter mit 25 Millimolaracetatpuffer auflösen. Füllen Sie eine Milliliter Glasspritze mit Lipid- bzw. wässrigen Lösungen.

Verbinden Sie die Glasspritzen mit Hilfe von Spritzenverbindern mit den Peak-Kapillaren, stellen Sie dann die Durchflussrate der Lipid- und wässrigen Lösungen ein und führen Sie die Lipid- und wässrigen Lösungen separat mit Hilfe von Spritzenpumpen in das iLiNP-Gerät ein. Sammeln Sie die LNP-Suspensionen in einem Mikroröhrchen aus dem Auslass des iLiNP-Geräts. Dialysieren Sie die LNP-Suspension mit einer Dialysemembran von 12 bis 14 KiloDalton Molekulargewichtsgrenzen bei vier Grad Celsius über Nacht gegen Kochsalzlösung oder DPBS für POPC-LNPs bzw. siRNA-beladene LNPs.

Sammeln Sie die dialysierten LNP-Suspensionen in Mikroröhrchen und pipetieren Sie dann 20 bis 30 Mikroliter der LNP-Suspension zu einer Mikroquarzzelle. Messen Sie schließlich die LNP-Größe, die LNP-Größenverteilung und den Polydispergierindex durch dynamische Lichtstreuung. Die POPC-LNP-Größenverteilung, die unter verschiedenen Durchflussbedingungen erzeugt wird, z. B. der Gesamtdurchfluss und die Durchflussratenverhältnisse, sind hier dargestellt.

Präzise LNP-Größen von 20 bis 100 Nanometern können mit diesem iLiNP-Gerät gesteuert werden. Kleine LNPs werden bei hohen Gesamtdurchflussbedingungen gebildet. Darüber hinaus sind die LNP-Größen, die bei der FRR 5 gebildet werden, unabhängig von der Gesamtdurchflussrate kleiner als die der FRR 3.

Die Größenverteilung von siRNA-beladenen LNPs ist hier dargestellt. siRNAs werden durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem kationischen Lipid DOTAP und den negativ geladenen siRNAs in die LNPs eingekapselt. Das iLiNP-Gerät produzierte 90 Nanometer siRNA-beladene kationische LNPs mit einer engen Verteilung.

Die siRNA-Verkapselungseffizienz betrug 95% aufgrund der elektrostatischen Wechselwirkung zwischen dem kationischen Lipid und den negativ geladenen siRNAs. Die Zytotoxizität und die Gen-Silencing-Aktivität der 19 Nanometer-siRNA-beladenen LNPs wurden bewertet. siRNA-beladene LNPs zeigten Zytotoxizität bei einer Dosis von 10 bis 100 nanomolarer siRNA.

Das Expressionsniveau der Luciferase war in Abhängigkeit von der siRNA-Konzentration erniedrigt. Die siRNA-geladenen LNPs unterdrückten 80% Luciferase-Expression bei einer Dosis von 100 nanomolarer siRNA. Optimierungen der Strömungsverhältnisse sind die wichtigsten Schritte im Protokoll, um die gewünschte LNPs-Größe zu erhalten.

Die mikrofluidische LNP-Produktionsmethode einschließlich des iLiNP-Geräts erfordert kein kompliziertes Verfahren und wird voraussichtlich als Standard-LNP-Produktionsmethode eingesetzt.