Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.

1. Sammeln und Prozesswasserprobe (Modified von Escher et al. 9) <ol><li> Füllen Sie eine saubere 1 L Braunglasflasche mit 1 g Natriumazid und 50 mg Ascorbinsäure an die Spitze mit Wasserprobe von Interesse. Store Probe bei 4 ° C und Verfahren innerhalb von 72 Std. HINWEIS: Natriumazid ist sehr giftig und müssen mit Vorsicht behandelt werden. Verwenden Sie Schutzkleidung (Schutzbrille / Gesicht, Handschuhe, Kleidung) und wiegen in einem ordnungsgemäß funktionierenden Dunstabzugshaube. Verwenden Sie keine Metallspachtel zum Wiegen verwenden. </li><li> Übergeben, die Probe durch einen 1,6 um-Glasfaserfilter und dann durch eine vorkonditionierte Festphasenextraktion (SPE) Patrone mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5-10 ml / min. Einzustellen, den Druck der Vakuumpumpe die Durchflussrate zu steuern. </li><li> Vakuum-Trocknen Sie die Patrone für 15 min. </li><li> Eluieren die Patrone mit 10 ml Methanol, gefolgt von 10 ml Aceton: Hexan (1: 1, v / v). </li><li> Konzentrat Eluat ~ 1 ml unter einem leichten Strom von hochreinem Stickstoff. LösungsmittelAustausch von 500 ul Dimethylsulfoxid Zugabe (DMSO) und der Extrakt bis zu 500 &amp; mgr; l verdampft. </li><li> Bringen Sie den Extrakt zu einem bernsteinfarbenen Glasautosamplergefäß. Lagerung bei -20 ° C. </li></ol> 2. Bereiten Sie Verdünnungen der Test Spezifische Referenz Chemische und Wasserextrakt <ol><li> Bereiten 9 Verdünnungen für die Eichkurve. <ol><li> Machen Sie eine Stammlösung des Assays spezifischen Referenzsubstanz in 100% DMSO. Die endgültige Konzentration muss 2 uM 17β-Östradiol für die ER-Test sein, und 100 &amp; mgr; M Dexamethason für den GR-Test. Bewahren Sie die Stammlösungen bei -20 ° C. </li><li> In 15 ul der geeigneten Referenz chemischen Bestand auf 285 &amp; mgr; l Assay-Medium in einem sterilen Röhrchen (Röhrchen # 1). Mischen Sie die Probe durch Pipettieren von oben und unten. </li><li> In 200 ul einer Lösung von 5% DMSO in Testmedium in 8 zusätzliche Rohre (Rohre # 2-9). </li><li> Übertragen einer 100-ul-Aliquot von Rohr # 1 bis # Rohr 2 durch Wannee # 9 mit einer 3-fach-Verdünnungsreihe durchzuführen. Jede verdünnte Probe muss gründlich mit einer Pipette gemischt werden, bevor eine aliquote Menge zu nehmen und es auf die nächste Röhre hinzugefügt wird. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine Lösungsmittelkontrollprobe von 10 ul DMSO in 190 &amp; mgr; l Assay-Medium gemischt wird. </li><li> Bereiten Sie vier Verdünnungen für jeden Wasserextrakt. <ol><li> In der ersten Röhre, fügen Sie 5 ul Wasser-Extrakt in 95 &amp; mgr; l Assay-Medium und gründlich mischen. In 50 ul 5% DMSO in Testmedium in drei anderen Rohren. </li><li> Durchführen einer 2-fachen Verdünnung von 50 ul Lösung von einem Rohr zum nächsten übertragen. </li></ol></li></ol> 3. Bereiten Sie die Zellsuspension, die FRET-Bioassay Conduct <ol><li> Bereiten Sie den Test spezifischen Medium gemäß den Anweisungen des Herstellers. Assaymedium muss bei 4 ° C gelagert werden und erwärmt auf 37 ° C in einem Wasserbad vor dem Gebrauch. </li><li> Nehmen Sie ein Fläschchen mit ER oder GR Division-arretierten Zellen aus dem Kryo-freizer und schnell die Zellen auftauen durch das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten unter leichtem Schütteln platzieren. Dekontaminieren Fläschchen mit 70% Ethanol und legen Sie es in der Klasse II biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> Öffnen Sie das Fläschchen unter aseptischen Bedingungen und übertragen Sie die Zellen in 10 ml Testmedium. </li><li> Zentrifuge bei 200 x g für 5 min. </li><li> Den Überstand aspirieren eine sterile Glaspipette verwendet und das Zellpellet in 6 ml Assaymedium zu resuspendieren. </li><li> Mischen Sie 5 ul der Zellsuspension mit 5 ul einer Vitalfärbung Lösung und fügen Sie einen aliquoten in einer Zählkammer. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen unter Verwendung eines Lichtmikroskops oder automatisierten Zellzähler und schätzen Sie die Dichte der lebenden Zellen in der Zellsuspension. Verdünnen, wenn notwendig, eine Enddichte von 550.000 lebende Zellen pro ml Assay-Medium zu erhalten. </li></ol> 4. Platte Zellen in einer 96-Well-Black Wall Clear-Bodenplatte und hinzufügen verdünntem Wasserextrakt <ol><li> Erstellen Sie eine PlatteLayout, das über einen 9-Punkt-Test spezifische Kalibrierungskurve, QA / QC-Proben und mehrere Verdünnungen für jeden Wasserextrakt enthält. Ein Beispiel einer 96-Well - Platte Layout ist in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> In 90 ul Testmedium auf die Replikation zellfreie Kontrollvertiefungen. </li><li> Gießen Sie die Zellsuspension in einem sterilen Pipettieren Reservoir und fügen Sie 90 ul der Zellsuspension in den anderen Vertiefungen einer Mehrkanalpipette verwenden. </li><li> In 10 ul der verdünnten Proben während der Stufe 2 in die entsprechenden Vertiefungen vorbereitet. Die Endkonzentration von DMSO pro Napf muß maximal 0,5% sein. </li><li> Die Platte mit einem Deckel und legen Sie sie in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 16 Stunden. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54725/54725fig1.jpg" /> Abb . 1: Beispiel einer 96-Well - Platte Layout Das Multi-Well - Platte wird entwickelt , um eine Assay - spezifische Kalibrierkurve umfassen 3 Typenvon QA / QC-Kontrollen (nur Medien, Zellen in einem sauberen Medium und Zellen in DMSO versetzt Medium) und 4 Verdünnungen pro Wasserextrakt. Für jede Kontrolle und Verdünnung von Wasserextrakt in drei Vertiefungen analysiert wird. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54725/54725fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54725/54725fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 5. Bereiten Sie die Lade-Lösung und werden in jedes Well <ol><li> Nach der Inkubation ermöglichen die Platte auf RT äquilibrieren. Zu diesem FRET-Bioassay, werden die Schritte 5.2 bis 5.6 sollte in Abwesenheit von direktem Licht durchgeführt werden. </li><li> Bereiten Sie eine 6-fachem Beladungslösung nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> In 20 ul der 6-fachem Beladungslösung in jede Vertiefung. </li><li> In 10 ul der Lebensfähigkeit der Zellen Reagens in jede Vertiefung der Zytotoxizität des verdünnten Wasserextrakt zu bewerten. </li><li> Verschließen Sie die Platte mit Aluminiumklebefolie. </li><li> Die Platte im Dunkeln bei RT für 2 Stunden. </li></ol> 6. Messen Zytotoxizität und endokrine Aktivität Antwort <ol><li> Stellen Sie den Mikroplatten-Reader mit einer Bottom-Lesefähigkeiten bis nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Für die FRET-Trans Bioassay messen Fluoreszenz im blauen (409/460 nm Anregung (Ex) / Emission (Em) Wellenlänge) und Grün (409 Ex / 530 Em nm) Kanäle. </li><li> Für den Zytotoxizitätstest messen Fluoreszenz bei 560 Ex / 590 Em nm. </li></ol> 7. Beurteilen Sie QA / QC überprüft die Qualität der Daten zu bestimmen <ol><li> Vergleichen Sie die durchschnittliche rohen Fluoreszenz der zellfreien (Medien nur) und Zellen-only (Zellen in einem sauberen Testmedium) Kontrollen. Die Medien-only Hintergrundfluoreszenz sollte mindestens 25% niedriger ist als die Antwort der Zellen-only Kontrolle. </li><li> Verarbeiten Sie die Roh-FRET-Daten. Für beide &quot;blau&quot; und &quot;grün&quot; Datensätze, subtrahieren die durchschnittliche Fluoreszenz der zellfreie Kontrollvertiefungen von allen Zellen gut enthält. Berechnen Sie dieBlau / Grün-Verhältnis für jeden experimentellen gut. </li><li> Vergleichen blau / grün-Verhältnis von Zellen-only und Zellen mit DMSO-Kontrollen. Die Fluoreszenzwerte dieser Kontrollen sollten innerhalb von 15% relative Standardabweichung (RSD) sein. </li><li> Zeichnen Sie die Assay-spezifische Kalibrierungskurve als blau / grün-Verhältnis gegen die Probenkonzentration als Protokollmolekularmasse ausgedrückt (log M). Berechnen Sie die Steigung, R 2 und log EC 50 (50% - Effekt - Konzentration). Kalibrierungsparameter sollten in Tabelle 1 aufgelistet innerhalb des erwarteten Bereichs liegen. </li><li> Berechnen Sie die RSD für alle drei Vertiefungen. Die Variabilität zwischen den Replikaten sollte über 20% liegen. </li><li> Für die Angaben zur Zytotoxizität (560 Ex / 590 Em nm), subtrahieren, um die zellfreie Kontrolle Durchschnitt (dh Medien Hintergrund) aus allen Zellen enthaltenden Vertiefungen. </li><li> Berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrund subtrahiert Fluoreszenz für jede Probe. Plotten der resultierenden Fluoreszenzdaten als Prozent der DMSO-Kontrolle. Probenverdünnungen sollte nichtweisen mehr als 20% Mortalität der Zellen im Vergleich zu den Zellen-only und DMSO Kontrollen. </li></ol> 8. Datenanalysen <ol><li> Berechnen Sie den Test Nachweisgrenze (LOD) als Mindesteichreaktion plus zwei Standardabweichungen vom Mittelwert dieser Antwort. </li><li> Für Proben , die eine Dosis - Antwort zeigt, leiten die EC 50 &#160; des Wasserextrakts der Steigung einer linearen Regression der Kalibrierungskurve zwischen 10 und 50% Wirkung Konzentrationen der Referenzsubstanz verwendet wird. </li><li> Berechnen Sie die bioanalytische Equivalent Konzentration (BEQ) unter Verwendung der Formel: BEQ = EC 50 von Referenzsubstanz / EC 50 von Wasserprobe. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die gut dokumentierte Potenz von Umwelt Estrogene, wie 17β-Estradiol (E2), garantiert Screening für diese Chemikalien in ng / L - Konzentrationen 23,24. In dieser Studie wurde die ER - Antwort für Abwasser Abwässer (BEQ Bereich: 2,3 bis 17 ng E2 / L) war etwas höher als für sekundäre Abwasser berichtet von der australischen AWBAn 20, während die BEQs für Oberflächenwasser (&lt;0,5 bis 4 ng E2 / L ) waren für die Oberflächen- und Regenwasser im Bereich an anderer Stelle berichtet (&lt;1 ...

Aktuelle Überwachung der Wasserqualität auf der Fähigkeit sagt, genau und präzise das Auftreten von chemischen Verunreinigungen als Proxy für die Exposition gegenüber Mensch und Tier zu messen. Dies ist jedoch chemisch-by-chemische Überwachung und Beurteilung Paradigma kann nicht Schritt halten mit den sich ständig ändernden chemischen Universum, das wir konfrontiert sind. Wenn wir mehr über das Schicksal und Effekte von synthetischen und natürlichen Chemikalien lernen wir weiterhin für Messinstrumente zu suchen, die biologischen Auswirkungen zu erwarten Adresse und dass zur gleichen Zeit auf Veränderungen in der chemischen Produktion, Nutzung und Umwelt Eingang immun. Solche Werkzeuge sind besonders relevant für das Verständnis, ob unbekannte oder neue Chemikalien und Transformationsprodukte, unsere Aufmerksamkeit verdienen. Darüber hinaus komplexe Mischungen von Chemikalien, die in Wasser schlecht durch einzelne chemische Überwachung angesprochen. So stehen wir vor der Herausforderung, die bestehenden Überwachungs Toolbox besser Adresse zu modernisieren, diese Probleme in Oberflächengewässern that Einleitung von gereinigtem Abwasser anfällt und städtischen / Abfluss von Regenwasser erhalten. In den letzten Jahren haben Bioanalysetechniken versprechen als Screening-Instrumente gezeigt für die Wasserqualitätsbeurteilung. Insbesondere in&#39;vitro Biotests, die Chemikalien wirken über bekannte, spezifische Wirkungsweisen 1,2 sind von großem Interesse für die Umweltüberwachung Gemeinschaft 3 reagieren. Zahlreiche Untersuchungen haben in vitro Biotests eingesetzt , um die endokrine Wirkung von Trink-, Oberflächen- und Abwasser 4 -6 zu quantifizieren. Außerdem zielen eine Reihe von Biotests Molekular auslösenden Ereignissen (beispielsweise Rezeptoraktivierung) , die möglicherweise zu nachteiligen Wirkungen über adverse outcome pathway 7,8 analysiert verknüpft werden können. Die Entwicklung der bioscreening für die Wasserqualitätsbewertung hat relativ schnell gewesen, mit Hunderten von verschiedenen in vitro - Bioassay Endpunkte wurden ausgewertet haben ihreDienstprogramm 9,10. Derzeit ist nur eine Handvoll von Biotests wurden gute Messgenauigkeit zu erreichen , gezeigt (in Laboratorien) , während die Fähigkeit , unter Wasserqualitäten 5,6 zu unterscheiden demonstrieren. Für behandeltem Abwasser insbesondere das Auftreten von Östrogenen und Glukokortikoid Steroide wurde für die Verwendung von In - vitro - Transaktivierungsassays 11,12 erfolgreich bilanziert. Allerdings haben die meisten Studien bisher eingesetzten Biotests, deren Zelllinien sind Eigentum der Firma (und somit nicht allgemein verfügbar), bedürfen ständiger Pflege und Manipulation, oder beides. Als Ergebnis wird die Fähigkeit, Protokolle zu standardisieren, führen inter-Laborkalibrierung Übungen und schließlich diese Screening-Technologie, um die Wasserressourcen zu übertragen Gemeinschaft gehinderten bleibt. Mindestens ein Anbieter von In - vitro - Biotests durch die US ToxCast Programm überprüft , ist im Handel erhältlich 13 in leicht zu bedienen &quot;Einfrieren und Auftauen4; Formate. Diese Abteilung verhaftet Zelle &quot;Kits&quot; wurden bei der Messung der Aktivität von Chemikalien aus dem Wasser , die verschiedene Ebenen der Behandlung 14 extrahiert werden robust gezeigt. Obwohl Anbieter Protokolle die Bioaktivität von einzelnen Chemikalien oder Mischungen zum Screenen verfügbar sind, erfordern einige von ihnen Modifikation, bevor sie an Wasserproben angewendet werden. Behandeltem Abwasser 15, Abfluss von Regenwasser 16, Vorfluter 17,18 und in jüngster Zeit wieder aufbereitetem Wasser 19,20 sind Paradebeispiele für wässrige Medien , die von Interesse für die Wasserqualität Gemeinschaft sind. Diese Studie stellt eine einheitliche, standardisierte Protokoll , um die endokrine Aktivität in Wasserproben unter Verwendung von kommerziell erhältlichen, divisions verhaftet in vitro Trans Biotests zu messen. Wir haben gezeigt, Robustheit des Protokolls durch eine umfassende Bewertung der Hintergrund, Dosis Responsivität und Wiederholbarkeit der Reaktion für two Endpunkte von besonderem Interesse Estrogen und Glucocorticoidrezeptor Trans (ER und GR, beziehungsweise). Das Protokoll wurde auf Bildschirm Proben von behandeltem Abwasser und Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Kalifornien angewendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="826">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:275px;">GeneBLAzer ER alpha DA assay kit</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">K1393</td>
			<td style="width:313px;">Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:275px;">GeneBLAzer GR DA assay kit</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">K1391</td>
			<td style="width:313px;">Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">PrestoBlue cell viability reagent&#160;</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">A-13261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Trypan blue, 0.4% in PBS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">T8154</td>
			<td>Also available at ThermoFisher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Corning 96 well black wall, clear-bottom plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:115px;">3603</td>
			<td style="width:313px;">Individually wrapped, sterile with lid</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 &#181;M</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">WHA1820025</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Microplate aluminum sealing film</td>
			<td style="width:123px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:115px;">T592100</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent</td>
			<td style="width:123px;">Waters</td>
			<td style="width:115px;">WAT106202</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">17&#946; Estradiol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">E2758</td>
			<td style="width:313px;">CAS #50-28-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">A61-100</td>
			<td style="width:313px;">Also available at Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Dexamethasone&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">D4902</td>
			<td style="width:313px;">CAS #50-02-2</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">D8418</td>
			<td>Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Solvents (acetone, hexane, methanol)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;">HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:275px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:115px;">S2002</td>
			<td style="width:313px;">Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:275px;">Automated cell counter or hemocytometer</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;">Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">Class II biological safety cabinet</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:275px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:275px;">Cryogenic freezer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;">Liquid nitrogen storage dewar is recommended.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:275px;">Fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:123px;">Various*</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:313px;">&#160;The reader must have bottom read capabilities.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for endocrine activity in water using commercially-available in vitro transactivation bioassays

In - vitro - Trans Biotests haben Versprechen als Wasserqualität Monitoring - Tools gezeigt, aber ihre Annahme und weit verbreitete Anwendung ist zum Teil auf einen Mangel an standardisierten Methoden und die Verfügbarkeit von robusten, benutzerfreundliche Technologie aufgrund behindert. In dieser Studie wurden im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelllinien wurden quantitativ verwendet für endokrine Aktivität zu screenen von Chemikalien, die in Wasserproben von Interesse für die Umweltqualität Profis. Ein einziges, standardisiertes Protokoll, das umfassende Qualitätssicherung / Qualitätskontrolle (QA / QC) Kontrollen einbezogen wurde für Östrogen- und Glucocorticoid-Rezeptor-Aktivität entwickelt (ER und GR, jeweils) unter Verwendung eines zellbasierten Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) -Test. Die Proben der behandelten kommunalen Abwasser Abwasser und Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Kalifornien (USA), wurden unter Verwendung von Festphasenextraktion und analysiert für endokrine Aktivität extrahiert, um die standardisierten Proto mitcol. Hintergrund und Dosis-Wirkungs-für Endpunkt spezifische Referenz Chemikalien erfüllt QA / QC-Richtlinien für notwendig erachtet für eine zuverlässige Messung. Der Bioassay-Screening-Antwort für die Oberflächenwasserproben war weitgehend nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu hatte Abwasserproben aus sekundären Behandlungsanlagen die höchste messbare Aktivität, mit geschätzten Bioassay äquivalenten Konzentrationen (BEQs) bis zu 392 ng Dexamethason / L für GR und 17 ng 17β-Estradiol / L für ER. Der Bioassay Antwort für eine tertiäre Abwasserprobe war niedriger als die für sekundäre Abwässer gemessen, was auf eine geringere Rest von endokrin wirksamen Chemikalien nach vorheriger Behandlung. Dieses Protokoll hat gezeigt , dass in vitro - Trans Biotests , die im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelle &quot;Kits&quot; nutzen wollen , können für endokrine Aktivität in Wasser zu screenen angepasst werden.

In der vorliegenden Studie wurden 24 4x h-Mischproben der behandelten kommunalen Abwasser anfällt, 6 Schürfproben von Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Südkalifornien und ein Feld leer von Reinstwasser aus wurden ausgewählt, um dieses Protokoll zu illustrieren. 3 der 4 Abwasserproben wurden aus konventionellen Schlamm Kläranlagen aktiviert ( &quot;secondary Abwasser&quot;), und der vierte von einer fortgeschrittenen Kläranlage mit Sand / Kohlefiltration Post biologische...

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Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Screening für Endokrine Aktivität in Wasser unter Verwendung von handelsüblichen<em&gt; In Vitro</em&gt; Trans Biotests

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

7.5K Aufrufe.  Southern California Coastal Water Research Project Authority. A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Serie: Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Forschung

Umwelt

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

Eine Duplex-Digital-PCR-Assay für Simultaneous Quantifizierung der<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Und das menschliche Fecal-assoziierte HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Charakterisierung und Anwendung von Passivsammler für die Überwachung von Pestiziden in Wasser

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with herbaceous plants. This protocol describes a simple, cost-effective tree planting technique needed for restoring degraded Everglade tree islands. The design is patterned after a natural Everglades process that creates floating peat islands, which allows tree survival and growth in flooded conditions and often leads to the development of tree islands. Commercially available peat bags were used as the medium for the growth and establishment of potted native tree saplings. The pop-up configuration floated initially and provided additional elevation to minimize inundation, with a single native tree species sapling and a single tree fertilizer spike. During a 3 year study involving 105 pop-ups, most plants survived (80%) and many thrived. Determining whether this technique can establish trees on a degraded tree island will require longer studies and extensive field tests.

This protocol describes a simple, cost-effective tree planting technique for restoring degraded Everglades tree islands that experience inundation. The design creates an island (pop-up) which floats initially and adds elevation to promote tree survival and growth under flooded conditions.

Eine einfache Bepflanzung Technik für Wiederherstellung des Bäume wo tritt häufig Überschwemmung

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol for performing in situ juvenile exposure tests within oligotrophic river catchments over one-month and three-month periods. Two methods (in both modifications) are presented to evaluate the juvenile growth and survival rate. The methods and modifications differ in value for the locality bioindication and each has its benefits as well as limitations. The sandy cage method works with a large set of individuals, but only some of the individuals are measured and the results are evaluated in bulk. In the mesh cage method, the individuals are kept and measured separately, but a low individual number is evaluated. The open water exposure modification is relatively easy to apply; it shows the juvenile growth potential of sites and can also be effective for water toxicity testing. The within-bed exposure modification needs a high workload but is closer to the conditions of a natural juvenile environment and it is better for reporting the real suitability of localities. On the other hand, more replications are needed in this modification due to its high-hyporheic environment variability.

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

In situ bioindications enable determination of the suitability of an environment for endangered mussel species. We describe two methods based on the juvenile exposure of freshwater pearl mussels in cages to oligotrophic river habitats. Both methods are implemented in variants for open water and hyporheic water environments.

Bioindikation Prüfung von Stream Umwelt Eignung für junge Süßwasser Perle Miesmuscheln mit In Situ Belichtungsmethoden

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

Optimierte Verfahren zur Bestimmung der Adsorption von Phosphonaten auf Granular Ferric Hydroxid mit einer miniaturisierten Phosphor Entschlossenheit Methode

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Construction of a Low-cost Mobile Incubator for Field and Laboratory Use

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water quality. However, commercially available incubators are often costly, difficult to transport, not flexible in terms of volume, and/or poorly adapted to local field conditions where access to electricity is unreliable. The purpose of this study was to develop an adaptable, low-cost and transportable incubator that can be constructed using readily available components. The electronic core of the incubator was first developed. These components were then tested under a range of ambient temperature conditions (3.5 &#176;C - 39 &#176;C) using three types of incubator shells (polystyrene foam box, hard cooler box, and cardboard box covered with a survival blanket). The electronic core showed comparable performance to a standard laboratory incubator in terms of the time required to reach the set temperature, inner temperature stability and spatial dispersion, power consumption, and microbial growth. The incubator set-ups were also effective at moderate and low ambient temperatures (between 3.5 &#176;C and 27 &#176;C), and at high temperatures (39 &#176;C) when the incubator set temperature was higher. This incubator prototype is low-cost (&lt; 300 USD) and adaptable to a variety of materials and volumes. Its demountable structure makes it easy to transport. It can be used in both established laboratories with grid power or in remote settings powered by solar energy or a car battery. It is particularly useful as an equipment option for field laboratories in areas with limited access to resources for water quality monitoring.

This paper describes a method for building an adaptable, low-cost and transportable incubator for microbial testing of drinking water. Our design is based on widely available materials and can operate under a range of field conditions, while still offering the advantages of higher-end laboratory-based models.

Bau eines Low-Cost mobilen Inkubator für Feld und Labor

Incubators are essential for a range of culture-based microbial methods, such as membrane filtration followed by cultivation for assessing drinking water ...

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral extraction methods and coverslip bioassays were developed utilizing Colletotrichum fioriniae. In blueberry and cranberry, this pathogen is optimally controlled by applying fungicides during the bloom period because of the role flowers play in the initial stages of infection. The protocol detailed here describes how floral extracts (FE) were obtained using water-, chloroform-, and field rainwater-based methods for later use in corresponding glass coverslip bioassays. Each FE served to provide a different set of information: response of C. fioriniae to mobilized floral chemical cues in water (water-based), pathogen response to flower and fruit surface waxes (chloroform-based), and field-based monitoring of collected floral rainwater, moving in vitro observations to an agricultural setting. The FE is broadly described as either water- or chloroform-based, with an appropriate bioassay described to compensate for the inherent differences between these two materials. Rainwater that had run off flowers was collected in unique devices for each crop, alluding to the flexibility and application of this approach for other crop systems. The bioassays are quick, inexpensive, simple, and provide the ability to generate spatiotemporal and site-specific information about the presence of stimulatory floral compounds from various sources. This information will ultimately better inform disease management strategies, as FE decrease the time needed for infection to occur, thus providing insight into changing risks for pathogen infection over the growing season.

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Here, bioassays designed to monitor the development of a fungal pathogen, Colletotrichum fioriniae, in the presence of blueberry or cranberry floral extracts on glass coverslips are described. Water-, chloroform-, and field rainwater- based floral extraction techniques are detailed as well as insight into how this information can be applied.

Colletotrichum fioriniae Entwicklung in Wasser und Chloroform-basierte Heidelbeere und Cranberry Floral Extrakte

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Leaf Area Index Estimation mit drei unterschiedlichen Methoden in reinen Laubständen

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...

Measuring Phosphorus Release in Laboratory Microcosms for Water Quality Assessment

Phosphorus (P) is a critical limiting nutrient in agroecosystems requiring careful management to reduce transport risk to aquatic environments. Routine laboratory measures of P bioavailability are based on chemical extractions performed on dried samples under oxidizing conditions. While useful, these tests are limited with respect to characterizing P release under prolonged water saturation. Labile orthophosphate bound to oxidized iron and other metals can rapidly desorb to solution in reducing environments, increasing P mobilization risk to surface runoff and groundwater. To better quantify P desorption potential and mobility during extended saturation, a laboratory microcosm method was developed based on repeated sampling of porewater and overlying floodwater over time. The method is useful for quantifying P release potential from soils and sediments varying in physicochemical properties and can improve site-specific P mitigation efforts by better characterizing P release risk in hydrologically active areas. Advantages of the method include its ability to simulate in situ dynamics, simplicity, low cost, and flexibility.

Accurate quantification of phosphorus (P) desorption potential in saturated soils and sediments is important for P modeling and transport mitigation efforts. To better account for in situ soil-water redox dynamics and P mobilization under prolonged saturation, a simple approach was developed based on repeated sampling of laboratory microcosms.

Messung der Phosphorfreisetzung in Labormikrokosmen zur Wasserqualitätsbewertung

Phosphorus (P) is a critical limiting nutrient in agroecosystems requiring careful management to reduce transport risk to aquatic environments. Routine ...