Dieses Protokoll bietet ein kostengünstiges und anpassungsfähiges System zur Bewertung der zeitlichen Dynamik fluorochemischer Hinweise auf Colletotrichum fiorniae und andere Pflanzenpathogene, die den Begriff Blüte infizieren. Neuartige Bodenregenwassersammelgeräte ermöglichen es dem Benutzer, natürliche Stimulanzien und Bedingungen, die die Pathogenentwicklung beeinflussen, nahezu standortspezifisch in Echtzeit zu überwachen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit einer Kultur von Colletotrichum fiorniae von einem natürlich infizierten Host, wie im Textprotokoll beschrieben.
Wenn Kolonien zu sporulaten beginnen, streifen Conidia auf einen anderen V 8 Saft-Agar, der eine Zellkulturschale enthält, um eine sporulierende Kultur mit hoher Dichte zu erzeugen. Verwenden Sie nach sieben Tagen Wachstum eine Standard-Sterilschleife, um eine kleine Menge Conidia aus der Kultur mit hoher Dichte zu sammeln, indem Sie die Schleife leicht zur Konidialmasse berühren. Rühren Sie dies in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr mit 10 Milliliter sterilem entionisiertem Wasser.
Wirbel dieses Beispiel für 10 Sekunden. Mit einer Standardpipette mehrmals nach oben und unten tauchen, um die Probe weiter zu mischen. Legen Sie dann einen Tropfen der wirbelnden Probe auf das Hämozytometer und schätzen Sie die Sporenkonzentrationen.
Stellen Sie die Konzentration auf 0,1 Millionen Conidia pro Milliliter sterilen destillierten Wassers mit einem Endvolumen von fünf Millilitern ein. Dies wird als Sporensuspension bezeichnet und wird erst unmittelbar vor der Verwendung in beiden Bioassays hergestellt. Um die chloroformbasierte Floral-Extraktion durchzuführen, reinigen Sie alle Komponenten zweimal mit 95% Ethanol.
Reinigen Sie die Komponenten dann zweimal mit Chloroform, um eine Kontamination für jede Extraktion zu verhindern. Reinigen Sie die PTFE-gefütterten Kappen nicht mit Chloroform, da sie dadurch beschädigt werden. Nach der Reinigung die Komponenten beiseite stellen, um auf den Kopf zu trocknen.
Kombinieren Sie ein Teil verarbeitete Blüten zu neun Teilen Chloroform in einem Becher durch Zugabe von Blumen und dann Chloroform. 30 Sekunden lang sanft wirbeln und durch einen Edelstahlschirm in den zweiten Becher abseihen. Gießen Sie den Chloroform-basierten Extrakt aus dem zweiten Becher in das Glaskulturrohr und befestigen Sie die PTFE-Kappe.
Wickeln Sie die Kappe mit Parafilm, um Verdunstung zu verhindern. Bewahren Sie den resultierenden Chloroform-basierten Blumenextrakt in der Dunkelheit auf, um den Lichtabbau bei vier Grad Celsius bis zum experimentellen Gebrauch zu reduzieren. Wiederholen Sie Extraktionen mit mehreren Samples, um Replikationen bereitzustellen.
Um ein Sammelgerät für jede ausgewählte Position zu erstellen, verwenden Sie ein Schrittbit, das an eine Bohrmaschine angeschlossen ist, um ein Loch an der Unterseite eines Sprühbechers zu bohren. Dann schneiden Sie eine gerade Linie von der Oberseite des Lochs bis zum Mund der Sprühbecher. Bohren Sie nun vier äquidistante Löcher, die groß genug sind, um den kunststoffbeschichteten Draht an den Mund des Sprühbechers zu fädeln.
Befestigen Sie ein Ende der kunststoffbeschichteten Drähte, so dass ein Ende frei bleibt. Bohren Sie ein Loch, das groß genug ist, um das Farbspray oder den Becheradapter in einen 50-Milliliter-Zentrifugendeckel zu fädeln. Versiegeln Sie die Adaptergewinde mit Parafilm, um Leckagen zu vermeiden.
Befestigen Sie diese sowohl an der Zentrifugenkappe als auch an dem Gewindeteil des Sprühbechers. Dann das verklebende 50-Millimeter-Zentrifugenrohr befestigen. Erstellen Sie vier Sammelgeräte pro Sampling-Speicherort.
Stellen Sie Geräte an ausgewählten Standorten bereit, indem Sie Sprühbecher so flexen, dass sie auf Stiele passen. Richten Sie die geschnittene Seite des Sprühbechers nach oben mit den kunststoffbeschichteten Drähten aus, die an anderen Stielen befestigt sind. Dadurch wird sichergestellt, dass Wasser, das über die Blumen geht, eingefangen wird.
Um Regenwasser aus Preiselbeerblüten zu sammeln, durchbohren Sie zunächst acht äquidistante Löcher um den Mund des Trichters mit einer Metallsonde. Fügen Sie Twist-Krawatten in vier der Löcher ein. Befestigen Sie die anderen Enden an der gegenüberliegenden Position dieses Lochs und bilden Sie ein sauberes Kreuzungsmuster.
Den Trichter mit Parafilm abwickeln und beiseite stellen. Bohren Sie ein Loch, das groß genug ist, um den Trichter nach unten in eine 50 Milliliter Zentrifugenkappe mit einem Schritt einzufügen. Setzen Sie den vorbereiteten Trichter in die Zentrifugenkappe ein.
Entfernen und ersetzen Sie nach Regenfällen oder Überkopfbewässerung den unteren Rohrteil des Zentrifugenrohrs. Die Regenwassersammelrohre sollten nach Benetzungsereignissen schnell gewechselt werden, da sie anfällig für den Abbau durch natürliche Verunreinigungen sind, die im Abfluss mobilisiert werden, wie Bakterien und andere Pilze. Legen Sie zwei Schichten Papierscheiben in Kulturgerichte und tränken Sie mit zwei Milliliter sterilen destillierten Wasser.
Als nächstes mischen Sie gleiche Mengen steriles destilliertes Wasser und blumenbasierten Extrakt auf Wasserbasis in zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhren. Dann fügen Sie ein gleiches Volumen der Sporensuspension zu den vorbereiteten zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhren hinzu. Die resultierende Zubereitung wird als wässrige Behandlungsmischung bezeichnet.
Für die Kontrolle, lassen Sie die florale Extrakt-Portion weg und ersetzen Sie mit sterilem destilliertem Wasser, um die Konidialkonzentrationen konsistent zu halten. Legen Sie nun vorgereinigte Glasabdeckungen auf die eingeweichten Papiertücher innerhalb der Zellkulturschale. Legen Sie ein 40-Mikroliter-Tröpfchen wässriger Behandlungsmischung auf die Mitte eines Deckellipss.
Wiederholen Sie dies für die gewünschten Behandlungen einschließlich der Kontrolle. Schließen Sie dann das Zellkulturgericht. Sobald alle Behandlungen und Repliken abgegeben wurden, legen Sie alle nachgebildeten Zellkulturgerichte in einen versiegelten Plastikbehälter und bebrüten bei 25 Grad Celsius im Dunkeln.
Zu vorgegebenen Zeitpunkten 10 Mikroliter eines Fixativs zu den Tröpfchen hinzufügen, die das Wachstum stoppen und die Halterung halb erhalten. Sobald ein Fixativ hinzugefügt wurde, kehren Sie sorgfältig die Abdeckungen invertiert jede von ihnen Tröpfchen Seite nach unten auf einem Glasmikroskop-Dia, um mikroskopische Untersuchung zu erleichtern. Wenn sich alle Abdeckungen auf den Glasmikroskop-Dias befinden, lassen Sie sie 20 Minuten lang in der Durchflusshaube absetzen und teilweise trocknen.
Zählen Sie alle Aufdeckungen auf dem Deckblatt vorhandenen Konidien einschließlich Primärkonidie, keimter Konidie n. Chr. und neu gebildeter Sekundärkonidie sowie Appressorien. Arbeiten Sie entweder mit der 400-fachen Vergrößerung oder mit einer Gesamtfläche von 3.808 Quadratmillimetern. In einer laminaren Durchflusshaube zwei gleiche Mengen sterilen destillierten Wassers und ein Volumen Sporensuspension zu einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr hinzufügen.
Legen Sie diese wässrige Behandlungsmischung für Chloroform-basierte Blumenextrakt-Bioassays beiseite. In einer Dunstabzugshaube legen Sie eine Van T Cell auf einen Glasdeckel in der vorbereiteten Kunststoffzellenkulturschale. Geben Sie 33 Mikroliter des gewünschten Chloroform-basierten Blumenextrakts in die Mitte der Zelle und lassen Sie sie trocknen.
Berühren Sie nicht die Wände der Zelle. Für die Kontrollbehandlung, fügen Sie natives Chloroform. Sobald der auf Chloroform basierende Blumenextrakt getrocknet ist, geben Sie 99 Mikroliter der vorbereiteten wässrigen Behandlungsmischung mit einer Standardpipette in die Mitte der Van T Cell.
Dann schließen Sie alle Zellkultur-Gerichte und brüten. Zu vorgegebenen Zeitpunkten 15 Mikroliter eines Fixativs in die Van T-Zelle geben und mindestens fünf Minuten sitzen lassen, um eine ausreichende Pilzfärbung zu gewährleisten. Entfernen Sie danach vorsichtig die Van T Cell.
Führen Sie wie bisher Deckslip-Inversions- und Datenerfassungsschritte durch. Bei der mikroskopischen Auswertung von C.fiorniae bei 24 Stunden nach der Inokulation, Vergleich von Conidie in Gegenwart von sterilem destilliertem Wasser mit Wasser-basierte Blumenextrakt zeigt eine dramatische Zunahme der sekundären Konidiation und Appressoriumbildung. Die sekundäre Konidiation war jedoch nicht so offensichtlich, wenn man die chloroformbioassay sterile destillierte Wasserkontrolle mit Chloroform-basierten Extrakten vergleicht.
Vielmehr verschob sich das C.fiorniae Wachstum in Richtung appressoriale Bildung. In diesem Test wurden eine sterilde destillierte Wasserkontrolle und Cranberry-Chloroform-basierte Blumenextraktionen visuell bei Null, sechs, 12 und 24 Stunden nach der Impfung inspiziert. Die Appressoriumbildung begann um sechs Stunden im Chloroform-basierten Blumenextrakt und nahm während der folgenden Zeitpunkte stetig zu.
Dieses Ergebnis unterstützt die Feststellung, dass Blumen die Zeit reduzieren, die benötigt wird, um Infektionsstrukturen zu bilden. Das Krankheitsmanagement für Fruchtfäulende Pilze beinhaltet oft Blühenzeitfungizid-Anwendungen. Hier wurden Cranberry-Chloroform-basierte Extrakte aus mehreren Wachstumsstadien von Cranberry nach der Impfung nach der Impfung visuell auf die effektiven Oberflächenwachse auf C.fiorniae untersucht.
Eierstöcke, die im Juni gesammelt wurden, unreife Früchte, die im Juli gesammelt wurden, und im August geerntete Früchte, die im Oktober gesammelt wurden, und eine sterile destillierte Wasserkontrolle wurden auf die Appressorialbildung untersucht. Ovary Chloroform-basierte Extrakte hatten die größte Größe der appressorialen Bildung, die die Bedeutung der Blüte im Lebenszyklus von C.fiorniae zeigt. Der Erreger ist der wichtigste Bestandteil dieses Protokolls.
Pilze sollten routinemäßig in frische Medien gebracht werden, um die Konsistenz zwischen den Versuchen zu erhalten. Jede Arbeit mit Chloroform muss aus Sicherheitsgründen in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden. Dazu gehören die Herstellung von Materialien und Glaswaren, Extraktionsverfahren und die Leitfähigkeit des Chloroform-basierten Bioassays.
Kombinationen von Zeitpunkten, Krankheitserregern, floralen Regenwassersammlungen oder Wirtsextraktionen können verwendet werden, um verschiedene Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen zu bewerten. Die Regenwassersammelgeräte und die dazugehörigen Bioassays werden es anderen ermöglichen, mit Hoststimulanzien zu arbeiten, die bei Regenereignissen in zahlreichen Pfadsystemen mobilisiert werden.
