We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

Tiere: Wildtyp C57BL / 6J-Mäuse an der Universität von Kalifornien gezüchtet in Los Angeles (UCLA). Alle Tiere wurden zwischen 11 bis 17 Wochen alt, und enthalten männlichen und weiblichen Mäusen. Alle Mäuse wurden in Gruppen gehalten, im 12:12 Hell / Dunkel - Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum gehalten. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der UCLA und der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt. HINWEIS: Alle Medikamente und injizierbare Mittel sind United States Pharmacopeia (USP) Klasse. 1. Chirurgische Vorbereitung <ol><li> Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 8 mg / kg Xylazin in einer Salzmischung. Verwalten Anästhesie bis zu einer Tiefe, so dass die Maus keinen Zeh Prise oder Hornhaut berühren Reflexe hat. </li><li> Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 37,0 ° C mit einem zirkulierenden Wasserpolster. </li><li> Dilate Schüler mit 2,5% Phenylephrin Auge dROPS und trimmen Whiskers Visualisierung zu erleichtern. Whiskers bieten erhebliche sensorischen Input an die Maus daher Whisker sollten nur den Teil, dass die Blöcke übersichtlichen Zugriff auf das Auge, und nicht auf der Basis des Whiskers entfernen trimmen. Unserer Erfahrung nach zeigen Mäuse normale Erholung nach diesem Verfahren. Methyl Auge Nehmen fällt Trockenheit zu verhindern und Anästhesie induzierte transiente Katarakt 13 zu minimieren. </li><li> Sterilisieren Instrumente vor der Operation (dh betadine und Ethanol oder heißen Kügelchen). </li><li> Bereiten Sie verdünnten Fluorescein (0,01% mit 0,9% Kochsalzlösung) in einer sterilen Umgebung (dh Biosicherheitsschrank) , wenn Visualisierung wird durchgeführt werden (siehe Abschnitt 3 unten). </li></ol> 2. Injektionsstelle Vorbereitung <ol><li> Vorbereitung einer Spritze (beispielsweise 5 &amp; mgr; l - Spritze) mit dem entsprechenden Injektionsvolumen (beispielsweise 0,3 bis 1,0 &amp; mgr; l). </li><li> Bewegen Sie die Maus so das Auge nach oben zeigt und deutlich sichtbar in der dissecting Mikroskop. </li><li> kneifen Sie vorsichtig die zeitliche Bindehaut mit feiner Spitze Pinzette. Machen Sie einen umlaufenden Einschnitt von etwa 90 Grad mit gekrümmten Vannas Schere. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.3 mit der darunterliegenden Tenon-Kapsel. </li><li> Resezieren das umgebende Bindegewebe mit feinen Spitzen versehenen Zange während nasal den Globus drehen. Arbeiten an einer Injektionsstelle ca. 0,5 mm temporal der Sehnerv. Verwenden Sie große Sorgfalt zu vermeiden, dass die retro-orbitalen Sinus zu stören. </li></ol> 3. Sclerotomie und Subretinale Injection HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Injektion von 0.01% Fluorescein in 0,9% Kochsalzlösung verwendet werden, mit der Visualisierung zu unterstützen, während dieser Prozedur erlernen. Die topographische Verteilung von Fluorescein kann effektiv mit Fundusaufnahmen dokumentiert werden (siehe Abschnitt 4 unten). <ol><li> Machen Sie einen kleinen Skleraeinschnitt an der Injektionsstelle, indem Sie vorsichtig das Okular mit einem 22,5-Grad-ophthalmologischen Klinge kratzen. Dieser Schnitt should nur groß genug sein, die Spitze der Nadel zu ermöglichen, durch die Sklera zu passieren. </li><li> Legen Sie die abgeschrägte 33 G - Nadel (gewinkelt . 5 - 10 ° in die Sclerotomie mit der Kegel- und abgewinkelte parallel zur Netzhaut zugewandten Inject gewünschte Volumen (zB 0,3 bis 1,0 &amp; mgr; l von 0,01% Fluorescein für Lernzwecke). HINWEIS: Sterilität der Spritze beizubehalten, indem gründlich mit aufeinanderfolgenden Waschungen mit einem geeigneten Lösungsmittel und DI-Wasser vor jeder Injektion reinigen. </li><li> Drücken Sie den Kolben langsam (über ~ 3 Sekunden), ohne die Nadel zu bewegen und mit gleichmäßigem Druck. HINWEIS: Wenn die Nadel in den subretinalen Raum ist, wird ein leichter Widerstand zu spüren sein, während der Kolben niedergedrückt. Es wird keine auf minimalen Widerstand, wenn die Nadel in die Netzhaut durchbohrt, und eine hohe Beständigkeit, wenn die Nadel nicht die Sklera oder RPE eindringt. </li><li> Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel herausgezogen Rückfluss zu minimieren. </li><li> Spülen Sie das Auge mit steriler gepufferter Salzlösung und sorgen für die Augen hals zurück in seine normale Position gedreht wird. </li></ol> 4. Bewertung der Amotio OCT und Fundusimaging <ol><li> Führen OCT-Bildgebung unmittelbar nach der Injektion, die Qualität der Injektion und zu geeigneten Zeitpunkten nach der Injektion zu bewerten, wie Netzhautstruktur zu bewerten benötigt. Hinweis: Beispiele für die Verwendung der OCT in ähnlichen Studien bisher 7,14 beschrieben wurde. <ol><li> Justieren und Ausrichten der OCT-Bild der Injektionsstelle zu richten. Die Injektionsstelle sollte der Mittellinie und 0,5 mm temporal der Sehnervenkopf sein. Bei Bedarf wiederholen, wenn die Ablösung aus dem Rahmen oder nicht optimal zentriert ist. </li></ol></li><li> Visualisieren Netzhautablösung und Farbstoffinjektionsbereich mit en-face Fundus Imaging 7,14. HINWEIS: Wenn ein OCT-Abbildungssystem nicht verfügbar ist, Einspritzen einer kleinen Menge von Fluorescein mit einem Vektor für die Praxis wird Visualisierung mit jeder Funduskamera ermöglichen, die Fluorescein angio führtgrafie die gleichen Anregungswellenlängen und Sperrfilter verwenden. Lokalisierte Bereiche der hyper-Fluoreszenz wird unter dem Gefäßsystem erscheinen und die Gefäße werden scharfe und deutliche Grenzen, wenn der subretinalen Raum richtig ausgerichtet ist. Der Rand des Bleb von der Injektion wird durch den Übergang von Hyper- zu Hypo- Fluoreszenz abgegrenzt werden. Mehrere Instrumente bieten diese Möglichkeit für die Maus; die Instrumentierung verwendet hier wird an anderer Stelle 14 beschrieben. </li></ol> 5. postoperative Pflege <ol><li> Tragen Sie eine dicke Schicht von Triple-antibiotische Augencreme auf der Hornhautoberfläche des injizierten Auge. </li><li> Platzieren Sie Mäuse in einem sauberen Einzelkäfigen für Erholung. Kombinieren Sie nicht Mäuse, die Operation unterzogen haben, bis sie vollständig wiederhergestellt werden. </li><li> Überwachen der Atmung und Temperatur während der Narkose Erholung. Überwachen Tiere, bis sie Brustlage halten können. </li><li> Führen Sie zusätzliche geeignete postoperative Überwachungund Behandlung, einschließlich einer subkutanen Injektion von Carprofen (5 mg / kg) für die postoperative Schmerztherapie. </li></ol> 6. Bewertung der Retinal-Funktion durch Elektroretinogramm (ERG) <ol><li> Führen ERG Analyse vor der Injektion und zu geeigneten Zeitpunkten nach der Injektion als Funktion der Retina zu bewerten benötigt. Wenn die Injektion in den subretinalen Raum gemacht wurde, sollte die Netzhautablösung innerhalb von 72 Stunden gelöst. <ol><li> Verwenden Sie Standard - ERG Techniken Netzhautfunktion vor und nach der Injektion zu bewerten , wie zuvor beschrieben 14,15. </li></ol></li></ol> 7. 3D-Rekonstruktion und Bleb Volume Quantifizierung HINWEIS: Oktober-Scans mit hohem Kontrast sind für den Einsatz optimal die gesamte Distanz im Rahmen der Ansicht umfasst. ImageJ / Fiji 17,18 und Imaris wurden verwendet, aber auch andere Software verwendet werden kann. <ol><li> Exportieren Sie die b-Scan von Interesse, die Einfuhr zu ImageJ / Fidschi und Ernte (Bild&gt; Crop) den Teil des OCT-scein zu modellierenden den rechteckigen Auswahlwerkzeug. <ol><li> Kontrast einstellen (Bild&gt; Anpassen&gt; Helligkeit / Kontrast) und beschreiben die fehlenden Grenzen, indem zwei Abschnitte mit einer Linie. </li><li> Zeichnen einer geraden Linie mit dem Zeilenwerkzeug (Halteverschiebung), die das RPE auf die Photorezeptorschicht erstreckt. Measure (Analysieren&gt; Measure) die Länge der Liniengröße von maximal Ablösung für 7,8 Schritt zu erhalten. </li></ol></li><li> Import abgeschnitten Rahmen zum 3D-Rekonstruktionssoftware (Siehe Tabelle der Materialien), um die &quot;RGB Gray&quot; Plugin verwendet und MATLAB Compiler Runtime. </li><li> Stellen Sie die Voxelgröße (unter Image-Eigenschaften) unter Verwendung der Kalibrierungsparameter aus dem OCT-Scan (x, y, z). </li><li> Führen Sie den &quot;RGB Gray&quot; Plugin (unter Image-Eigenschaften), mit gleicher Gewichtung für jeden Kanal, einen vierten Kanal zu erstellen. Original löschen Rot-Grün-Blau-Kanäle. </li><li> Kehren Sie die grauen Kanal mit Kontraständerung. Shop Bild. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Hinzufügen einew Oberfläche &quot;in der 3D-Registerkarte Ansicht, und damit beginnen, die geführte 4 Schritt-Verfahren die Oberfläche zu schaffen. <ol><li> Stellen Sie die Oberfläche Detailebene (Schritt 1 von 4). HINWEIS: Nach unserer Erfahrung 8,0-12,0 war die effektive Reichweite. </li><li> Legen Sie die maximale Kugelgröße (unter Hintergrund Auswahl) auf etwas weniger als die maximale Distanz Größe in 7.1.2 gemessen. Erstellen Sie die Oberfläche und rückgängig gemacht werden grau Kanalinversion (Schritt 2 von 4). </li><li> Stellen Sie den Schwellenwert auf den Maximalwert, so dass die Oberfläche der negativen Räume außerhalb der Netzhaut und der Ablösung nicht in Kontakt (Schritt 3 von 4) kommen. </li><li> Stellen Sie den Filtertyp auf die Anzahl der Voxel und den negativen Raum in der Ablösung Ort durch Größe zu isolieren. Beenden Sie die Oberfläche (Schritt 4 von 4). HINWEIS: Das Volumen der Ablösung Oberfläche ist in der Statistik unter der Registerkarte Volumen befindet. </li></ol></li></ol>

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	<li>Garoon, R. B., Stout, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+ocular+gene+therapy+and+advances+in+treatment+of+inherited+retinal+diseases+and+exudative+macular+degeneration.">Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration.</a> Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).</li><li>Pierce, E. A., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Status+of+RPE65+Gene+Therapy+Trials:+Safety+and+Efficacy.">The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).</li><li>Tolmachova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+Rab+escort+protein+1+following+AAV2-mediated+gene+delivery+in+the+retina+of+choroideremia+mice+and+human+cells+ex+vivo.">Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo.</a> J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li><li>Ye, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+Biodistribution+Evaluation+in+Cynomolgus+Macaques+of+rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3,+a+Recombinant+AAV+Vector+for+Treatment+of+Achromatopsia.">Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Corneal+Subretinal+Injection+in+Mice+and+Its+Effect+on+the+Function+and+Morphology+of+the+Retina.">Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina.</a> PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).</li><li>Engelhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+retinal+pigment+epithelium+cells.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells.</a> Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).</li><li>Lambert, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+AAV2.COMP-Ang1+suppresses+choroidal+neovascularization+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+a+murine+model+of+age-related+macular+degeneration.">Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration.</a> Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).</li><li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice.">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li><li>Nusinowitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+visual+function+in+the+rd12+mouse+model+of+Leber+Congenital+Amarousis+(LCA)+after+gene+replacement+therapy+to+restore+retinal+function.">Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function.</a> Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).</li><li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+human+retinal+progenitor+cells+under+Cyclosporin+A+treatment.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment.</a> Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).</li><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber's+congenital+amaurosis.">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li><li>Ridder, W. . 3. r. d., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+cataract+development+in+anesthetized+mice.">Causes of cataract development in anesthetized mice.</a> Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).</li><li>Ridder, W. H. 3. r. d., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visual+evoked+potential+in+the+mouse--origins+and+response+characteristics.">The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics.</a> Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).</li><li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+the+primary+but+not+exclusive+circuit+for+light+aversion.">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion.</a> Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li></ol>

None of the authors have any commercial disclosures.

Subretinale Injektionen sind die Methode der Wahl für die Lieferung von viralen Vektoren und Stammzell-abgeleiteten Therapie für Photorezeptoren und den RPE in der Grundlagenforschung und der klinischen Behandlung zu manipulieren. Bei Patienten werden subretinalen Injektionen typischerweise mit einem vorderen Sclerotomie an der Pars plana, einen hinteren Kern Vitrektomie und das Eindringen der Netzhaut durch die Nadel mit direkter Visualisierung erfolgen. Wie bei den meisten Vitrektomie Verfahren ist es üblich, für ...

Subretinale Injektionen sind das wichtigste Mittel der auf der Netzhaut von Mäusen zellulären und viralen Mittel liefern ihre Auswirkungen auf die Photorezeptoren zu studieren und die zugrunde liegenden RPE 1,2. Die meisten subretinalen Injektionsprotokolle in Mäusen verwenden eine transcornealen oder eine transcleral Injektionsstelle anterioren zum Äquator (Abbildung 1). Dieser Ansatz kann in inhärenten Kollateralschäden führen , dass nicking und resultierende Trübung der Linse, Störung der Integrität des Glaskörpers, das Eindringen der neurosensorischen Netzhaut und Iris, Netzhautblutungen 3-9, erhebliche Netzhautablösungen und dauerhafte subretinalen Ödem enthält. Experimentelle Manipulationen müssen diese Effekte um 3,7,10,11 überwinden die Auswirkungen von therapeutischen Interventionen zu bewerten. Diese Studie enthält eine detaillierte Beschreibung und Validierung eines hinteren transcleral Injektionsverfahren, das diese Komplikationen vermeidet, minimiert Trauma und hat eine hohe Erfolgsquote der Unter TargetingRetina-Raum. Einspritzungen den subretinalen Raum in Mäusen Targeting sind oft sehr schwierig durchzuführen und die meisten Forscher in denen eine hohe Frequenz von Fehlversuchen in dem der Vektor an eine falsche Stelle geliefert wird , oder es gibt signifikante Netzhautschäden, beispielsweise in einer vollständigen Netzhautablösung 6. Die Anzahl der Augen von der Analyse ausgeschlossen, da der Einspritz Komplikationen typischerweise nicht in Maus-Studien berichtet, aber in unserer eigenen Erfahrungen und in Diskussion mit anderen Forschern, kann die Anzahl von Fehleinspritzungen so hoch wie 50% und variieren abhängig von der Erfahrung und Fähigkeiten der Ermittler, die Injektionen durchführt. Der Erfolg der Injektion wird typischerweise durch direkte Fundusabbildung und / oder optische Kohärenztomographie (OCT) 7,9 beurteilt. Ein leicht zu beherrschen Verfahren mit hohen Erfolgsraten für subretinalen Injektionen in Mäuse können Experimente zu beschleunigen und die Kosten der präklinischen Studien von tre reduzierenatments für Netzhauterkrankungen, die Hauptursachen für Blindheit in den Vereinigten Staaten sind. Der hintere, transcleral subretinalen Injektion hier beschriebene Technik ist eine Adaption von klinischen und präklinischen Protokolle 9,12. Die nicht-invasive diagnostische in injizierten Mäusen Einschätzungen zeigen, mild und stark lokalisierte Schaden und es fehlt ihnen zusätzliche Sicherheiten Linse, Netzhaut und RPE Verletzung. Darüber hinaus mit relativ wenig Übung, ein Experimentator können diese Ergebnisse mit einer hohen Erfolgsquote erreichen (80 - 90% oder mehr), um dadurch die Kosten im Zusammenhang mit solchen Studien verbunden sind, reduziert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um zelluläre, viralen oder pharmakologischen therapeutischen Interventionen zu Photorezeptoren und / oder RPE in präklinischen Studien zu liefern und zu leicht experimentellen Interventionen zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Syringe x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Needle 33 G, 1.0&quot;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Needles x 6</td></tr><tr><td>Vannas Curved Scissors</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>5 mm Blade</td></tr><tr><td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>0.9% Saline USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Antibiotic Ointment</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>Water Circulating Pump</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/Pump&amp;nbsp;</td><td>P/N 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-Series</td><td>Commercial</td></tr><tr><td>Fundus Camera</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Type 3</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Phenylephrine</td><td>Paragon BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Version 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromellose&amp;nbsp;2.5%</td><td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>Methylcellulose</td></tr><tr><td>Eye Drops (Rinse)</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td></td><td>Saline Solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

Subretinale Injektionen wurden bei Mensch und Nager zu liefern therapeutische Interventionen von Proteinen, viralen Mitteln und Zellen zur Interphoto / subretinalen Fach, das direkte Exposition muss Photorezeptoren und die retinalen Pigmentepithel (RPE) erfolgreich eingesetzt. Subretinale Injektionen von Plasminogen sowie die jüngsten präklinischen und klinischen Studien haben die Sicherheit nachgewiesen und / oder Wirksamkeit von mit fortgeschrittenen Netzhauterkrankungen viralen Vektoren und Stammzellen an Einzelpersonen zu liefern. Mausmodelle von Netzhauterkrankungen, insbesondere erbliche Netzhautdystrophien, sind für diese Therapien zu testen. Die häufigste Injektionsverfahren bei Nagetieren ist klein transcornealen oder transcleral Einschnitte mit einem vorderen Ansatz zur Netzhaut zu verwenden. Mit diesem Ansatz dringt die Injektionsnadel die neurosensorische Netzhaut des zugrunde liegenden RPE und beim Einsetzen stören kann leicht nick die Linse, so dass Linsentrübung und Beeinträchtigung von nicht invasiver imaging. Zugriff auf den subretinalen Raum über einen transcleral vermeidet hinteren Ansatz, diese Probleme: die Nadel durchquert die Sklera etwa 0,5 mm von der Sehnerv, ohne Netzhautpenetration und vermeidet den Glas zu stören. Kollateralschaden ist nicht auf die beschränkt, die mit der Brenn Sclerotomie zugeordnet ist, und die Auswirkungen eines vorübergehenden, seröse Netzhautablösung. Die Einfachheit des Verfahrens minimiert Augenverletzung, sorgt für eine schnelle Netzhaut Wiederanheftung und Erholung, und hat eine niedrige Ausfallrate. Die minimale Schäden an der Netzhaut und RPE ermöglicht eine klare Beurteilung der Wirksamkeit und direkten Auswirkungen der therapeutischen Mittel selbst. Diese Handschrift beschreibt eine neue subretinalen Injektionstechnik, die verwendet werden können virale Vektoren, pharmakologische Mittel zu zielen, Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) -Zellen in den subretinalen Raum in Mäusen, die mit hoher Wirksamkeit, minimale Beschädigung und schnelle Wiederherstellung.

Posterioren Ansatz transcleral subretinalen Injektionen wurden auf 31 gesunde Augen von 16 Wildtyp-Mäusen, die mit Injektionen von 0,3 &amp; mgr; l (n = 18), 0,5 ul (n = 8) und 1,0 ul (n = 5) von 0,01% Fluorescein. Ein Auge war von der Injektion ausgeschlossen aufgrund einer vorbestehenden Hornhauttrübung, die strukturelle und funktionelle Analyse verhindert. Jedes injizierten Auge wird in diesem Bericht enthalten. Keine unbeabsichtigte Netzhautablösungen, Einstiche der neurosensorisc...

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An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Eine Alternative und Validated Injektionsmethode für den Zugriff auf den subretinalen Raum<i&gt; über</i&gt; A Transcleral dorsalen Zugang

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

13.1K Aufrufe.  University of California, Los Angeles. Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Serie: An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Forschung

Medizin

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Neurowissenschaften

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

Transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation von subretinalen Transplantaten in einem retinalen Degenerations-Mausmodell

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Revitalisierendes Sehen: Stammzelltherapie bei Netzhautdegeneration

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

Autor im Rampenlicht: Advancing Vision Restoration - Stammzellbasierte Therapie für Netzhauterkrankungen 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Eine Alternative und Validated Injektionsmethode für den Zugriff auf den subretinalen Raum

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

Eine Schritt für Schritt-Protokoll für Subretinale Chirurgie in Kaninchen

Entwicklung eines raffinierten Protokolls für Trans-skleralen subretinalen Transplantation von menschlichen retinalen Pigment Epithelzellen in Ratte Augen

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Transpupillengesteuerte transsklerale Transplantation von subretinalen Transplantaten in einem retinalen Degenerations-Mausmodell

Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen

Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen

Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen