Wir danken Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee und Yingying Chung für die technische Unterstützung bei der Herstellung der 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen nach der Kryokonservierung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse des National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) und des National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) an H.G.T.

Die In-vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) und der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung genehmigt wurden. Die Welpen wurden von P17 (vor der Transplantation) auf P30 (nach der Transplantation) immunsupprimiert, indem sie mit Ciclosporin (260 g/L) gefüttert wurden.
1. Präparation von Tag 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen nach Kryokonservierung
<ol><li>Photorezeptor-Differenzierungsmedium (PRDM) in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.</li>
	<li>Entnahme eines Kryo-Fröhrchens mit Tag-32-hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen aus flüssigem Stickstoff. Auf Trockeneis aufbewahren.</li>
	<li>Das Kryoröhrchen bei 37 °C im Wasserbad 3-5 min auftauen. 32 Zellen in 1 ml PRDM resuspendieren und 4 Minuten lang bei 130 x g zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PRDM.</li>
	<li>Entnehmen Sie 10 μl der Mischung für die Zellzählung. Mischen Sie die Zellen mit 0,2 % Trypanblau gemäß den Anweisungen des Herstellers. Pipettieren Sie die Zellmischung in den Objektträger der Zellzählkammer. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit durch einen automatisierten Zellzähler.</li>
	<li>Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Zelllebensfähigkeit über 70 % liegt. Die verbleibende Zellsuspension wird bei 130 x g für 4 min zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in PRDM in einer Konzentration von 3 x 105 Zellen/μl für die Transplantation.</li>
	<li>Achten Sie auf sichtbare Zellklumpen. Resuspendieren Sie Zellklumpen wiederholt mit einer 10-μl-Pipettenspitze im Mikrofugenröhrchen, bis kein sichtbarer Zellklumpen mehr zu sehen ist. In die 33G-Injektionsspritze geben, um die Extrusion der Zelllösung durch die Nadel zu beobachten.</li>
</ol>2. Subretinale Verabreichung der hES-Zellen in rd10-Mäusen
<ol><li>Vorbereitung der Tiere<ol><li>Die Betäubung der Maus (P20, männlich/weiblich, 3-6 g) mit einer Kombination aus Ketamin (20 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (2 mg/kg Körpergewicht) in einer 1-ml-Tuberkulinspritze, die an einer 27G-Nadel befestigt ist, mittels intraperitonealem Zugang. Verabreichen Sie der Maus eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg) als vorbeugendes Analgetikum.</li>
		<li>Nach der Verabreichung der Anästhesie träufeln Sie je einen Tropfen 1 % Tropicamid und 2,5 % Phenylephrin zur Pupillenerweiterung. Tragen Sie ein ophthalmisches Gel auf die Hornhaut auf, um das Auge vor Trockenheit und anästhesiebedingtem Katarakt zu schützen.</li>
		<li>Legen Sie die Maus in einen leeren Käfig, bis sie vollständig betäubt ist. Beurteilen Sie die richtige Betäubungsstufe, indem Sie den Pfotenballen zusammenkneifen, und vergewissern Sie sich, dass das Tier nicht auf das harte Kneifen reagiert.</li>
		<li>Wenn die Maus vollständig betäubt ist, legen Sie das Tier auf eine warme Unterlage bei 38 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Subretinale Verabreichung der Zellen<ol><li>Um einen 1-Port-transvitrealen Pars-plana-Ansatz zu verwenden, wie hier durchgeführt, führen Sie eine subretinale Injektion in einer sterilen Umgebung durch. Verwenden Sie für die Injektion ein aufrecht stehendes Operationsmikroskop mit direktem Strahlengang.</li>
		<li>Bereiten Sie die 10-μl-Glasspritze vor, indem Sie den Nadelansatz entfernen. Montieren Sie die stumpfe 33G-Nadel auf die Glasspritze. Nehmen Sie die Metallnabenabdeckung und befestigen Sie die Nadel vorsichtig auf der Spritze.</li>
		<li>Spülen Sie mit destilliertem Wasser, um zu prüfen, ob die Nadel undicht ist und durchgängig ist. Entleeren Sie die Spritze und legen Sie sie vorsichtig an die Seite.</li>
		<li>Legen Sie die betäubte Maus auf ein Kissen, wobei das Behandlungsauge direkt auf das Mikroskop blickt. Tragen Sie das 0,5%ige Proparacainhydrochlorid auf und warten Sie 30 Sekunden. Tragen Sie 150 μl Augengel auf das Auge auf und legen Sie ein rundes Deckglas darauf.</li>
		<li>Führe eine grobe Untersuchung des Auges durch, indem du die Hornhaut, die Iris, die Pupille, die Linse und die Bindehaut beobachtest. Visualisieren Sie durch die Pupille den Fundus des Mausauges, indem Sie die Fokusebene anpassen. Stellen Sie den Kopf so lange ein, bis sich der optische Kopf in der Mitte der Pupille befindet, und minimieren Sie die Bewegung des Kopfes durch die richtige Positionierung auf dem Kissen.</li>
		<li>Klopfen Sie mehrmals vorsichtig auf den Boden des Röhrchens mit den hES-Zellen, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu erhalten. Entnehmen Sie mit der 10-μl-Glasmikroliterspritze mit einer stumpfen 33G-Nadel 2 μl Zellen/Medien. Entnehmen Sie die Zellen kurz vor der Injektion, um eine Zellabsetzung/Verklumpung in der Spritze zu vermeiden.</li>
		<li>Machen Sie mit einer 30-G-Einwegnadel eine Sklerektomiewunde 2 mm hinter dem Limbus. Halten Sie den Winkel der Nadel bei ~45°, um eine Berührung der Linse zu vermeiden. Sobald die Nadelspitze im Auge sichtbar ist, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück. Entsorgen Sie die Nadel nach Gebrauch in den scharfen Behälter, um Verletzungen durch Nadelstiche zu vermeiden.</li>
		<li>Nehmen Sie die Glasspritze und führen Sie die stumpfe Nadel in die Sklerektomiewunde ein. Ohne die Linse zu berühren, schieben Sie die stumpfe Nadel vor, bis sie die gegenüberliegende Netzhaut der Eintrittswunde erreicht. Stellen Sie sicher, dass der Injektionsbereich frei von großen Blutgefäßen der Netzhaut ist, um Blutungen zu vermeiden.</li>
		<li>Sanft in die Netzhaut eindringen, bis ein Druckzweig auf der Sklera zu sehen ist. Halten Sie das stumpfe Ende der Nadel parallel zur Sklera, um ein Austreten der Zellen in den Glaskörper zu vermeiden.</li>
		<li>Injizieren Sie langsam 2 μl Zellsuspension oder PRDM-Medien (Kontrolle) in den subretinalen Raum, während der Druck auf die Spritze sanft aufrechterhalten wird. Nach einer erfolgreichen Injektion sollte sich an der Injektionsstelle eine sichtbare Blase (d. h. eine erhabene Netzhaut mit der Zellsuspension/dem darin enthaltenen Medium) bilden. HINWEIS: Während der Injektion sollte nur sanfter Druck ausgeübt werden, um ein Einreißen der Netzhaut und eine Verstopfung der Zellen an der Nadelspitze zu vermeiden.</li>
		<li>Nachdem Sie das Bläschen bestätigt haben, warten Sie 10 Sekunden, damit sich die Zellen beruhigt haben. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Auge zurück.</li>
	</ol></li>
	<li>Intraoperative optische Kohärenztomographie (OCT) der Blase (optional)<ol><li>Positionieren Sie das Mausauge, um die Blase unter dem Mikroskop sichtbar zu machen, indem Sie den Kopf langsam bewegen. Sichern Sie die Position, indem Sie den Kopf sanft festhalten. Eine zusätzliche Pupillenerweiterung ist nicht notwendig. Entfernen Sie nicht das Deckglas und das Gel auf dem Auge. Es bietet ein klares optisches Medium, um die Blase zu visualisieren.</li>
		<li>Führen Sie die intraoperative OCT mit der integrierten iOCT-Funktion des Operationsmikroskops durch.</li>
		<li>Drücken Sie die Option Cube auf dem OCT-Bildschirm und positionieren Sie den Scanbereich auf dem Bleb, indem Sie die Pfeiltasten drücken. Passen Sie das OAT an, indem Sie Zentrierung und Fokus verschieben, um die beste OCT-Qualität zu erzielen. Drücken Sie auf Erfassen/Scannen , um den OCT-Scan des Brütchenbereichs zu erhalten. Überprüfen Sie die Bilder, um die Qualität der Scans zu überprüfen.</li>
	</ol></li>
	<li>Genesung<ol><li>Entfernen Sie das Deckglas und reinigen Sie das Gel mit Gaze. Tragen Sie einmal nach der Injektion eine antibiotische Salbe auf, um eine Infektion zu verhindern.</li>
		<li>Lassen Sie das Tier unter warmem Licht von der Narkose erholen, bis es wieder zu Bewusstsein kommt, um das Brustbein zu behalten und in den häuslichen Käfig zurückzukehren. Überwachen Sie das Tier mindestens 3 Tage nach der Injektion auf Anzeichen von Entzündungen, Infektionen und Stress. HINWEIS: Das 150 W warme Licht sollte mindestens 30 cm vom Tierkäfig entfernt sein, und es ist Vorsicht geboten, um eine Verbrennung zu vermeiden.</li>
		<li>Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg) 8 stündlich für 1 Tag oder nach Empfehlung des Tierarztes. Wenn eine Entzündung oder Infektion des Auges beobachtet wird, konsultieren Sie einen Tierarzt für eine angemessene Behandlung.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigung und Sterilisation der Instrumente<ol><li>Spülen Sie die 10-μl-Glasmikroliterspritze und die stumpfe 33G-Nadel 10x mit 100% Ethanol. Waschen Sie das Ethanol ab, indem Sie die Spritze mit destilliertem Wasser aufblitzen lassen.</li>
		<li>Zerlegen Sie die Glasspritze und die Nadel. Trocknen Sie die Spritze zur Aufbewahrung.</li>
	</ol></li>
</ol>

Revitalisierendes Sehen: Stammzelltherapie bei Netzhautdegeneration

Hwee Goon Tay ist Mitbegründer von Alder Therapeutics AB. Andere Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.

Die subretinale Injektion wurde für die Zellsuspensionstransplantation zur Behandlung von RPE und Netzhauterkrankungen verwendet 23,25,26,27,28,31,40. Dieser Ansatz ist in Studien an Nagetieren nicht nur für Zelltransplantations- und Gentherapieansätze, sondern auch für die Evaluierung n...

Erbliche Netzhauterkrankungen und altersbedingte Makuladegeneration führen zum Verlust von Photorezeptorzellen und schließlich zur Erblindung. Der retinale Photorezeptor ist die äußere Segmentschicht der Netzhaut, die aus spezialisierten Zellen besteht, die für die Phototransduktion (d. h. die Umwandlung von Licht in neuronale Signale) verantwortlich sind. Die Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptorzellen grenzen an die retinale pigmentierte Schicht (RPE)1. Die Photorezeptor-Zellersatztherapie zur Kompensation des Zellverlustes ist ein aufkommender und sich entwickelnder therapeutischer Ansatz. Embryonale Stammzellen (ESCs)2,3,4, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und retinale Vorläuferzellen (RPCs)4,5,6,7,8 wurden verwendet, um die geschädigten Photorezeptorzellen wiederherzustellen. Der subretinale Raum, ein begrenzter Raum zwischen der Netzhaut und dem RPE, ist aufgrund seiner Nähe ein attraktiver Ort, um diese Zellen abzulagern, um beschädigte Photorezeptorzellen, RPE und Mueller-Zellen zu ersetzen 9,10,11.
Gen- und Zelltherapien haben in präklinischen Studien den subretinalen Raum für die regenerative Medizin bei verschiedenen Netzhauterkrankungen genutzt. Dies umfasst die Verabreichung von funktionellen Kopien des Gens oder von Gen-Editierungswerkzeugen in Form von entweder Anti-Sense-Oligonukleotid-Therapie12,13 oder CRISPR/Cas9 oder Base-Editierung über eine auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) basierende Strategie 14,15,16, Implantation von Materialien (z. B. RPE-Folie, Netzhautprothetik 17,18,19) und differenzierten aus Stammzellen gewonnenen Netzhaut-Organoiden 20,21,22 zur Behandlung von Netzhaut- und RPE-bedingten Erkrankungen. Klinische Studien mit hESC-RPE31 im subretinalen Raum zur Behandlung der RPE65-assoziierten Leber-kongenitalen Amaurose (LCA)23,24, der CNGA3-verknüpften Achromatopsie25, der MERTK-assoziierten Retinitis pigmentosa26 und der Choroiderämie 27,28,29,30 haben sich als wirksamer Ansatz erwiesen. Die direkte Injektion von Zellen in die Nähe des geschädigten Bereichs verbessert die Wahrscheinlichkeit einer Zellansiedlung in der entsprechenden Region, der synaptischen Integration und schließlich einer visuellen Verbesserung erheblich.
Obwohl die subretinale Injektion in menschlichen und großäugigen Modellen (d. h. Schwein 32,33,34,35, Kaninchen 36,37,38,39,40 und nicht-menschliche Primaten 41,42,43) etabliert wurde, ist eine solche Injektion im Mausmodell aufgrund der eingeschränkten Größe des Augapfels und enormer Linse, die das Mausauge einnimmt 44,45,46. Genetisch veränderte Modelle sind jedoch nur bei Kleintieren und nicht bei Großtieren (d.h. Kaninchen und nicht-menschlichen Primaten) verfügbar, daher lenkt die subretinale Injektion in Mäuse die Aufmerksamkeit auf die Erforschung neuer therapeutischer Ansätze bei retinalen genetischen Erkrankungen. Drei Hauptansätze werden verwendet, um Zellen oder AAVs in den subretinalen Raum zu bringen, nämlich die transkorneale Route, die transsklerale Route und die Pars-plana-Route (siehe Abbildung 2). Transkorneale und transsklerale Wege sind mit Kataraktbildung, Synechien, Aderhautblutungen und Reflux von der Injektionsstelle assoziiert 11,44,45,47,48,49. Wir haben den Pars-Plana-Ansatz als direkte Visualisierung des Injektionsprozesses gewählt, und die Injektionsstelle kann in Echtzeit unter dem Mikroskop erreicht werden.
Wir haben kürzlich eine Methode beschrieben, mit der humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) unter xenofreien, chemisch definierten Bedingungen unter Verwendung der rekombinanten humanen Retina-spezifischen Laminin-Isoform LN523 in Photorezeptor-Vorläuferzellen differenziert werden können. Da LN523 in der Netzhaut gefunden wurde, stellten wir die Hypothese auf, dass die extrazelluläre Matrixnische der menschlichen Netzhaut in vitro rekapituliert werden könnte und dadurch die Photorezeptordifferenzierung von den hES-Zellen unterstütztwerden könnte 36. Die einzellige Transkriptomanalyse zeigte, dass nach 32 Tagen Photorezeptor-Vorläuferzellen erzeugt wurden, die Zapfenstäbchen-Homöobox und Recoverin coexprimieren. Ein retinal degeneration 10 (rd10) mutiertes Mausmodell, das die autosomale humane Retinitis pigmentosa nachahmt, wurde verwendet, um die Wirksamkeit der day 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen in-vivo zu untersuchen. Die hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen wurden in den subretinalen Raum von rd10-Mäusen bei P20 injiziert, wo Photozeptor-Dysfunktion und -Degeneration andauern36. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung der postkryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die Abgabe in den subretinalen Raum von rd10-Mäusen . Diese Methode kann auch verwendet werden, um AAVs, Zellsuspensionen, Peptide oder Chemikalien in den subretinalen Raum von Mäusen zu verabreichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC &#160;0078-0813-01</td>
			<td>Tobrex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>NDC 0078-0876-01</td>
			<td>Tobradex (3.5 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% Proparacaine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0016-15</td>
			<td>0.5% Alcaine (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Tuberculin syringe</td>
			<td>Turemo</td>
			<td>SS01T2713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Tropicamide</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0355-15</td>
			<td>1% Mydriacyl (15 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine hydrochloride</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0998-0342-05</td>
			<td>2.5% Mydfrin (5 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G Disposable needle</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>305128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 G, 20 mm length blunt needles</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEnTek</td>
			<td>Model: Eve</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 without Vitamin A</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587001</td>
			<td>2%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td>Vetergesic vet (0.3 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKI-7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0742</td>
			<td>5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclosporine</td>
			<td>Novartis</td>
			<td></td>
			<td>260 g/L in drinking water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Winner Industries Co. Ltd.</td>
			<td>1SNW475-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710&#8211;035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hESC cell line H1</td>
			<td>WiCell Research Institute</td>
			<td>WA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02-50</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)</td>
			<td>Prospec-Tany Technogene</td>
			<td>CYT-272</td>
			<td>10 ng/mL36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)</td>
			<td>Ceva Sant&#233; Animale</td>
			<td>KETALAB03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LN-521</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521-02</td>
			<td>1 &#181;g36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre glass syringe (10 mL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S2215</td>
			<td>10 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A13707-01</td>
			<td>1%36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140&#8211;050</td>
			<td>1x36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem XF Media</td>
			<td>Satorius</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>OPMI LUMERA 700</td>
			<td>With Built-in iOCT function</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)</td>
			<td>DUKE-NUS Medical School</td>
			<td></td>
			<td>See media composition36. Basal Medium, 10 &#181;M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 &#181;M Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360&#8211;070</td>
			<td>1 mM36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rd10 mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>B6.CXB1-Pde6brd10/J mice</td>
			<td>Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0695/50</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Cover Slip (12 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4317</td>
			<td>0.5 &#181;M36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel (10 g)</td>
			<td>Dr. Gerhard Mann</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)</td>
			<td>Troy Laboratories</td>
			<td>LI0605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985&#8211;023</td>
			<td>0.1 mM36</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sub-retinal delivery of human embryonic stem cell derived photoreceptor progenitors in rd10 mice

Die Regeneration von Photorezeptorzellen mit humanen pluripotenten Stammzellen ist eine vielversprechende Therapie für die Behandlung von erblichen und alternden Netzhauterkrankungen in fortgeschrittenen Stadien. Wir haben gezeigt, dass die humane rekombinante retina-spezifische Laminin-Isoform-Matrix in der Lage ist, die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) zu Photorezeptor-Vorläuferzellen zu unterstützen. Darüber hinaus hat die subretinale Injektion dieser Zellen auch eine teilweise Wiederherstellung in den rd10-Nagetier - und Kaninchenmodellen gezeigt. Es ist bekannt, dass die subretinale Injektion eine etablierte Methode ist, die verwendet wurde, um pharmazeutische Verbindungen zu den Photorezeptorzellen und der retinalen pigmentierten Epithelschicht (RPE) des Auges zu bringen, da sie sich in der Nähe des Zielraums befindet. Es wurde auch verwendet, um Adeno-assoziierte virale Vektoren in den subretinalen Raum zu bringen, um Netzhauterkrankungen zu behandeln. Die subretinale Verabreichung von pharmazeutischen Verbindungen und Zellen im Mausmodell ist aufgrund der begrenzten Größe des murinen Augapfels eine Herausforderung. Dieses Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren zur Vorbereitung von hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen für die Injektion und die subretinale Verabreichungstechnik dieser Zellen in genetischen Retinitis pigmentosa-Mutanten, rd10-Mäusen . Dieser Ansatz ermöglicht die Zelltherapie in den Zielbereich, insbesondere in die äußere Kernschicht der Netzhaut, wo Krankheiten auftreten, die zu einer Degeneration der Photorezeptoren führen.

Inherited retinal diseases and age-related macular degeneration lead to photoreceptor cell loss and eventual blindness. The retinal photoreceptor is the outer segment layer of the retina comprised of specialized cells responsible for phototransduction (i.e., conversion of light to neuronal signals). The rod and cone photoreceptor cells are adjacent to the retinal pigmented layer (RPE)1. Photoreceptor cell replacement therapy to compensate the cell loss has been an emerging and developing therapeutic approach. Embryonic stem cells (ESCs)2,3,4, induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived RPE cells, and retinal progenitor cells (RPCs)4,5,6,7,8 were used to restore the damaged photoreceptor cells. Sub-retinal space, a confined space between the retina and the RPE, is an attractive location to deposit these cells to replace damaged photoreceptor cells, RPE, and Mueller cells due to its vicinity9,10,11.
Gene and cell therapies have been utilizing the sub-retinal space for regenerative medicine for various retinal diseases in pre-clinical studies. This includes the delivery of functional copies of the gene or gene editing tools in the form of either anti-sense oligonucleotide therapy12,13 or CRISPR/Cas9 or base editing via adeno-associated virus (AAV) based strategy14,15,16, implantation of materials (e.g., RPE sheet, retinal prosthetics17,18,19) and differentiated stem cell-derived retinal organoids20,21,22 to treat retinal and RPE-related diseases. Clinical trials using hESC-RPE31 in the sub-retinal space to treat RPE65-associated Leber congenital amaurosis (LCA)23,24, CNGA3-linked achromatopsia25, MERTK-associated retinitis pigmentosa26, choroideremia27,28,29,30 have been proven to be an effective approach. Direct injection of cells to the vicinity of the damaged area greatly improves the chance of cell settlement at the appropriate region, synaptic integration, and eventual visual improvement.
Even though sub-retinal injection in human and large-eyed models (i.e., pig32,33,34,35, rabbit36,37,38,39,40, and non-human primate41,42,43) has been&#160;established, such injection in the murine model is still challenging due to the constrain of the eyeball size and enormous lens occupying the mouse eye44,45,46. However, genetically modified models are only readily available in small animals and not in large animals (i.e., rabbits and non-human primates), therefore sub-retinal injection in mice draws attention to investigate novel therapeutic approaches in retinal genetic disorders. Three major approaches are being used to deliver cells or AAVs into the sub-retinal space, namely the trans-corneal route, trans-scleral route, and the pars plana route (See Figure 2). Trans-corneal and trans-scleral routes are associated with cataract formation, synechiae, choroidal bleeding, and reflux from the injection site11,44,45,47,48,49. We adopted the pars plana approach as a direct visualization of the injection process, and the injection site can be achieved in real-time under the microscope.
We recently described a method that can differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into photoreceptor progenitors under xenofree, chemically defined conditions using recombinant human retina-specific laminin isoform LN523. Since LN523 was found to be present in the retina, we hypothesized that the extracellular matrix niche of the human retina could be recapitulated in vitro and thereby support photoreceptor differentiation from the hESCs36. Single-cell transcriptomic analysis showed that photoreceptor progenitors co-expressing cone-rod homeobox and recoverin were generated after 32 days. A retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse model that mimics autosomal human retinitis pigmentosa was used to evaluate the efficacy of the day 32 hESC-derived photoreceptor progenitors in-vivo. The hESC-derived photoreceptor progenitor cells were injected into the sub-retinal space of rd10 mice at P20, where photoceptor dysfunction and degeneration are ongoing36. Here, we describe a detailed protocol for the preparation of the post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitors and delivery into the sub-retinal space of rd10 mice. This method can also be used to administer AAVs, cell suspensions, peptides, or chemicals into the sub-retinal space in mice.

Autor im Rampenlicht: Advancing Vision Restoration - Stammzellbasierte Therapie für Netzhauterkrankungen 

Subretinale Verabreichung von Photorezeptor-Vorläuferzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in rd10-Mäusen

My research focuses on the development of stem cell based therapy for advanced stages of retinal diseases that cause photoreceptor degeneration. The goal of our research is to replace the loss of photoreceptors in patients with clinically safe and functional photoreceptor progenitors with the aim of improving their visual acuity or even restoring their vision. The main preclinical model is mice, but their small sized eyeball make it challenging to inject materials, especially under the retina.Developing the skill to perform successful subretinal injections requires patience and perseverance. We have successfully developed a laminin base for the receptor differentiation method that is able to generate photoreceptor progenitors in 32 days. The subretinal transplantations of this photoreceptor progenitors cell suspensions in the rodents resulted in synaptic connectivity between the holes and graft in the eyes.This has led to partial visual restoration. Our approach is simple, the right visualization helps the surgeon handle the needle to the area of interest.

Die 10-μl-Glasspritze wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammengebaut (Abbildung 1), und die stumpfe Nadel, die zur Abgabe der Zellsuspension/des Mediums verwendet wird, ist in Abbildung 1B dargestellt. Verschiedene Ansätze für die subretinale Injektion sind in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Protokoll beschreiben wir den Pars-Plana-Ansatz (Abbildung 2C). Die stumpfe Nadel, die auf ei...

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Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Präparation von post-kryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die subretinale Verabreichung dieser Zellen in rd10-Mäusen .

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

Meine Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung einer stammzellbasierten Therapie für fortgeschrittene Stadien von Netzhauterkrankungen, die eine Degeneration der Photorezeptoren verursachen. Das Ziel unserer Forschung ist es, den Verlust von Photorezeptoren bei Patienten durch klinisch sichere und funktionelle Photorezeptor-Vorläuferzellen zu ersetzen, mit dem Ziel, ihre Sehschärfe zu verbessern oder sogar ihr Sehvermögen wiederherzustellen. Das wichtigste präklinische Modell sind Mäuse, aber ihr kleiner Augapfel macht es schwierig, Materialien zu injizieren, insbesondere unter die Netzhaut.Die Entwicklung der Fähigkeit, erfolgreiche subretinale Injektionen durchzuführen, erfordert Geduld und Ausdauer. Es ist uns gelungen, eine Lamininbasis für die Rezeptordifferenzierungsmethode zu entwickeln, die in der Lage ist, Photorezeptor-Vorläuferzellen in 32 Tagen zu erzeugen. Die subretinalen Transplantationen dieser Photorezeptor-Vorläuferzellsuspensionen in den Nagetieren führten zu einer synaptischen Konnektivität zwischen den Löchern und dem Transplantat in den Augen.Dies hat zu einer teilweisen optischen Restaurierung geführt. Unser Ansatz ist einfach, die richtige Visualisierung hilft dem Chirurgen, die Nadel in den gewünschten Bereich zu bringen.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

669 Aufrufe.  Singapore Eye Research Institute. Meine Forschung konzentriert sich auf die Entwicklung einer stammzellbasierten Therapie für fortgeschrittene Stadien von Netzhauterkrankungen, die eine Degeneration der Photorezeptoren verursachen. Das Ziel unserer Forschung ist es, den Verlust von Photorezeptoren bei Patienten durch klinisch sichere und funktionelle Photorezeptor-Vorläuferzellen zu ersetzen, mit dem Ziel, ihre Sehschärfe zu verbessern oder sogar ihr Sehvermögen wiederherzustellen. Das wichtigste präklinische Modell sind...

Serie: Autor im Rampenlicht: Advancing Vision Restoration - Stammzellbasierte Therapie für Netzhauterkrankungen 

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

Forschung

Medizin

Reviving the Cryopreserved Day 32 hESC-Derived Photoreceptor Progenitors

Begin by placing PRDM in a water bath set at 37 degrees Celsius. Remove a cryovial containing day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells from liquid nitrogen, and keep it on dry ice. Then thaw the cryovial in a water bath at 37 degrees Celsius for three to five minutes.Re-suspend the cells in one milliliter of PRDM. Centrifuge them at 130G for four minutes After removing the supernatant, re-suspend the pellet in one milliliter of PRDM. To count the cells, take 10 microliters of the cell suspension and mix with 0.2%trypan blue, following the manufacturer's instructions.Pipette the cell mixture into the cell counting chamber slide, and determine the cell number and viability using an automated cell counter. If cell viability is above 70%centrifuge the remaining cell suspension at 130G for four minutes. Remove the supernatant and re-suspend the cell pellet in PRDM for transplantation.Using a 10 microliter pipette tip, re-suspend cell clumps in the microfuge tube until no clumps are visible. Load the suspension into a 33-gauge injection syringe and confirm the extrusion of cell solution through the needle.

Wiederbelebung der kryokonservierten Tag 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläufer

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in rd10 Mice

Sub-Retinal Delivery of the hESC-Derived Photoreceptor Progenitor Cells in  rd10  Mice  

To begin, take an anesthetized mouse and apply one drop of 1%tropicamide and 2.5%phenylephrine into the eye to dilate the pupil. Then apply an ophthalmic gel to the cornea to prevent dryness and anesthesia induced cataracts. Next, set up an upright operating microscope with a direct light path in a sterile environment to perform the subretinal injection.To prepare the 10 microliter glass syringe, detach the needle hub and attach the 33 gauge blunt needle. Take the metal hub cover and securely fasten the needle onto the syringe. Flush the needle with distilled water to test leakage and needle patency.Then empty the syringe and set it aside carefully. Next, position the anesthetized mouse on a cushion and orient the treatment eye toward the microscope's objective. Apply 0.5%proparacaine hydrochloride and wait for 30 seconds.Then apply 150 microliters of ophthalmic gel to the eye and affix a round cover slip. Perform a preliminary eye examination observing the cornea, iris, pupil, lens, and conjunctiva. Adjust the focal plane to visualize the fundus of the mouse eye through the pupil.Then align the head so that the optic head aligns with the center of the pupil. Afterwards, tap the base of the tube containing HESC derived photoreceptor progenitors to get a uniform cell suspension. Using a 10 microliter glass microliter syringe with a 33 gauge blunt needle, draw two microliters of cell mixture.Use a 30 gauge disposable needle to create a sclerectomy wound positioned two millimeters behind the limbus. Maintain the needle's angle at approximately 45 degrees to prevent contact with the lens. Once the needle tip becomes visible within the eye, carefully retract the needle.Discard the used needle into a sharp bin to prevent needle prick injuries. Now take the glass syringe and insert the blunt needle into the sclerectomy wound. Advance the blunt needle without touching the lens until it reaches the opposite retina of the entry wound.Gently penetrate the retina until a pressure branch on the sclera is seen. Then inject two microliters of the cell suspension or PRDM media into the subretinal space while maintaining gentle pressure on the syringe. The formation of a visible bleb indicates successful injection.Wait 10 seconds to allow the cells to settle down. Gently retract the needle from the eye. To visualize the bleb, move the mouse head to position the eye under the microscope and secure the position by gently holding the head.For intraoperative OCT, use the IOCT function on the operating microscope and select cube on the OCT screen. Position the scanning area on the bleb by pressing the arrow buttons. To adjust the OCT, slide centering and focus for the best OCT quality, press capture or scan to acquire the OCT scan of the bleb area and review the images to check the quality of the scans.Finally, remove the cover slip and gently clean the gel from the eye using gauze. Administer antibiotic ointment once after the injection to prevent infection. The OCT scan revealed distinct HESC entities suspended in the cell treated eye.In contrast, the media treated eye displayed unclouded fluid, void of cells within the subretinal space.