We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

動物：カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）で飼育野生型C57BL / 6Jマウス。 17週齢、雄と雌のマウスが含まれて - 全ての動物は、11の間でした。全てのマウスは、グループに収容され、食物および水を自由に摂取して12：12明/暗サイクルで維持しました。全ての実験は、眼科及び視覚研究における動物の使用のためのUCLAとビジョンでの研究のための協会と眼科文の機関のガイドラインに従って行われました。 注：すべての薬や注射用薬剤は、米国薬局方（USP）グレードです。 1.外科の準備<ol><li> 100mg / kgのケタミンおよび生理食塩水の混合物中に8mg / kgのキシラジンの腹腔内注射でマウスを麻酔。マウスは全くつま先のピンチや角膜タッチ反射を持っていないような深さに麻酔を管理します。 </li><li>循環水パッドと37.0℃の体温を維持。 </li><li> 2.5％フェニレフリンアイdの生徒を拡張ROPSと可視化を容易にするために、ウィスカーをトリミング。ひげは、マウスに重大な感覚入力を提供し、したがって、ウィスカートリミングは、眼へのブロック明確なアクセスものではなく、ウィスカのベースに一部のみを削除する必要があります。我々の経験では、マウスは、この手順の後に通常の回復を示しています。メチルセルロースの目が乾燥を防ぎ、麻酔誘発される一過性白内障13を最小限に抑えるために低下し適用します。 </li><li>手術前に器具を滅菌する（ すなわち、ベタジンおよびエタノールまたはホットビーズ）。 </li><li>可視化が実行される場合（下記のセクション3を参照）を無菌環境（ すなわち 、安全キャビネット）に（0.9％生理食塩水を使用して0.01％）で希釈フルオレセインを準備します。 </li></ol> 2.インジェクションサイトの準備<ol><li>適切な注入量（ 例えば 、0.3から1.0マイクロリットル）を有するシリンジ（ 例えば 、5μlのシリンジ）を準備します。 </li><li>目が上向きおよびジではっきりと見えるようにマウスを置き顕微鏡をssecting。 </li><li>優しく細かい傾いてピンセットで時間的結膜を挟ま。湾曲したVannasはさみを用いて、約90度の周方向の切開を行います。 </li><li>根底にあるテノン嚢と繰り返し手順2.3。 </li><li>経鼻的に地球を回転させながら、微細な先端鉗子で周囲の結合組織を切除。視神経への一時的な注射部位約0.5ミリメートルに取り組みます。眼窩の中断を避けるために細心の注意を使用してください。 </li></ol> 3.強膜切開および網膜下注射注：この手順を学習しながら、0.9％の生理食塩水で0.01％のフルオレセインの注入は、可視化を支援するために使用することをお勧めします。フルオレセインの地形分布が効果的に眼底イメージング（以下のセクション4を参照）で文書化することができます。 <ol><li>優しく22.5度眼科刃でアイカップを掻くことにより、注射部位での小強膜切開を行います。この切開ショウ唯一の針の先端は、強膜を通過することを可能にするのに十分な大きさで、LD。 </li><li>面取り33 G針を挿入します（5角度を付ける-ベベルの対面と網膜に傾斜した平行な強膜切開に10°を所望の容積（目的を学習するための0.01％フルオレセインの例えば、0.3〜1.0μl）を注入します。 注：完全に各注射の前に、連続した適切な溶媒の洗浄およびDI水で洗浄することにより、注射器の無菌性を維持します。 </li><li>針を動かすことなく、さらには圧力でゆっくりと（〜3秒以上）プランジャーを押し下げます。 注：針が網膜下腔にあるとき、プランジャを押しながら、わずかな抵抗が感じられるだろう。針が強膜またはRPEに浸透していない場合は、針が網膜、および高抵抗を穿刺する場合、最小の抵抗に全く存在しないであろう。 </li><li>逆流を最小限に抑えるために、針を引き抜く前に、数秒待ってください。 </li><li>滅菌緩衝生理食塩水で目を洗浄し、目の時間を確保します通常の位置に戻って回転させました。 </li></ol> 10月と眼底イメージングによって網膜剥離の4評価<ol><li>注射の質を評価するために、注射直後OCT撮像を行うと網膜の構造を評価するために、必要に応じて適切なタイミングでポスト噴射を指します。 注：同様の研究において、OCTの使用の例は先に7,14に記載されています。 <ol><li>調整し、注射部位を標的とするためにOCT画像の位置を合わせます。注射部位は正中線と視神経乳頭への一時的な0.5ミリメートルでなければなりません。必要に応じて剥離がフレーム外であるか、最適に中央にない場合は繰り返します。 </li></ol></li><li>網膜剥離を視覚化し、専用の顔眼底イメージング7,14に注入領域を染めます。 注：OCT撮像システムが利用できない場合は、練習用ベクターとフルオレセインの少量の注入は、フルオレセイン血管を行う任意の眼底カメラと可視化を可能にします同じ励起波長ブロッキングフィルタを使用グラフィー。ハイパー蛍光の局所領域は、血管系の下に表示され、網膜下腔が正確に標的された場合、血管系は、シャープと明確な境界を持っています。注射からブレブのエッジはハイポ蛍光へのハイパーからの移行で区画されます。いくつかの機器は、マウスのためのこの機能を提供します。ここで使用される機器は他の場所14に記載されています。 </li></ol> 5.術後ケア<ol><li>注入された眼の角膜表面に三重の抗生物質眼科クリームの厚いコートを適用します。 </li><li>回復のためのクリーンな孤独なケージにマウスを置きます。彼らは完全に回復されるまで、手術を受けたマウスを結合しないでください。 </li><li>麻酔回復時の呼吸と温度を監視します。彼らは胸骨横臥位を維持することができるまで、動物を監視します。 </li><li>追加の適切な術後の監視を行いますそして術後疼痛管理のためのカルプロフェンの皮下注射（5ミリグラム/ kg）を含む治療。 </li></ol>電図による網膜機能の6.アセスメント（ERG） <ol><li> ERG分析プレ噴射を実行し、適切な時間に網膜機能を評価するために、必要に応じてポスト噴射。注射は網膜下腔に行われた場合、網膜剥離は、72時間以内に解決する必要があります。 <ol><li>以前に14,15を説明したように、注射の前と後の網膜機能を評価するための標準的なERG技術を使用してください。 </li></ol></li></ol> 7. 3D復興胞ボリューム定量化注：ビューの枠内全体剥離を網羅する高コントラストの10月スキャンが使用するために最適です。 ImageJの/フィジー17,18とIMARIS使用したが、他のソフトウェアを使用することができます。 <ol><li>関心のBスキャンをエクスポートし、ImageJを/フィジーと作物（イメージ&gt;クロップ）10月SCの部分へのインポート長方形の選択ツールを使用してモデル化します。 <ol><li>コントラスト調整（イメージ&gt;&gt;明るさ/コントラストを調整）し、ラインを持つ2つのセクションを接続することにより、欠落している境界線を描きます。 </li><li>感光層へのRPEにまたがるラインツール（保持シフト）の直線を描画します。メジャー（測定&gt;分析）ラインの長さは、ステップ7.8の最大剥離のサイズを取得します。 </li></ol></li><li>インポートは、「RGBグレーに「プラグインとのMATLAB Compiler Runtimeを使用して（材料の表を参照してください）3D-再構築ソフトウェアにフレームをクロップ。 </li><li> OCTスキャン（X、Y、Z）から較正パラメータを用いて、（画像のプロパティの下）のボクセルサイズを設定します。 </li><li>第4流路を作成するために、各チャネルに等しい重みで、（画像のプロパティの下）「RGBグレーに「プラグインを実行します。オリジナルの赤 - 緑 - 青のチャンネルを削除します。 </li><li>コントラスト変化を使用して、灰色のチャネルを反転。店舗イメージ。 </li><li> &quot;[追加]をクリックします3Dビュー]タブでEW面」ボタン、および表面を作成するためのガイド付きの4段階のプロセスを開始します。 <ol><li>表面レベルの詳細（ステップ4の1）を設定します。 注：我々の経験では12.0から8.0が最も効果的な範囲でした。 </li><li> 7.1.2で測定された最大剥離のサイズよりやや少ないに（背景の選択の下で）最大球サイズを設定します。灰色のチャネル反転（ステップ4の2）の表面を作成し、元に戻します。 </li><li>網膜の外側に負のスペースと剥離の表面が接触（4のステップ3）で来ることはありませんので、最大値にしきい値を設定します。 </li><li>ボクセルの数にフィルタタイプを設定し、サイズによって剥離サイト内の負の空間を分離します。表面（ステップ4の4）を終了します。 注：剥離面のボリュームが統計]タブにボリュームの下に位置しています。 </li></ol></li></ol>

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A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li></ol>

None of the authors have any commercial disclosures.

網膜下注射は、ウイルスベクターの送達のための選択の方法であり、光受容体と基礎研究と臨床治療の両方でRPEを操作するための幹細胞を利用した治療法。患者では、網膜下注射は一般的に、直接可視化と針で、扁平部で前部強膜切開と網膜の後部コア硝子体切除術と浸透を行っています。目が偽すでにある場合を除き白内障形成が途中で発生するための最も硝子体切除手順と同じように、?...

網膜下注射は、光受容体と基礎となるRPE 1,2に及ぼす影響を研究するためにマウスの網膜に細胞およびウイルス薬剤を送達するための主要な手段です。マウスのほとんどの網膜下注入プロトコルは、経角膜や赤道に経強注射部位の前方（ 図1）を使用します。このアプローチは、レンズのニッキングし、得られた白濁、感覚神経網膜および虹彩、網膜出血、実質的な網膜剥離と永続的な網膜下浮腫3-9の硝子体、浸透の完全性の破壊を含み、固有の巻き添え被害をもたらすことができます。実験操作は、治療的介入3,7,10,11の効果を評価するために、これらの影響を克服しなければなりません。この研究では、これらの合併症を回避する後方経強注入法の詳細な説明および検証を提供し、外傷を最小限にし、サブ標的の高い成功率を有しています網膜スペース。 マウスにおいて、網膜下腔をターゲット注射は、多くの場合、実行するのが非常に困難であり、ほとんどの研究者は、ベクターが誤った場所に配信されているか、重要な網膜の損傷があり、完全な網膜剥離6で例えばこれに失敗した試行の高周波を発生します。なぜなら注入合併症の分析から除外した目の数は、典型的には、マウスの研究で報告されていませんが、私たち自身の経験にし、他の研究者との議論では、失敗した注射の数は50％もの高さと経験に依存して変化させることができ、注射を行っている研究者の能力。注射の成功は、典型的には、直接眼底イメージングおよび/または光コヒーレンストモグラフィー（OCT）7,9によって評価されます。マウスでの網膜下注射のための高い成功率で簡単に習得方法の実験を早めるとTREの前臨床試験のコストを削減することができます米国における失明の主要な原因である網膜疾患のためatments。 後部、ここで説明する経強網膜下注入技術は、臨床および前臨床プロトコル9,12から適応したものです。注射したマウスで行われ、非侵襲的診断評価は軽度と高度に局在化損傷を示し、追加担保レンズ、網膜およびRPE損傷を欠いています。それにより、このような研究に関連するコストを低減すること、 - （90％以上80）さらに、比較的少ない練習で、実験者は、高い成功率と、これらの結果を達成することができます。この手順は、細胞、ウイルス、または前臨床試験における光受容体および/またはRPEへの薬理学的治療介入を提供するために、容易に実験的介入を評価するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Hamilton Model 62 RN SYR</td><td>Hamilton</td><td>87942</td><td>Syringe x 1</td></tr><tr><td>Hamilton Needle 33 G, 1.0&quot;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Needles x 6</td></tr><tr><td>Vannas Curved Scissors</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>1347</td><td>5 mm Blade</td></tr><tr><td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td><td>Wilson Ophthalmic Corp.</td><td>91204</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;nbsp;</td><td>Phoenix</td><td>NDC 57319-609-02</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Anased</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>NDC 61311-482-10</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-253-10</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>0.9% Saline USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-50</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Antibiotic Ointment</td><td>Akorn</td><td>NDC 17478-235-35</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>Water Circulating Pump</td><td>Gaymar</td><td>TP-500 T/Pump&amp;nbsp;</td><td>P/N 07999-000</td></tr><tr><td>sd-OCT</td><td>Bioptigen</td><td>R-Series</td><td>Commercial</td></tr><tr><td>Fundus Camera</td><td>Phoenix Research Laboratories</td><td>MICRON III</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Type 3</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>5385-3SU</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Phenylephrine</td><td>Paragon BioTeck</td><td>NDC 42702-102-15</td><td>Ophthalmic</td></tr><tr><td>IMARIS8</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Version 8.1.2</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>V1.8.0_77</td></tr><tr><td>Hypromellose&amp;nbsp;2.5%</td><td>Goniovisc</td><td>AX0401</td><td>Methylcellulose</td></tr><tr><td>Eye Drops (Rinse)</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td></td><td>Saline Solution</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Fostec</td><td>P/N 20520</td><td>Light source</td></tr></tbody></table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

網膜下注射は成功し、感光体への直接曝露し、網膜色素上皮（RPE）を持つinterphotoreceptor /網膜下の区画へのタンパク質の治療的介入、ウイルス剤、および細胞を送達するために、ヒトおよびげっ歯類の両方で使用されてきました。プラスミノーゲンの網膜下注射、ならびに最近の前臨床および臨床試験は、進行網膜疾患を有する個体にウイルスベクターおよび幹細胞の送達の安全性および/または有効性を実証しています。網膜疾患、特に遺伝性網膜ジストロフィーのマウスモデルは、これらの治療を試験するために不可欠です。げっ歯類で最も一般的な注入手順は、網膜の前方アプローチで小経角膜または経強切開を使用することです。このアプローチでは、注射針は、感覚神経網膜は、基礎となるRPEを中断し、挿入時に簡単にニックレンズは、非侵襲imagiのレンズ混濁や障害を引き起こすことができます浸透しますngの。経強を経由して網膜下腔へのアクセス、後方アプローチは、これらの問題を回避：針は、網膜浸透せず、視神経から約0.5mm強膜を横断し、硝子体を破壊し回避することができます。巻き添え被害は、焦点強膜切開と過渡、漿液性網膜剥離の影響に関連したものに限定されています。この方法の簡単さは、眼の損傷を最小限に抑え、迅速な網膜再付着し、回復を確保し、低故障率を持っています。最小限の網膜の損傷およびRPEは、有効性の明確な評価と治療薬自体の直接的な効果を可能にします。この原稿は、ウイルスベクター、薬剤、高い有効性、最小限の損傷、および高速回復を有するマウスにおける網膜下腔への細胞または人工多能性幹（iPS）細胞を幹細胞を標的化するために使用することができる新規な網膜下注入技術が記載されています。

アプローチの後方経強網膜下注射は（N = 8）、1.0μL（n = 5）を、0.01％のフルオレセイン0.5μL、0.3μL（N = 18）の注射で16野生型マウスからの31の健康な眼に対して行いました。一つ目は、原因の構造と機能解析を防止し、既存の角膜混濁に注入から除外されました。すべての注入された目は、このレポートに含まれています。意図しない網膜剥離は、硝子体への神経感覚?...

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An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

網膜下腔にアクセスするための代替と検証済みの注入方法<i&gt;経由で</i&gt;経強後方アプローチ

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

an-alternative-validated-injection-method-for-accessing-subretinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

13.1K ビュー.  University of California, Los Angeles. Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

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Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

医学

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

神経科学

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation of Subretinal Grafts in a Retinal Degeneration Mouse Model

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. Subretinal transplantation of therapeutic donor cells into mouse recipients is challenging due to the limited surgical space allowed by the small volume of the mouse eye. We developed a trans-scleral surgical transplantation platform with direct transpupillary vision guidance to facilitate the subretinal delivery of exogenous cells in mouse recipients. The platform was tested using retinal cell suspensions and three-dimensional retinal sheets collected from rod-rich Rho::EGFP mice and cone-rich OPN1LW-EGFP;NRL-/- mice, respectively. Live/dead assay showed low cell mortality for both forms of donor cells. Retinal grafts were successfully delivered into the subretinal space of a mouse model of retinal degeneration, Rd1/NS, with minimum surgical complications as detected by multimodal confocal scanning laser ophthalmoscope (cSLO) imaging. Two months post-transplantation, histological staining demonstrated evidence of advanced maturation of the retinal grafts into &#39;adult&#39; rods and cones (by robust Rho::EGFP, S-opsin, and OPN1LW:EGFP expression, respectively) in the subretinal space. Here, we provide a surgical platform that can enable highly accurate subretinal delivery with a low rate of complications in mouse recipients. This technique offers precision and relative ease of skill acquisition. Furthermore, the technique could be used not only for studies of subretinal cell transplantation but also for other intraocular therapeutic studies including gene therapies.

This protocol presents a transpupillary vision-guided trans-scleral approach to safely and precisely deliver subretinal cellular grafts, with a low rate of surgical complications, in mouse recipients with or without retinal degeneration.

網膜変性マウスモデルにおける網膜下移植片の経瞳孔ガイド下経強膜移植

Transplantation of photoreceptor cells and retinal pigment&#160;epithelial (RPE) cells provide a potential therapy for retinal degeneration diseases. ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

生物学

視力の活性化:網膜変性症に対する幹細胞治療

Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal diseases at advanced stages. We have shown human recombinant retina-specific laminin isoform matrix is able to support the differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) to photoreceptor progenitors. In addition, sub-retinal injection of these cells has also shown partial restoration in the rd10 rodent and rabbit models. Sub-retinal injection is known to be an established method that has been used to deliver pharmaceutical compounds to the photoreceptor cells and retinal pigmented epithelial (RPE) layer of the eye due to its proximity to the target space. It has also been used to deliver adeno-associated viral vectors into the sub-retinal space to treat retinal diseases. The sub-retinal delivery of pharmaceutical compounds and cells in the murine model is challenging due to the constraint in the size of the murine eyeball. This protocol describes the detailed procedure for the preparation of hESC-derived photoreceptor progenitor cells for injection and the sub-retinal delivery technique of these cells in genetic retinitis pigmentosa mutant, rd10 mice. This approach allows cell therapy to the targeted area, in particular the outer nuclear layer of the retina, where diseases leading to photoreceptor degeneration occur.

著者スポットライト:視力回復の進歩-網膜疾患に対する幹細胞ベースの治療 

We describe a detailed protocol for the preparation of post-cryopreserved hESC-derived photoreceptor progenitor cells and the sub-retinal delivery of these cells in rd10 mice.

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

Regeneration of photoreceptor cells using human pluripotent stem cells is a promising therapy for the treatment of both hereditary and aging retinal ...

網膜下腔にアクセスするための代替と検証済みの注入方法

要約

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懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

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地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達