Name: insights into the interactions of amino acids and peptides with inorganic materials using single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2017-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
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This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.

1. Tipp Modifikation <ol><li> Kauf Siliziumnitrid (Si 3 N 4) AFM Kragarmen mit Siliziumspitzen (nominal Auslegerradius ~ 2 nm). </li><li> Reinigen Sie jede AFM Cantilever von 20 min in wasserfreiem Ethanol getaucht. Trocken bei Raumtemperatur. Behandeln dann die Auskragungen von ihnen zu O 2 Plasma für 5 Minuten ausgesetzt wird . </li><li> Hängen Sie das saubere oben genannten Tipps (3 cm) einer Lösung, die Methyltriethoxysilan und 3- (Aminopropyl) triethoxysilan in einem Verhältnis von 15: 1 (v / v) in einem Exsikkator unter einer inerten Atmosphäre (entweder Stickstoff oder Argon) und schließen Sie den Exsikkator eine Vakuumpumpe. Vakuum 2 h eine Monoschicht dieser beiden Arten von Misch Silanverbindungen zu bilden. </li><li> Verwenden Sie Halter eine Metallspitze (hergestellt für diesen Prozess) die Spitzen auf einer heißen Platte zu platzieren. Dann trocknen Sie die Tipps für 10 Minuten bei 70 ° C unter atmosphärischen Bedingungen. Vor dem Gebrauch reinigen Sie die Kochplatte, metallischen Halter und Pinzette unter Verwendung von Ethanol. </li><li> Kühlen Sie die Tipps bei Raum temperatur, und tauchen dann die Spitzen in eine Lösung von Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimid (Fmoc-PEG-NHS, MW 5.000 Da) bei einer Konzentration von 5 mM in Chloroform, enthaltend 0,5% (v / v) Triethylamin 1 h bei Zimmertemperatur. </li><li> Tauchen Sie die Spitzen in Chloroform für 5 min und dann tauchen sie in Dimethylformamid (DMF) für weitere 5 min. Um die Fmoc-Gruppe der gebundenen PEG-Molekülen zu entschützen, tauchen die Spitzen in 20% Piperidin (v / v) in DMF für 30 min. Tauchen Sie die Spitzen in DMF für 4 min und dann in N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) für weitere 4 min. Wiederholen Sie den sequentiellen Eintauchens dreimal. </li><li> Für die Kopplung von Aminosäuren, tauchen die Spitzen in einer Lösung, die N-terminal geschützten Aminosäure (AA) / Diisopropylethylamin (DIPEA) / 2- (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluophosphate (HBTU), in einem molaren Verhältnis von 1: 1: 1 bei einer Gesamtkonzentration von 30 mM in 5 mL NMP für 1,5 h. </li><li> Für Peptidkupplung, tauchen die Spitzen in eine 5 ml Lösung containing 40 mg des geschützten Peptids (N-Terminal und Seitenketten, beispielsweise Fmoc-Gln (Trt) -Pro-Ala-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Arg (PBF) -Tyr (tBu) -COOH). 15 mg 2- (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat (HBTU) und 5 ml DIPEA in NMP für 2 h. </li><li> Tauchen Sie die Spitzen in NMP für 4 min. Dann wird das Aufreiben Frei / nicht - umgesetztes NH 2 durch die Acetylgruppe zu schützen, tauchen die Spitzen für 30 min in einem Gemisch aus Essigsäureanhydrid / DIPEA in einem Molverhältnis von 4: 1 und einer Gesamtkonzentration von 0,65 M in NMP. </li><li> Für Peptidkupplung, führen zwei zusätzliche Schritte. <ol><li> Um die Seitenketten des Peptids zu entschützen, tauchen die Spitzen in einer Lösung, die 95% TFA, 2,5% Triisopropylsilan und 2,5% Wasser für 1 h, und dann waschen mit Chloroform und DMF. </li><li> Um die Fmoc-Gruppe des Peptids zu entfernen, die Spitzen in 20% Piperidin (v / v) in DMF für 30 Minuten tauchen. </li></ol></li><li> dip sequentiell die Peptid / Aminosäure-funktionalisierend-Tipps für vier Minuten jeweils in DMF (für Peptide) oder NMP (für Aminosäuren), Chloroform, 50% Ethanol und Wasser. trocknen schließlich die Spitze in der Luft. </li></ol> 2. Oberflächenvorbereitung <ol><li> Bereiten Glimmer. Cleave der Substrate (9,9 mm Durchmesser) vor jedem Gebrauch von Scotch Klebeband. Dann waschen Sie die Oberflächen mit dreifach destilliertem Wasser (TDW). </li><li> Bereiten TiO 2 -beschichteten Silizium. <ol><li> Schneiden Sie die Siliziumscheibe (100) in 2 cm große Quadrate einen Diamantstift. </li><li> Legen Sie das Substrat in einem 15 ml-Reagenzglas mit Aceton gefüllt und beschallen es für fünf Minuten in einem Ultraschallbad. Dann setzen Sie diese Oberfläche in einem 15 ml-Reagenzglas mit Isopropanol gefüllt und beschallen es für 5 min. Trocknen des Substrats unter Verwendung von Stickstoff. </li><li> Auflösen des oberflächenaktiven Mittels (zB Byk-348) in Ethanol mit 5% (Gewicht / Volumen) Lösung herzustellen. Dann fügen 0,02 ml der Tensidlösung in einen 2 ml 30% TiO 2 -Dispersion. </li><li> Aus der erhaltenen Lösung, 0 tropfen gegossen.2 mL auf einem sauberen Si-Substrat. </li><li> Tempern, diese Drop-gegossenen Oberflächen bei 250 ° C für 2 h in Luft. 41 </li></ol></li></ol> 3. Die Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen <ol><li> Bringen Sie die gewünschte Oberfläche mit einem metallischen Halter des AFM mit handelsüblichen Zweikomponenten-Klebstoff. Platzieren Sie den metallischen Halter in dem Glashalter des AFM, das als eine kleine Petrischale geformt ist. Füllen Sie diesen Halter mit Tris-Puffer (50 mM pH = 7,4) oder einem beliebigen Medium. Dann legen Sie die Halterung an der AFM-Stufe unterhalb der Spitzenhalter. </li><li> Kalibrieren Sie die AFM - Cantilever mit Federkonstanten im Bereich von 10 bis 30 pN / nm 26 die thermische Fluktuationsmethode (in der AFM - Software im Lieferumfang enthalten) mit einer absoluten Unsicherheit von etwa 10%. </li><li> Messen der Kraft der Wechselwirkung durch Annäherung an die Aminosäure oder Peptid-funktionalisierten Spitze auf das Substrat, bis es in Kontakt mit dem Substrat mit einer KompressionKraft von ~ 200 pN und dann sofort die Spitze bei verschiedenen Geschwindigkeiten von 0,1 bis 0,8 um / s für einen Abstand von ~ 200 nm zurückzuziehen. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Konvertieren Sie die Ablenkungswerte (V) zu zwingen, durch die Photodiode Empfindlichkeit multipliziert (V / m) und mit Hilfe der experimentell bestimmten Federkonstante. 42 Dies wird automatisch durch die AFM - Software. <ol><li> FD-Kurven mit einem einzigen Molekül Ereignisse, Rekord mehrere hundert Kurven (800-1500) zu erhalten. Erhalten zwei Peaks in einem Einzelmolekül-Kurve: die erste Spitze zeigt unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und der Oberfläche und der zweite Peak entspricht dem spezifischen Wechselwirkung des Moleküls mit der Oberfläche. Wenn die Kurve FD mehr als diese zwei Spitzen enthalten, entsorgen Sie sie nicht bei der Berechnung der wahrscheinlichsten Kraft. HINWEIS: Nur einzelne Haftung Ereignisse werden auf ein Konto genommen (von 10 bis 30% der Kurven). 43 </li></ol></li><li&gt; Um die scheinbare Belastungsgeschwindigkeit, fit mindestens 50 Kraft in Abhängigkeit vom Abstand Kurven mit der wurmartige Kette (WLC) Modell 44 kurz vor dem Bruch berechnen eine Reihe von Belastungsgeschwindigkeiten zu erhalten, die zur Herstellung von Histogrammen dann verwendet werden , die scheinbaren Beladungsraten. Leiten Sie die Trennkräfte zwischen den Peptiden / Aminosäuren und Oberfläche aus dem Sprung in Kraft, nachdem der Ausleger von dem Substrat zu trennen. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Schritte 1.3, 1.4 und 1.7 in dem Protokoll mit umfangreichen Sorgfalt erstellt und auf sehr sanfte Weise werden sollte. In Schritt 1.3, sollte die Spitze nicht mit dem Silan-Gemisch in Kontakt stehen und die Silanisierung Verfahren in einer inerten Atmosphäre (frei von Feuchtigkeit) durchgeführt werden sollte. 45 Dies wird getan , um Mehrschichtbildung zu verhindern und weil Silanmoleküle leicht hydrolysieren in Gegenwart von Feuchtigkeit. 45 <p class="jove_cont...

Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und anorganischen Mineralien führt zum Aufbau von Verbundmaterialien mit besonderen Eigenschaften. Dazu gehören Materialien mit hoher mechanischer Festigkeit oder einzigartigen optischen Eigenschaften. 1, 2 erzeugt beispielsweise die Kombination des Proteins Kollagen mit dem Mineral Hydroxylapatit entweder weichen oder harten Knochen für unterschiedliche Funktionalitäten. 3 Kurze Peptide können auch anorganische Materialien mit hoher Spezifität zu binden. 4, 5, 6 Die Spezifität dieser Peptide ist für die Entwicklung neuer magnetischen und elektronischen Materialien, 7, 8, 9 nanostrukturierten Materialien, Züchten von Kristallen Herstellung, 10 und Synthese von Nanopartikeln. 11 Das Verständnis der Mechanismus Wechselwirkungen zwischen Peptiden oder Proteinen und anorganischen Materialien zu Grunde liegen , damit es uns ermöglichen , neue Verbundwerkstoffe mit verbesserten adsorptive Eigenschaften zu entwerfen. Zusätzlich kann, da die Zwischenphase von Implantaten mit einer Immunantwort durch Proteine ​​vermittelt wird, besser auf die Wechselwirkungen von Proteinen mit anorganischen Materialien zu verstehen, wird sich verbessern unsere Fähigkeit Implantate zu entwerfen. Ein weiterer wichtiger Bereich, die Proteine ​​interagieren mit anorganischen Oberflächen ist die Herstellung von Antifouling-Materialien beinhaltet. 12, 13, 14, 15 Biofouling ist ein unerwünschter Vorgang , bei dem Organismen an einer Oberfläche befestigen. Es hat viele schädliche Auswirkungen auf unser Leben. Zum Beispiel führt Biofouling von Bakterien auf medizinischen Geräten im Krankenhaus erworbenen Infektionen. Biofouling von Meeresorganismen auf Booten und großen Schiffen erhöht die<html> Verbrauch von Kraftstoff. 12, 16, 17, 18 Einzelmolekülkraftspektroskopie (SMFS), einem AFM verwendet wird, kann direkt auf die Wechselwirkungen zwischen einer Aminosäure oder einem Peptid mit einem Substrat zu messen. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 auch andere Methoden wie Phage - Display, 27, 28 Quarzkristall - Mikrowaage (QCM) 29 oder Oberflächenplasmonresonanz (SPR) 29, 30, 31, 32,&quot;ref&gt; 33 messen die Wechselwirkungen von Peptiden und Proteinen an anorganischen Oberflächen in bulk. 34, 35, 36 Dies bedeutet, dass die Ergebnisse durch diese Verfahren auf Ensembles von Molekülen oder Aggregaten beziehen erhalten. In SMFS eine oder sehr wenige Moleküle werden an die AFM-Spitze befestigt ist und ihre Wechselwirkungen mit dem gewünschten Substrat gemessen. Dieser Ansatz kann erweitert werden, die Proteinfaltung zu untersuchen, indem das Protein von der Oberfläche zu ziehen. Zusätzlich kann es verwendet werden Wechselwirkungen zwischen Zellen und Proteinen und die Bindung von Antikörpern an ihre Liganden zu messen. 37, 38, 39, 40 Diese Veröffentlichung beschreibt detailliert , wie entweder Peptide oder Aminosäuren an die AFM - Spitze verwendet Silanol Chemie zu befestigen. Darüber hinaus erklärt das Papier wie Kraftmessungen durchführen und wie das zu analysierenErgebnisse.

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride (Si&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) AFM cantilevers with silicon tips</td><td>Bruker (Camarilo, CA, USA)</td><td></td><td>MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Methyltriethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>For Silaylation of the AFM tip&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3-(Aminopropyl) triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>For Silaylation of the AFM tip</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>Used for peptide deprotection</td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip modification</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip modification</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, UK)</td><td></td><td>Used for tip Fmoc deprotection</td></tr><tr><td>Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide&amp;nbsp; (Fmoc-PEG-NHS)</td><td>Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)</td><td></td><td>Used as the covalent flexible linker&amp;nbsp; (MW = 5,000 Da)</td></tr><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)</td><td>Alfa Aser (Heysham, England)</td><td></td><td>Used as a coupling reagent.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>DMF (dimethylformamide)</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Bio-Lab (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Ethanol (Anhydrous)</td><td>Gadot (Netanya, Israel)</td><td></td><td>Used as Solvent in Tip modification procedure</td></tr><tr><td>Trifluoro acetic acid (TFA)</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Merck (Darmstadt, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptides</td><td>GL Biochem (Shanghai, China).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylalanine and Tyrosine&amp;nbsp;</td><td>Biochem (Darmstadt, Germany)&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)</td><td>Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)</td><td></td><td>(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; substrate preparation</td></tr><tr><td>Mica substrates</td><td>TED PELLA, INC. (Redding, California, USA)</td><td></td><td>9.9 mm diameter</td></tr></tbody></table>

insights into the interactions of amino acids and peptides with inorganic materials using single-molecule force spectroscopy

Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen oder Peptiden und anorganischen Materialien führen zu mehreren interessanten Prozessen. Führt beispielsweise zur Bildung von Verbundmaterialien mit einzigartigen Eigenschaften Proteine ​​mit Mineralien kombiniert. Zusätzlich wird der unerwünschte Prozess der biologischen Verschmutzung durch die Adsorption von Biomolekülen eingeleitet, vor allem Proteine, auf Oberflächen. Diese organische Schicht wird eine Haftschicht für Bakterien und ermöglicht es ihnen, mit der Oberfläche zu interagieren. die grundlegenden Kräfte zu verstehen, die die Wechselwirkungen an der organisch-anorganischen Schnittstelle regeln ist daher wichtig, für viele Bereiche der Forschung und könnte auf das Design neuer Materialien für optische, mechanische und biomedizinische Anwendungen führen. Dieses Papier zeigt eine Einzelmolekülkraftspektroskopie-Technik, die eine AFM verwendet die Adhäsionskraft zwischen entweder Peptide oder Aminosäuren und anorganischen Oberflächen gut definiert zu messen. Diese Technik beinhaltet ein Protokoll für das Biomolekül auf dem AFM BefestigungsSpitze eine kovalente flexiblen Linker durch und Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen durch Rasterkraftmikroskop. Außerdem wird eine Analyse dieser Messungen enthalten.

Abbildung 1 zeigt die Spitze Änderungsverfahren. Im ersten Schritt wird eine Plasmabehandlung ändert sich die Oberfläche des Siliciumnitrid-Spitze. Die Spitze präsentiert OH-Gruppen. Diese Gruppen werden dann mit den Silanen reagieren. Am Ende dieser Stufe wird die Oberfläche der Spitze wird durch freie NH2 - Gruppen abgedeckt werden. Diese freien Amine reagiert dann mit Fmoc PEG-NHS, eine kovalente Linker. Die Fmoc Gruppe des PEG-Linker wird durch pipyri...

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Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Hier präsentieren wir ein Protokoll, die Kraft der Wechselwirkungen zwischen einem gut definierten anorganischen Oberfläche und entweder Peptide oder Aminosäuren durch Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) zu messen. Die Informationen aus der Messung erhalten wird, ist wichtig, um besser auf die Peptid-anorganischem Material Interphase zu verstehen.

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

8.0K Aufrufe.  The Hebrew University of Jerusalem.  Hier präsentieren wir ein Protokoll, die Kraft der Wechselwirkungen zwischen einem gut definierten anorganischen Oberfläche und entweder Peptide oder Aminosäuren durch Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) zu messen. Die Informationen aus der Messung erhalten wird, ist wichtig, um besser auf die Peptid-anorganischem Material Interphase zu verstehen. 

Serie: Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Forschung

Biotechnik

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biochemie

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Ingenieurwesen

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with neurodegenerative conditions such as Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s diseases. In particular low molecular weight aggregates, amyloid oligomers, have been shown to possess generic cytotoxic properties and are implicated as neurotoxins in many forms of dementia. We illustrate the use of methods based on atomic force microscopy (AFM) to address the challenging task of characterizing the morphological, structural and chemical properties of these aggregates, which are difficult to study using conventional structural methods or bulk biophysical methods because of their heterogeneity and transient nature. Scanning probe microscopy approaches are now capable of investigating the morphology of amyloid aggregates with sub-nanometer resolution. We show here that infrared (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), which simultaneously exploits the high resolution of AFM and the chemical recognition power of IR spectroscopy, can go further and enable the characterization of the structural properties of individual protein aggregates, and thus offer insights into the aggregation mechanisms. Since the approach that we describe can be applied also to the investigations of the interactions of protein assemblies with small molecules and antibodies, it can deliver fundamental information to develop new therapeutic compounds to diagnose or treat neurodegenerative disorders.

We describe the application of infrared nanospectroscopy and high-resolution atomic force microscopy to visualize the process of protein self-assembly into oligomeric aggregates and amyloid fibrils, which is closely associated with the onset and development of a wide range of human neurodegenerative disorders.

Charakterisierung einzelner Proteinaggregate durch Infrarot-Nanospektroskopie und Atomkraftmikroskopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

Kovalente Befestigung einzelner Moleküle für die AFM-basierte Kraftspektroskopie

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Chemie

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the lack of high throughput capabilities, the application of these techniques is limited in biophysics. Ensemble force spectroscopy (EFS) has demonstrated high throughput in the investigation of a massive set of molecular structures by converting mechanochemical studies of individual molecules into those of molecular ensembles. In this protocol, the DNA secondary structures (i-motifs) were unfolded in the shear flow between the rotor and stator of a homogenizer tip at shear rates up to 77796/s. The effects of flow rates and molecular sizes on the shear forces experienced by the i-motif were demonstrated. The EFS technique also revealed the binding affinity between DNA i-motifs and ligands. Furthermore, we have demonstrated a click chemistry reaction that can be actuated by shear force (i.e., mechano-click chemistry). These results establish the effectiveness of using shear force to control the conformation of molecular structures.

Ensemble force spectroscopy (EFS) is a robust technique for mechanical unfolding and real-time sensing of an ensemble set of biomolecular structures in biophysical and biosensing fields.

Ensemble Force Spektroskopie durch Scherkräfte

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

A Fourier Transform Infrared Spectroscopy Technique to Study Peptide Self-Assembly

To prepare a self-assembly solution, dissolve 1 milligram of the lyophilized peptide powder in a mixture of 20% acetonitrile and 10-millimolar HEPES in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Then, vortex the assembly solution and leave the sample to assemble at room temperature.
When the peptide assembly reaches maturation, dry 8 to 10 microliters of the assembly solution as a thin film on the attenuated total reflection diamond crystal, and monitor the disappearance of a large and broad water peak from 1,640 to 1,630 inverse centimeters as the dry film forms.
Acquire background and infrared spectra from 1,500 to 1,800 inverse centimeters, averaging 50 scans with a 2-inverse centimeter resolution, subtracting the background scans prior to each sample scan.
The infrared signature for beta-sheet assembly should be observed as a sharp peak between 1,625 and 1,635 inverse centimeters.