Name: investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy
Uploaded: 2015-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
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The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

HINWEIS: Siehe Abbildung 2 für einen Überblick über den Prozessablauf, das die Herstellung, die Datenerfassung und Datenanalyseschritte. 1. Setup-Reagenz HINWEIS: Alle Chemikalien müssen mit Vorsicht behandelt werden, und damit eine Laborkittel, Schutzhandschuhe und Augenschutz zu verwenden. Alle Arbeiten müssen in einem Laborabzug durchgeführt werden. Insbesondere sollten spezielle Handschuhe bei Chloroform Gebrauch abgenutzt werden. <ol><li> Verwenden Sie Chemikalien mit geringem Wassergehalt, wie trockenem Chloroform schnell und trocken lagern, aber nicht länger als eine Woche. Speichern sowohl Chemikalien als bei -20 ° C und unter Stickstoff- oder Argongas, weil APTES ((3-Aminopropyl) triethoxysilan) (siehe Tabelle 1) und PEG (Polyethylenglykol) sind hygroskopisch und PEG unterliegt Oxidation in Luft. </li><li> Um häufige Exposition der Aktie gegenüber Luftsauerstoff und Feuchtigkeit zu vermeiden, bereiten kleinere Teilmengen, im Idealfall in einem Handschuhfach-System mit einem Stickstoff Atmospre. </li></ol> 2. Geräte-Setup HINWEIS: Um mögliche Kreuzkontamination zu vermeiden, verwenden Sie frische und saubere Gefäße für jeden Schritt. <ol><li> Gesäuberte Glas und Pinzette in Waschmittellösung für 30 min in einem Ultraschallbad bei 60 ° C. </li><li> Spülen und beschallen Geräte aus Schritt 2.1 zweimal gründlich mit hochreinem Wasser. </li><li> Wärmegeräte aus Schritt 2.1 in RCA-Lösung (Reinstwasser, Wasserstoffperoxid und Ammoniak (5: 1: 1)) bis 75 ° C in einem Ofen für 45 Minuten und anschließend Spülen sie mit Reinstwasser. </li><li> Zum Schluß wird der Glaswaren und Pinzette unter einem Strom von trockenem Stickstoff oder in einem Ofen (100 ° C, 3 h). </li></ol> 3. Tipp Funktionalisierung HINWEIS: Verwenden einer Pinzette, Behälter, usw. aus Edelstahl, PTFE, Glas oder anderen Materialien, die in organischen Lösungen ggf. chemisch stabil ist. Wenn nicht anders angegeben, die Durchführung aller Schritte bei RT. Die Höhe der Inkubationslösung benötigt wird, hängt von der Anzahl der Cantilever-Chips. Stellen Sie sicher, dass die Ausleger sind in den jeweiligen Lösungen zu jeder Zeit eingetaucht. HINWEIS: Verwenden Sie eine Kapuze, um das Einatmen von organischen Dämpfen zu vermeiden. <ol><li> Bildung von OH-Gruppen auf Auslegeroberfläche (&quot;Aktivierung&quot;) (ca. 0,5 h): <ol><li> Verwenden einer Pinzette, an die frische Cantilever-Chips zu platzieren (Material: SiN, Federkonstante: 10-100 pN / nm) auf einer sauberen Glasobjektträger und legte sie in eine Plasmakammer (100 W). </li><li> Evakuieren Kammer (~ 0,1 mbar). </li><li> Flutkammer mit Sauerstoffgas und evakuieren Sie es erneut. </li><li> Aktivieren Sie das Plasmaverfahren (Leistung: 20%, Dauer: 15 min, Prozessdruck: 0,25 mbar). </li></ol></li><li> Amino-Silanisierung von Auslegern (ca. 1 h): <ol><li> Bereiten Sie die 2,5 ml APTES-Lösung (siehe Tabelle 1) in einer Glaspetrischale - tun dies im Idealfall während des Plasmaprozesses. </li><li> Immediately nach dem Plasmaverfahren, tauchen jeden Cantilever 1 Sekunde lang in Aceton und sie unmittelbar danach in der APTES Lösung. </li><li> Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Die Cantilever-Chips vorsichtig zweimal in 10 ml Aceton und einmal in 10 ml Chloroform zu spülen. </li><li> Optional letzte Schritt: Platzieren Cantilever-Chips aus dem vorhergehenden Schritt auf eine saubere Glasplatte und bäckt sie für 30 min bei 70 ° C. Beachte, dass es auch alternative Strategien zur Oberflächenaktivierung, beispielsweise UV-Behandlung 12. </li></ol></li><li> PEGylierung (ca. 2 h): HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.3.1-3.3.4 während Amino-Silanisierung. NHS und Maleimid Gruppen unterliegen einer Hydrolyse in wässrigen Umgebungen und PEG selbst wird einer Oxidation in Luft. Daher Timing (insbesondere zwischen den Stufen) ist ein kritischer Parameter. Siehe 13 für weitere Informationen. <ol><li> Bereiten Sie die Chloroform-Lösung (siehe Tabelle 1). </li><li> Zur Vermeidung von Kondensation, Pulver warmen PEG bis zu RT vor dem Öffnen des aliquoten und einem Gewicht von den entsprechenden Betrag. </li><li> Für die Kopplung von Polymeren oder Lipiden mit Aminogruppen, separat zu lösen NHS-PEG-NHS (6 kDa) und Methyl-PEG-NHS (5 kDa) in der Chloroformlösung durch Vortexen, bis sie vollständig gelöst sind. Siehe Tabelle 1 für die Konzentration. <ol><li> Alternativ. für die Kupplung von Polymeren mit Thiolgruppen getrennt lösen Mal-NHS- PEG und Methyl-PEG-NHS in der Chloroformlösung. </li></ol></li><li> Mischen der Lösungen, wie erforderlich, um eine bestimmte Anzahl Verhältnis zwischen der NHS- oder maleimide- und methyltermini PEG Moleküle (typischerweise 1: 500) einzustellen. Man beachte, dass das ideale Verhältnis ist iterativ in einer Reihe von Vorbereitungsexperiment Zyklen bestimmt werden. </li><li> Inkubieren Ausleger Chips in der PEG-Lösung für 1 h in einem Chloroform gesättigte Atmosphäre um ein Verdampfen des Chloroforms zu verhindern. </li></ol></li><li> Sondenmolekül Konjugation(&gt; 1 h): HINWEIS: In der folgenden 3.4.1-3.4.3, sind drei Beispiele für die kovalente Kopplung von unterschiedlichen Sondenmolekülen auf die AFM-Spitze beschrieben. Für jedes Molekül das Protokoll angepasst werden muss. Ferner ist zu beachten, daß in Beispiel 1 und 3 NHS-Chemie, während in Beispiel 2 die Thiol funktionalisierten Polymers PI- g -PS an das PEG über Maleimid- Chemie gekoppelt verwendet. Details siehe 14. <ol><li> Für Poly (aminosäure) Poly-D-Tyrosin (40-100 kDa) <ol><li> Lösen Sie die Polytyrosin konjugiert Sondenmolekül in 1 M NaOH. Die Konzentration ist anzupassen, um 1 mg / ml. </li><li> Tauschen das NaOH für Natriumboratpuffer (pH 8,1) unter Verwendung von Spin-Entsalzungssäulen (7 kDa MWCO) unmittelbar vor der Funktionalisierung </li><li> Zuerst mit 5 ml Chloroform und dann mit 5 ml Ethanol und schließlich mit 5 ml Boratpuffer spülen Auslegern. </li><li> Inkubieren Sie die Cantilever-Chips für 1 Stunde in der Polytyrosin Boratpufferlösung und dann mit Boratpuffer spülenund Reinstwasser. Bewahren Sie in ultrareinem Wasser bis zur Messung. </li></ol></li><li> Für Polymere mit einem linearen Backbone (Polyisopren, 119 kDa) mit gepfropften Seitenketten (Polystyrol, 88 kDa) 14 <ol><li> Lösen Sie die PI- g -PS in trockenem Chloroform. Einzustellen, die Konzentration des konjugierten Lösung auf 4 mg / ml. </li><li> Spülen Sie die Ausleger mit 5 ml Chloroform und Inkubation für mindestens 1 Stunde in der Konjugation Lösung. </li><li> Wieder spülen in 5 ml Chloroform und speichern in Chloroform in einer Chloroform-gesättigten Umgebung bis zur Messung (Chloroform Verdampfung zu verhindern). </li></ol></li><li> Für die Lipid PAPST <ol><li> Lösen Sie PAPST in trockenem Chloroform. Die Konzentration ist anzupassen, um 20 mM. </li><li> Spüle die Cantilevern mit 5 ml Ethanol und 5 ml hochreinem Wasser vor der Inkubation der Ausleger für 1 h in der Lipidlösung. </li><li> Nach Inkubation spülen Cantilever mit 5 ml Chloroform, 5 ml Ethanol und 5 ml warmem, Reinstwasser (in dieser Reihenfolge), um nicht gebundenen Sondenmoleküle zu entfernen und loszuwerden, Chloroform Rückstände zu bekommen. Verwenden funktionalisierten Spitzen sofort. Alternativ speichern sie in Chloroform, bis sie benötigt. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung der Spitze Funktionalisierung am Beispiel der NHS-Chemie. (B) Die chemische Bindung verwendet, um ein Sondenmolekül an der Spitze über eine Aminogruppe zu befestigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> 4. Oberflächenvorbereitung <ol><li> Selbstorganisierten Monoschicht (SAM) HINWEIS: Wie Oberfläche zum ersten Beispiel eine selbstorganisierte Monoschicht gewählt. Siehe Literatur 15 </sup&gt; für Details. <ol><li> Saubere Glasobjektträger mit Reinigungslösung und dann zweimal in ultrareinem Wasser in einem Ultraschallbad für 30 Minuten jeweils. Dann, als zusätzliche Reinigungsstufe, legen Sie sie in der RCA-Lösung (siehe Punkt 2.3) bei 75 ° C für 15 min. </li><li> Bestreichen Sie die Objektträger mit 10 nm Chrom-Nickel und 100 nm Gold in einer Vakuumbeschichtungsvorrichtung. Dann lagern im Kühlschrank und sauber wieder in der RCA-Lösung unmittelbar vor dem nächsten Schritt. </li><li> Die Folien von dem vorherigen Schritt Inkubieren in 2 mM 1-Dodecanthiol / Ethanollösung für 12 h. Die Thiolgruppen an der Goldoberfläche zu binden, und eine hydrophobe Monoschicht selbst montiert. Spülen Sie die Folien mit Ethanol und Reinstwasser und dann trocken mit einem Strom von Stickstoffgas. Bestätigen die Hydrophobizität der vorbereiteten Oberfläche mit statischen Kontaktwinkelmessungen in einem Goniometer mit einer CCD-Kamera 10. </li></ol></li><li> Wasserstoff terminiert Diamant HINWEIS: In der Fläche für das zweite Beispiel ein Wasserstoff terminiert Diamant gewählt. Die Vorbereitung der Oberfläche wurde wie zuvor 16 beschrieben durchgeführt. </li><li> Unterstützte Lipiddoppelschicht Hinweis: Im letzten Beispiel wurde eine Oberflächengestützten Lipiddoppelschicht (SLB) als Fläche verwendet. Um eine solche Oberfläche zu erhalten, wurde eine Lösung (0,1 mg / ml) von großen unilamellaren Vesikeln (LUVs), bestehend aus Phospholipid POPC durch das Extrusionsverfahren gebildet. Dann wurden 50 ul der Lösung auf ein LUV frisch gespaltene Glimmerfolie (A = 1 cm²) gegeben und für 30 min inkubiert. Schließlich wurde die Lösung mit 20 ml ultrareinem Wasser gespült. Siehe 17,18 für eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von SLBs. </li></ol> 5. Datenerfassung HINWEIS: Für die Versuche, verwenden Sie ein AFM, die in der Lage, in Flüssigkeiten zu messen bietet. Die Datenerfassung und Datenanalyseverfahren gelten, unabhängig von der verwendeten AFM-Modell. Weiterhin kann in einigen Experimenten ist es vorteilhaft, die Möglichkeit, die Temperatursteuerung aufweisene in der Flüssigzelle. Cantileverauslenkung wurde über die Laserstrahlablenkung Verfahren 19 erkannt. Federkonstanten wurden mit dem thermischen Rauschen Methode 20 bestimmt. <ol><li> Legen Sie die funktionalisierten Cantilever in eine AFM-Cantilever-Halter, der für die Messung in Flüssigkeiten ist. </li><li> Setzen Sie die Oberfläche (Vorbereitung siehe oben), um in die AFM abgetastet werden und decken Sie es mit Flüssigkeit. Sowohl Cantilever und Oberfläche sollte nun in der Flüssigkeit mit dem Auslegerspitzen auf die Fläche eingetaucht werden. Man beachte, dass in vielen Fällen ein Flüssigkeitstropfen genügt. In jedem Fall der Verdampfung des Fluids vermieden werden sollte, beispielsweise durch die Verwendung eines geschlossenen Fluidzelle. </li><li> Gegebenenfalls einstellen gewünschte Temperatur auf der Steuerung. </li><li> Lassen Sie das System ins Gleichgewicht kommen für mindestens eine halbe Stunde. </li><li> Aufnehmen eines thermischen Rauschspektrum des Auslegers mit dem Ausleger weit weg von der Oberfläche, um jegliche Oberflächendämpfungseffekte auszuschließen. Beachten Sie, dass in der Regel 10 oder mehr Spektren müssen akkumuliert werden, um ein ausreichendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhalten. </li><li> Nähern Sie sich dem Oberfläche. Beachten Sie, dass, um die Geometrie der Spitze und Spitze sparen Funktionalisierung der Ansatz Prozess muss sorgfältig durchgeführt werden. Dies kann erreicht werden, zum Beispiel, nähert im intermittierenden Kontaktmodus. </li><li> Bestimmen Sie die inverse optische Hebelempfindlichkeit (InvOLS) in nm / Volt gemessen. Tun Sie dies, indem Sie die Cantileverspitze gegen eine harte Oberfläche. <ol><li> Bestimmen die InvOLS durch Messen der Steigung der piezo Wegstrecke gegen die Änderung der Photodiodenspannung. Setzen Sie eine Linie zum Teil der Kraft-Weg-Kurve, wo die Blattfederspitze ist in Kontakt mit der Oberfläche. In Experimenten mit einer weichen Oberfläche wie Lipid-Doppelschichten, führen Sie diesen Schritt auf Bereiche, die nicht mit einer Lipid-Doppelschicht (&quot;Mangel spots &#39;) abgedeckt sind. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Federkonstante (pN / nm) durch den Einbau eines harmonischen Oszillators der thermischen Rauschspektrum. Verwendungautomatisierte Software-Funktion für Federkonstante Bestimmung; sonst Rücksprache Literatur 20. </li><li> Starten Sie das Experiment. <ol><li> Nehmen Sie zahlreiche Kraft-Weg-Kurven an jeder Versuchsbedingung. In der Regel verwenden Sie die folgenden Werte für die Versuchsparameter: Abtastrate von 5 kHz, Spitzengeschwindigkeit von 1 &amp; mgr; m / sec, zurückzuziehen Abstand von 1 um. HINWEIS: manchmal, abhängig von der Dynamik der untersuchten Experiment könnte es notwendig sein, eine gewisse Zeit mit der Spitze in Kontakt mit der Oberfläche zu warten (&quot;Verweilzeit&quot;). HINWEIS: Das Experiment spezifische Parameter können erheblich von den oben angegebenen Werten abweichen. </li><li> Während einer Langzeitmessungen auf Null der Laserposition auf die Fotodiode von Zeit zu Zeit durch Umpositionieren der Photodiode. </li><li> Optional: Nach jedem Kraftkurve, den Standort der AFM-Spitze auf eine andere XY-Position. </li><li> Am Ende des Experiments bestimmen die Empfindlichkeit und die Feder constant wieder auf Konsistenz und Stabilität des Systems zu überprüfen. HINWEIS: Der Vergleich der Federkonstante und der Empfindlichkeit vor und nach dem Experiment ist auch ein Mittel, um sicherzustellen, dass die Eigenschaften des Systems, und die Eigenschaften der Spitze blieb über den Verlauf des Experiments unverändert. Wenn die Differenz der Federkonstanten nicht zu groß ist (&lt;= 15%), können sie gemittelt werden, da die Eigenunsicherheit von Federkonstanten-Bestimmungs ebenfalls etwa 15%. Für größere Unterschiede, ist es ratsam, zuerst finden und die Ursache für die Veränderung offensichtlich Federkonstante zu beseitigen, bevor Sie mit weiteren Experimenten. </li></ol></li></ol> 6. Datenaufbereitung HINWEIS: In diesem Abschnitt werden allgemeine Daten Vorbereitungsschritte, die üblicherweise unabhängig von der spezifischen Art von Experiment durchgeführt, um Einheiten umzurechnen, um Newton und Nanometerbereich sowie zur Korrektur werden die Daten beschrieben werden. Die Versuchsspezifischen Daten Analysen briefly wie weiter unten beschrieben in die jeweiligen repräsentativen Beispielteil. <ol><li> Typischerweise führen alle Datenaufbereitung und Analyse die Schritte automatisch von einem haus geschrieben Algorithmus, zum Beispiel auf der Basis der Software IGOR Pro 6. </li><li> Konvertieren Sie die rohen Ablenksignal (Defl) [V] in Kraft, durch Multiplikation mit den InvOLS [nm / V] und die Federkonstante [nN / nm]. </li><li> Versetzt die Kraft in einer Weise, dass die Kraft auf den Ausleger in ausreichendem Abstand von der Oberfläche (entladen Cantilever) zu 0 nN. </li><li> Berechnen der tatsächlichen Position der Spitze (auch genannt Trenn wenn es relativ zu der Oberfläche gemessen) z *, die die Verbiegung des Cantilevers berücksichtigt: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> Offset z * in der Weise, dass z * = 0 entspricht der z-Position der Oberfläche. Anmerkung: Dabei ist F die Kraft, die an der Spitze und somit Biegung wirkts der Ausleger (im Schritt 6.2 bestimmt.), z die gemessene Z-Position des Sensors (vom Gerät direkt angegeben) und k die Federkonstante (im Schritt 5.8 bestimmt). </li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> Abbildung 2: Prozessflussdiagramm, das die Probenvorbereitung, die Datenerfassung und der Datenanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor.">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li><li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

In den letzten Jahrzehnten haben die Einzelmolekül-Experimente beispiellose Einblicke in die molekularen Mechanismen, die zur Verfügung gestellt und erwies sich als ein wertvolles Vorgehen im Bereich Life Science und darüber hinaus. Um eine gute und sinn Statistiken EMKS Experimenten idealer ein und dasselbe Molekül wird über den gesamten Verlauf des Experiments verwendet erzielen. Im Gegensatz zu den Experimenten mit Ensembles von Molekülen sind SMFS Experimente in der Lage, seltene Ereignisse und versteckt Molek...

In den letzten 30 Jahren ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) sich als ein wertvolles Abbildungstechnik zur biologischen 1,2 und synthetische 3 Materialien und Oberflächen zu untersuchen, da sie Informationen über die Molekular räumliche Auflösung in allen drei Dimensionen und in verschiedenen Lösungsmittel betrieben werden kann Umgebungen. Außerdem AFM-Einzelmolekülkraftspektroskopie (SMFS) ermöglicht, Kräfte, die von der pN-Regime uN messen und hat beispiellose Einblicke beispielsweise in der Proteinfaltung 4,5, Polymerphysik 6 angegeben - 8 und Einzelmolekül-Oberflächen-Wechselwirkung 9 - 12 .Die Gründe für einzelne Moleküle anstatt ein Ensemble von Molekülen ist die Vermeidung von durchschnittlich Effekte, die oft zu maskieren seltene Ereignisse oder versteckte Molekülzustände. Ferner kann eine Vielzahl von molekularen Parameter wie die Konturlänge, die Kuhn Länge der Haft freien Energie, etc.erhalten. Dies wird in den folgenden Beispielen beschrieben. In einem typischen AFM-SMFS-Experiment wird das Sondenmolekül zu einer sehr scharfen Spitze über ein Linkermolekül gekoppelt. Die Spitze selbst ist am Ende eines biegbaren Ausleger angeordnet. Wenn die Spitze in Berührung mit der Oberfläche gebracht wird das Sondenmolekül wird mit dieser Oberfläche in Wechselwirkung treten. Durch die Beobachtung der Auslenkung des Auslegers beim Zurückziehen der Spitze, die Kraft und damit die freie Energie, um das Molekül von der Oberfläche ablösen kann bestimmt werden. Um aussagekräftige Statistiken zu erhalten, wurde eine Vielzahl von so genannten Kraft-Weg-Kurven aufgenommen werden. Ferner sind echte Einzelmolekülexperimente (dh, mit ein und derselben Sonde Moleküls über die Dauer des gesamten Experiments) das Sondenmolekül sollte kovalent an die AFM-Spitze gekoppelt werden müssen. Hier wird ein Versuchsprotokoll für Cantilever Funktionalisierung mit einem einzelnen Molekül über eine kovalente Bindung dargestellt. Die einzigen Molekül kann entweder über eine Amino- oder eine Thio gekoppelt werdenl-Gruppe an die AFM-Spitze. Die Konjugation Verfahren kann in einer Vielzahl von Lösungsmitteln (organisch und wässrig), um für die Lösungseigenschaften der verwendeten Polymere Konto erfolgen. Im ersten Teil, ein allgemeines Protokoll, um kovalent an ein einzelnes Molekül (&quot;Sondenmolekül&quot;) über ein Linkermolekül an eine AFM-Spitze beschrieben. Zu diesem Zweck wird organischen NHS- oder Maleimid-Chemie verwendet 13. Zusammen mit dem Protokoll für die drei beispielhaften Molekülen, werden die Datenerfassung und Datenanalyseverfahren beschrieben, und Literaturhinweise sind. Die Beispiel-Moleküle sind: die (lineare) Polymer Tyrosin, das Pfropfpolymerisat PI- g -PS und die Lipid PAPST. Dies beinhaltet leichte Variationen des Protokolls, zum Beispiel kovalente Anbindung Cysteine. Zusätzlich ist ein Abschnitt, um die Herstellung von verschiedenen Oberflächen wie einer Diamantoberfläche, einer CH 3 -tafeln organisierte Monoschicht und Lipiddoppelschichten gewidmet. Diese Schnittstellen müssen proven, um gute Referenzen und Beispiele können.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry acetone (&amp;lt; 50 ppm H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry chloroform (&gt; 99.9%)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium tetraborate (&gt;&amp;nbsp;99.5%)</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofunctional &amp;alpha;-methoxy-&amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;methyl-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;,&amp;omega;-bis-NHS PEG, 6&amp;nbsp;kDa, &amp;ldquo;NHS-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;-maleimidohexanoic- &amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;Mal-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe molecule (polymer, lipid, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10&amp;nbsp;ml), glass Petri dishes (500 &amp;micro;l) and glass lids</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td>&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Laboratory oven model UF30</td><td>Memmert, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controlled sonicator</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma system &quot;Femto&quot;, 100 W</td><td>Diener, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One separate glass syringe for each organic solvent</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes: 10-100 &amp;micro;l, 50-200 &amp;micro;l and 100-1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM with temperature controlled fluid cell (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MFP-3D with BioHeater)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy

Rasterkraftspektroskopie ist ein ideales Werkzeug, um Moleküle an Oberflächen und Grenzflächen zu untersuchen. Eine experimentelle Protokoll zum Koppeln eine Vielzahl von Einzelmoleküle kovalent an einer AFM-Spitze dargestellt. Gleichzeitig die AFM-Spitze passiviert, um unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und dem Substrat, die eine Voraussetzung für die einzelnen Moleküle an die AFM-Spitze angebracht studieren verhindern. Analysen, um die Haftkraft, die Haftung der Länge, und die freie Energie dieser Moleküle auf festen Oberflächen und Bio-Schnittstellen werden in Kürze vorgestellt und externe Verweise auf weiterführende Literatur werden zur Verfügung gestellt zu bestimmen. Beispiel Moleküle sind die Poly (aminosäure) Polytyrosin das Pfropfpolymer PI- g -PS und das Phospholipid POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamin). Diese Moleküle werden von verschiedenen Oberflächen wie CH 3 -SAMs, Wasserstoff terminiert Diamant desorbiert und unterstützten Lipiddoppelschichten unter verschiedenen Lösungsbedingungen. Schließlich wird dasVorteile der Kraft-spektroskopische Einzelmolekülexperimenten diskutiert Mittel zu entscheiden, ob wirklich ein einzelnes Molekül hat im Experiment untersucht.

Im Folgenden wird beschrieben, die Ergebnisse für das obige Beispiel Moleküle, nämlich die Polymere Poly (Aminosäure), Polytyrosin, das Pfropfpolymer PI- g -PS und das Phospholipid POPE, werden vorgestellt. Zunächst für jedes Beispiel, experimentieren spezifischen Details für die Datenerfassung und Datenaufbereitung zur Verfügung. Dann werden die Ausführungsergebnisse für Versuche, bei denen diese Moleküle wurden aus verschiedenen Oberflächen desorbiert (CH 3 -SAMs, Wasserstoff terminiert...

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Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

10.3K Aufrufe.  Technische Universität München. A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Serie: Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Quantitative und qualitative Untersuchung der Partikel-Partikel Wechselwirkungen mit Kolloidales Probe Nanoskopie

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Forschung

Chemie

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Biotechnik

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biochemie

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

Kovalente Befestigung einzelner Moleküle für die AFM-basierte Kraftspektroskopie

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Ingenieurwesen

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...