Dieses Protokoll bietet eine Hochdurchsatztechnik, um die intermolekulare Bindung zwischen DNA und Liganden zu untersuchen. Diese Technik hat einen hohen Durchsatz bei der Untersuchung massiver biomolekularer Strukturen gezeigt. Dazu wandelt es die mechanisch-chemischen Eigenschaften einzelner Moleküle in die von Molekülensembles um.
Ich denke, es ist ein sehr fortschrittliches Experiment, aber es gibt nur wenige kritische Schritte. Zum Beispiel die Ausrichtung von Mikroskop, Homogenisator und Reaktionsröhrchen. Diese drei Dinge sollten perfekt aufeinander abgestimmt sein, um die Änderung der Fluoreszenz genau zu verfolgen.
Beginnen Sie mit der Montage des Homogenisators und des Mikroskops auf einem Montagetisch. Schalten Sie nach dem Tragen der Schutzbrille das Fluoreszenzmikroskop ein und stellen Sie dann den Homogenisator ein, um sicherzustellen, dass der Anregungslichtstrahl durch die Mitte der Dispergierspitze des Homogenisators geht. Bereiten Sie dann eine Reaktionskammer mit flachem Boden vor, die fünf Zentimeter hoch und 1,5 mal 1,5 Quadratzentimeter im Querschnitt ist, um sicherzustellen, dass das ausgewählte Kammermaterial nicht fluoresziert, um den Hintergrund zu reduzieren.
Danach klemmen Sie die Reaktionskammer auf den Probentisch des Fluoreszenzmikroskops und stellen dann die Kammer so ein, dass sie die Dispergierspitze des Homogenisators hält, wobei sichergestellt wird, dass sich die Spitze etwas über der unteren Oberfläche der Reaktionskammer befindet. Als nächstes passen Sie die vertikale Position des Homogenisators und der Kammer zusammen an, um sicherzustellen, dass der Fokus des Mikroskops auf der Oberfläche der Dispergierspitze liegt. Passen Sie dann die horizontale Position der Dispergierspitze an, um sicherzustellen, dass der Erfassungsbereich zwischen Rotor und Stater eingestellt ist.
Schalten Sie die fluoreszierenden Kanäle entsprechend dem im Experiment verwendeten Fluoreszenzfarbstoff ein. Vor dem Hochgeschwindigkeitsscherexperiment wurde deionisiertes Wasser verwendet, um die Scherung mit einer niedrigen Schergeschwindigkeit zu testen. Bereiten Sie zunächst eine menschliche Telomer-i-Motiv-DNA vor, die an ihren beiden Enden jeweils mit einem Farbstoff und einem Quencher markiert ist, in entionisiertem Wasser, wie im Manuskript beschrieben.
Als nächstes verdünnen Sie die DNA auf fünf Mikromolare in 30 Millimolar MES-Puffer bei pH 5,5 oder pH 7,4. Der DNA-Lösung wird der Ligand L2H24OTD" in einem Konzentrationsbereich von null bis 60 Mikromolar zugegeben und die Lösung 10 Minuten lang vorsichtig gemischt, um die i-Motivstrukturen ohne Licht zu falten. Überprüfen und minimieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität der Reaktionskammer, die mit entionisiertem Wasser gefüllt ist, mit dem Fluoreszenzmikroskop ohne Scherung.
Stellen Sie dann die Parameter der CCD-Kamera mit der Software mit einer Belichtungszeit von 0,5 Sekunden, einer CCD-Empfindlichkeit von 1.600 und einer Aufnahmezeit von 20 Minuten ein. Geben Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere und saubere Reaktionskammer und bedecken Sie die Reaktionskammer mit einem Blackbox. Starten Sie dann den Homogenisator, um die Scherung mit einer ausgewählten Scherrate von 9, 724 pro Sekunde bis 97, 245 pro Sekunde für 20 Minuten durchzuführen, wobei die CCD-Kamera eingeschaltet ist, um die Daten aufzuzeichnen.
Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit entionisiertem Wasser. Bereiten Sie i-Motiv-DNA und entionisiertes Wasser vor. Dann inkubieren Sie 10 mikromolare i-Motiv-DNA und 300 Mikroliter 30 Millimolar-Tris-Puffer, ergänzt mit 150 Mikromol-Kupferchlorid und 300 Mikromolar-Ascorbinsäure für 10 Minuten, um die i-Motivstrukturen zu falten.
Als nächstes ultrafiltrieren Sie die Lösung mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung bei einer Zentrifugalkraft von 14, 300 mal G.Auffüllen Sie die Lösung auf etwa 500 Mikroliter mit 30 Millimolar Tris-Puffern, ergänzt mit 300 Mikromolar Ascorbinsäure nach jeder Filtration. Nach dem Sammeln der Restlösung wird ein Endvolumen von 300 Mikrolitern durch Zugabe von 30 Millimolar Tris, ergänzt mit 300 Mikromolar Ascorbinsäure, zusammen mit 20 Mikromolar CalFluor 488 Azid, 20 Mikromolar HPG und 10 Mikromolar TBTA, hergestellt. Sobald die Reagenzien hinzugefügt wurden, bewegen Sie die Lösung in den dunklen Raum.
Überprüfen und minimieren Sie dann die Hintergrundfluoreszenzintensität der mit entionisiertem Wasser gefüllten Reaktionskammer mit dem Mikroskop vor den Scherexperimenten. Als nächstes fügen Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere Reaktionskammer hinzu und starten dann die Homogenisatorscherung mit einer Scherrate von 63, 209 pro Sekunde für 20 Minuten bei eingeschalteter CCD-Kamera. Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit entionisiertem Wasser.
Es wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität der i-Motiv-DNA mit der schieren Rate von 9.724 pro Sekunde bis 97.245 pro Sekunde in einem pH-Puffer von 5,5 MES zunahm. Die Fluoreszenzintensität wurde jedoch nicht erhöht, wenn die gleiche i-Motiv-DNA mit einer Rate von 63, 209 pro Sekunde geschert wurde, da sie sich bei pH 7,4 im MES-Puffer nicht faltet. Die Ligandenbindung an die DNA-i-Motivmoleküle, die dem reinen Fluss ausgesetzt waren, wurde ausgewertet, was zeigte, dass die Erhöhung der Fluoreszenzintensität mit zunehmender Ligandenkonzentration weniger offensichtlich wurde.
Die Dissoziationskonstante wurde für die Wechselwirkung zwischen dem Liganden und dem i-Motiv bestimmt und betrug 34 Mikromol. Das Kupfer-Chelat-i-Motiv wurde mit der Scherrate von 63, 209 pro Sekunde entfaltet, und das freigesetzte Kupfer löste die fluorgene Klickreaktion aus, was im Laufe der Zeit zu einer erhöhten Fluoreszenzintensität führte. Stellen Sie zunächst sicher, dass der Erfassungsbereich zwischen Rotor und Stater eingestellt ist.
Zweitens, überprüfen und minimieren Sie den Fluoreszenzhintergrund. Stellen Sie schließlich sicher, dass Sie die Reaktion filtern, bevor Sie eine Klickreaktion durchführen. Diese Methode öffnet ein Tor zur Erforschung der mechanischen Festigkeit, zum Falten und Entfalten aller Arten von Polymeren.
Es könnten andere DNA-Strukturen, Proteine oder andere Polymere und ihre Wechselwirkung mit anderen Arten von Molekülen sein. Wie gesagt, mehrere andere Makromoleküle könnten mit diesem Ansatz untersucht werden.
