Name: the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
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Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

HINWEIS: Alle verwendeten Tiere in diesem Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Mississippi Medical Center genehmigt. 1. Behandlung von Tieren und Gewebe <ol><li> Verwaltung und Opfer <ol><li> Anesthetize die Tiere unter Verwendung von 3% Isofluran für 5 Minuten und überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen der Zehen Prise Reflex zu beobachten. Bewerben Veterinär Salbe in die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Wiegen Sie das Tier und Pipetten eine 50 mg / kg Dosis von entweder Rhodamin-markiertes ELP, SynB1-ELP oder Tat-ELP in ein 1,5-ml-Röhrchen. Sparen Sie 100 ul der verabreichten markierten Verbindungen zur Formulierung von Standardkurven in späteren Schritten. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Standards von der gleichen Charge des markierten Proteins an die Tiere verabreicht, um gemacht werden, um Unterschiede zu vermeiden aufgrund der Variabilität in Fluoreszenzmarkierungseffizienz. Um Hintergrund fluores richtig entfernenzenz aus späteren Fluoreszenzmessungen, ein unbehandeltes Tier müssen die gleichen Methoden / Reagenzien wie den behandelten Tieren unter Verwendung geopfert werden. </li><li> Administrieren eine IV - Injektion , wie oben beschrieben 1 entweder die Schwanzvene oder die Oberschenkelvene unter Verwendung (der über eine 1 cm lange Inzision in der Leiste zugegriffen wird). Für Analgesie, wenn eine Leisten Einschnitt, verabreichen carprofen subkutan in einer Dosis von 5 mg / kg, und gelten sensorcaine an der Einschnittstelle vor dem Verschließen mit einer Wundklammer. Um über die intranasale (IN) Route verwalten, legen Sie das Tier in Rückenlage. </li><li> Mit einem 2-ul-Pipette, erstellen eine 1-ul Tropfen markierten Verbindung. Kurz den Kopf des Tieres gleiten aus der Narkose Kragen Zugang zu den Nasenlöchern zu ermöglichen. </li><li> Setzen Sie die Spitze der Pipette auf die Öffnung eines einzelnen nare und den Kolben langsam niederdrücken, so dass die Tröpfchen die Nare in die Nasenhöhle zu überfahren. Wiederholen Sie alle 1 min, nares jeden Tropfen, bis die volle Dosis ist abwechselnd AnzeigeHabe. Hinweis: Die maximale Lautstärke über administrierter nicht 10 überschreiten sollte - 15 &amp; mgr; l für Mäuse. </li><li> Lassen Sie die Tiere in Rückenlage unter Narkose für 10 Minuten nach der letzten Verabreichung vor ihnen jeweils in einem individuellen Käfig bewegen. Hinweis: Tiere nicht unbeaufsichtigt lassen, bis sie genügend Bewusstsein wiedererlangt haben Brustlage zu halten. </li><li> 1 h nach der Verabreichung Wieder anästhesieren die Tiere wie zuvor und opfern diese über transcardial Perfusion mit PBS (210,0 mg / L KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / L NaCl, 726 mg / L Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) bei 10 mL / min für eine Gesamtmenge von 20 ml. Anmerkung: Die Perfusion der Tiere bei der Opferung aller Blut aus dem Gewebe zu entfernen, erforderlich, um die extravaskuläre Konzentrationen der markierten Verbindungen zu bestimmen. Perfusions-Reagenzien können zu Veränderungen der Hintergrundfluoreszenz führen und sollte konsistent gehalten werden. Das Verfahren des Opfers sollte konsistent seininnerhalb von Gruppen. Verschiedene Methoden der Opfer können in unterschiedlichen Ebenen von Blut innerhalb des Gefäßsystems zur Folge haben, die Änderung der Hintergrundfluoreszenz des Gewebes. </li></ol></li><li> Sammlung von Geweben <ol><li> Bereiten PBS wie zum Spülen der entnommenen Gewebe beschrieben. Anmerkung: Wenn ein anderer Puffer als der Perfusionsflüssigkeit eingesetzt wurde gründlich Gewebe in dem gleichen Puffer. </li><li> Entfernen Sie das Herz, Lunge, Magen, Leber, Milz und Nieren durch einfache Präparation. Kurz in PBS spülen, bevor Labor mit wischt überschüssige Feuchtigkeit zu trocken tupfen oder Feuchtigkeit ab und das Gewebe auf die Abbildungsmatte platzieren. </li><li> Enthaupten die Maus und entfernen Sie die Oberseite des Schädels mit Knochenfräser oder rongeurs. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen das Gehirn, halten die Riechkolben intakt. Spülen, trocken, und legen Sie es auf der Abbildungsmatte zur Verfügung gestellt. </li><li> So entfernen Sie das Rückenmark über schnelle Ausstoß 7, füllen einen 10-ml - Spritze mit PBS und fügen Sie eine abgestumpfte 18-Gauge - Nadel. Hinweis: 18-Gauge-fitsder erwachsene Spinalkanal vieler Mauslinien. Der erforderliche Durchmesser wird mit Tiergröße variieren. </li><li> Legen Sie das Tier in der Bauchlage zu gewährleisten, dass die Öffnung des Wirbelkanals an der Enthauptung Seite ist sauber geschnitten und frei von Blut. </li><li> Entfernen Sie die Haut aus der ganzen Wirbelsäule. Mit scharfen Knochenschneider oder einer Schere, schneiden durch die Wirbelsäule im Lendenbereich von bis zu den Hüften direkt rostral. </li><li> waschen Sie es kurz mit PBS den Spinalkanal zu visualisieren. Führen Sie vorsichtig die Nadel in den Spinalkanal. Hinweis: Die Nadel eng fühlen sollte und kann einige langsame Roll benötigen hin und her während des Einsetzens. Sollte die Nadel locker fühlen, ein mehr rostral Schnitt kann oder einen größeren Durchmesser Nadel hergestellt werden erforderlich sein könnten. </li><li> Mit dem Daumen und Zeigefinger, Druck auf die Wirbelsäule um die Nadel eingeführt. Drücken Sie den Kolben mit moderaten und konstanten Druck. Das Rückenmark intakt aus der rostrale Öffnung im Rücken auswerfenSpalte. Hinweis: Die vollständige Entfernung, Spülen und Trocknen aller wichtigen Organe vernünftigerweise in 5 abgeschlossen sein - 7 min. Diese kurze Zeit verhindert, daß die Notwendigkeit einer Langzeitlagerung in PBS, die in übermäßiger Belichtung und dem Auswaschen von markierten Proteine ​​aus dem Gewebe führen kann. </li></ol></li></ol> 2. Ganz Organ Ex vivo Fluoreszenz - Imaging <ol><li> Imaging-Parameter <ol><li> Starten Sie die Bildaufnahme-Software. In der rechten unteren Ecke des Erwerbs Control Panel, klicken Sie auf &quot;initialisieren&quot;. </li><li> Unter &quot;Aufnahmemodus&quot;, wählen Sie die &quot;fluoreszierend&quot; markieren. Unter &quot;Belichtungszeit&quot; die Option &quot;AUTO&quot;. </li><li> Unter &quot;Binning&quot;, wählen Sie &quot;klein&quot; und die F / Stop auf 2 gesetzt. </li><li> Wählen Sie die 535-nm-Anregung und 580-nm-Emissionsfiltern. Anmerkung: Diese variiert abhängig von der verwendeten Markierung. </li><li> Wählen Sie &quot;Field of View B&quot; und stellen Sie die target Höhe 0,3 cm. Anmerkung: Diese variiert auf die Gewebe je abgebildet werden. </li><li> Sobald die Temperatur-Anzeige grün leuchtet (die Maschine Bedeutung ist voll initialisierten), legen Sie die Gewebe auf dem schwarzen Hintergrund Matte versehen, um sicherzustellen, dass die Gewebe vollständig voneinander getrennt sind. Legen Sie die Matte in der Imager sicherzustellen, dass sämtliche Gewebe innerhalb der gewählten Region Gitter sind. Größere und inhomogenen Geweben, wie die ganze Leber, sollte angelegt werden, um die Überlappung der Flügel zu reduzieren. Anmerkung: Die Gewebe können zusammen in einer einzigen Gruppe angeordnet werden, so dass ein Bild eines einzelnen Tieres oder allen Geweben einer ähnlichen Art aufzunehmen. Dies macht Analyse und Organisation später einfacher. Wenn große Unterschiede in der Fluoreszenzintensität unter verschiedenen Geweben vorhanden sind, ist es am besten Bild sie einzeln oder als Gruppen aus dem gleichen Gewebetyp, wie eine einzelne Belichtungszeit nicht für alle Gewebestärken ideal sein kann. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Erfassen&quot;. </li><li> Nach der Bebilderung, entfernen Sie die Gewebe sofort und zu speichern oder sie für die quantitative Histologie einfrieren, wie in Schritt 4 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Standards und Bildverarbeitung <ol><li> Standards <ol><li> In PBS Erstellen zweifache serielle Verdünnungen von jedem Protein in der Behandlung der Tiere verwendet, bei der ursprünglichen Konzentration beginnend, mit insgesamt 15-Verdünnungen. Hinweis: Der Konzentrationsbereich darauf abzielen sollte, die zu erwartenden Gewebekonzentrationen enthalten und können zusätzliche Verdünnungen der ursprünglichen Probe erfordern, abhängig von der Ausgangskonzentration. </li><li> Je 100 ul jeder Standard in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte. Fügen Sie ein gut aus reinem PBS ein gewisses Maß an Hintergrundfluoreszenz zu erhalten. </li><li> Bild die Standards mit den gleichen Parametern für die Gewebe-Bildgebung verwendet. </li><li> In der Bildaufnahmesoftware &quot;Tool-Palette&quot; unter &quot;ROI Tools&quot;, wählen Sie die &quot;Region of Interest (ROI&quot;) Kreis und den ROI ziehen um ein gut. Kopieren Sie, dass ROI zu allen anderen gefüllten Brunnen und klicken Sie auf &quot;die ROIs messen.&quot; </li><li> Subtrahiert den Wert der durchschnittlichen Strahlungseffizienz des reinen PBS aus den Werten der anderen Normen; Dadurch wird die Hintergrundfluoreszenz. Zeichnen Sie die Werte gegenüber der bekannten Konzentration in einem Streudiagramm. Anmerkung: Die sich ergebende Gleichung der linearen Trendlinie dann verwendet werden kann, um die relative Fluoreszenzwert zu berechnen. </li></ol></li><li> Bildverarbeitung <ol><li> In der Bildaufnahme-Software, wählen Sie den Freiform-ROI-Tool und ziehen ROIs um jede der einzelnen Gewebe. Klicken Sie auf &quot;Messen&quot;. </li><li> Mit den daraus resultierenden durchschnittlichen Strahlungswirkungsgradmessungen, subtrahieren, die von der unbehandelten Tier Messwerte für jeden Gewebetyp und zeichnen Sie diese Werte auf dem zuvor erstellten Standardkurve. Hinweis: Die resultierenden relativen Fluoreszenzwerte bieten eine schnelle und genaue Momentaufnahme derBioverteilung des markierten Verbindung. </li></ol></li></ol> 4. Quantitative Tissue Histologie <ol><li> Vorbereitung und Einfrieren von Gewebe für Slicing <ol><li> Erstellen oder erwerben Behälter mit ausreichender Größe, die die ausgewählten Gewebe und Kryostat zum Einfrieren verwendet werden. Verpackung Aluminiumfolie um einen entsprechend dimensionierten und geformten Gegenstand funktioniert gut. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung aus Isopropanol und Trockeneis um die Hälfte eines 500-ml-Becher mit Trockeneis füllen und das Hinzufügen von ~ 350 ml Isopropanol, damit ausreichend Flüssigkeit über dem Trockeneis ist, um teilweise den Gefrierbehälter versenken. Hinweis: Der flüssige Stickstoff im Bruch der optimale Schnitttemperatur Verbindung führt oft (OCT) und eingebetteten Geweben und sollte vermieden werden. </li><li> Füllen Sie den Gefrierbehälter teilweise mit Oktober, um sicherzustellen, dass es keine Blasen vorhanden sind. Wenn es Blasen sind, arbeiten die Blasen aus der Lösung mit einer Pinzette oder einem ähnlichen implementieren. </li><li> Entfernen Sie das Gewebevon PBS und gründlich trocknen es, entweder indem sie sie mit einem Labor und tätschelte sanft abzuwischen oder durch die Ränder der empfindlichen Gewebe in ein Labor zu berühren wischen und damit die Flüssigkeit weg Docht. </li><li> Legen Sie das Gewebe sanft in den Oktober im Inneren des Gefrierbehälters, um sicherzustellen, keine Blasen unter dem Gewebe einzuführen. Sobald das Gewebe an Ort und Stelle ist, fügen Oktober, bis das Gewebe vollständig bedeckt ist. </li><li> Unterzutauchen den Gefrierbehälter so weit wie möglich das Isopropanol ohne daß im Inneren des Behälters in Kontakt mit dem freiliegenden OAT kommen. Lassen Sie 30 bis 90 s (oder möglicherweise mehr für größere Gewebe) für das OCT und Gewebe vollständig einzufrieren, bevor sie für so lange wie nötig bei -80 ° C lagern. </li></ol></li><li> Herstellung von Standards für Slicing. <ol><li> Vorbereitung und entsprechend 1 ml-Einwegspritzen Label vom Ende der Trommel entfernt wird, so dass die gesamte Länge der Spritze ist ein Durchmesser. Dies ermöglicht es dem gefrorenen Zylinder später herausgeschoben werden. </li><li> Unsein 15-Schritt zweifache serielle Verdünnung der verabreichten Verbindungen ing Oktober, zu erstellen, wie sie zuvor mit PBS durchgeführt wurde, aber mit einem letzten resultierende Volumen von 1 ml. Fügen Sie eine Probe von reinem OCT zur Entfernung von Hintergrundfluoreszenz Werte. </li><li> Die Viskosität der OCT macht eine ausreichende Durchmischung schwierig. Drehen Sie die Rohre und ermöglichen es dem Oktober vollständig zu begleichen, bevor sie wieder zu invertieren. Wiederholen Sie diese 10 bis 20 mal um eine einheitliche Mischung zu gewährleisten. Halten Sie die Standardlösungen bei 4 ° C und vor Licht während des Mischens. </li><li> Nach dem Mischen herzustellen wieder ein Gemisch aus Isopropanol und Trockeneis, wie zuvor. Hinweis: Flüssiger Stickstoff kann auch anstelle des Isopropanol / Trockeneis-Mischung verwendet werden, die Spritzen schnell entfernt werden, nachdem sie festgefroren sind. </li><li> Zeichnen Sie die Oktober-Standard in die Spritze, wobei darauf geachtet, so wenig Blasen wie möglich einzuführen. Nach dem Ziehen des OCT-Lösung auf, tauchen sofort die Spritze direkt in die Isopropanol und lassen Sie die Lösung vollständig einzufrierenin der Spritze für 10 - 20 s. Speichern der Spritzen bei -80 ° C, so lange wie notwendig. </li></ol></li><li> Schneiden von Gewebe und Standards <ol><li> Platzieren beiden Geweben und Standards in -20 ° C und lassen genügend Zeit für alle Proben zu Temperatur kommen. Hinweis: Die ideale Schnitt Temperatur fällt in der Regel um die 10 ° C-Bereich für die meisten Gewebe, aber es hängt letztlich von Gewebegröße und Fettgehalt und muss empirisch verfeinert werden. </li><li> Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten Gewebe in 20 &amp; mgr; m dicke Scheiben schneiden und montieren sie auf Objektträger, wie zuvor 8 beschrieben. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C und halten sie weg von Licht so viel wie möglich während des Schneidens und bis Scannen. Hinweis: Es ist wichtig, dass hier die Abschnitte in geeigneter Weise über die gesamte Dicke des Gewebes verteilt sind, gemessen werden. </li><li> Um die Standards auf dem Kryostaten Bohrfutter montieren, nehmen Sie die Spritze aus dem Gefrierschrank und erwärmen die Außenseite 3 - 5 s durch holding es in der Hand. Drücken Sie den Kolben, bis ein kurzer Abschnitt (~ 1 cm) des OCT-Zylinder ist außerhalb der Spritze. <ol><li> Mit Hilfe einer Rasierklinge geschnitten durch den Zylinder und legen den resultierenden Zylinderabschnitt senkrecht auf das Futter, OAT es an Ort und Stelle zu halten. Diese Konfiguration sollte in gut definierte Kreise führen geschnitten. </li></ol></li><li> Schneiden Sie die Zylinder bei 20 &amp; mgr; m, Platzieren einer Scheibe von jeder Verdünnung auf eine einzelne Folie, so dass eine Folie die gesamte Standardkurve darstellt. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C bis zum Scannen bereit. </li></ol></li><li> Scannen und Quantifizierung <ol><li> Starten Sie den Scan-Array-Software und klicken Sie auf &quot;543 Laser&quot;, um den Laser-Startprozedur beginnen. Warten Sie 15 min für die Laser bereit zu bekommen. </li><li> Sobald der Laser bereit ist, die Folien von -20 ° C zu entfernen und sie in einem großen, lichtgeschützten Behälter auf Temperatur zu kommen, bewegen und für 3 Minuten trocknen lassen. Dadurch wird die Bildung von Feuchtigkeit im sli verhindernde-Scanner. </li><li> Legen Sie die Folie in die Schieberaufnahme an der Dia-Scanner. Klicken Sie auf &quot;Scannen&quot; und wählen Sie &quot;easy-Scan ausgeführt werden.&quot; </li><li> Stellen Sie die Scan-Auflösung bis 50 um. </li><li> Wählen Sie das erste &quot;Use&quot; Checkbox unter &quot;Fluorophor&quot; und wählen Sie &quot;TRITC.&quot; Stellen Sie die PMT-Verstärkung auf 80%. Hinweis: Diese Einstellungen variiert in Abhängigkeit von dem Fluorophor und der Konzentration der markierten Moleküle. </li><li> Auf der linken Seite, sicherzustellen, dass der Abtastbereich die gesamte Folie umfasst. Klicken Sie auf &quot;Start&quot;. </li><li> Nach dem Scannen, wählen Sie &quot;Datei&quot; und &quot;Speichern unter&quot; und dann als .tif das Bild zu speichern. Hinweis: Folien von Geweben und Standards sollten auf den gleichen Einstellungen gescannt werden. </li><li> Legen Sie die resultierenden Bilder in ImageJ und wählen Sie ROIs um die Gewebe und Standards. Unter dem Reiter &quot;analysieren&quot;, wählen &quot;Messungen&quot; und wählen Sie &quot;Grauwert bedeuten.&quot; Click220; messen &quot;. Anmerkung: Wie bei der vorherigen Technik, die Hintergrundfluoreszenz von allen Messwerten subtrahiert werden muß. </li><li> Zeichnen Sie die mittleren Grauwertmessungen von den Standards gegen die bekannten Konzentration eine Standardkurve zu erstellen. Hinweis: Die resultierenden Messungen aus dem Gewebe sollte auf dieser Standardkurve in jedem Gewebe und aufgetragen gemittelt werden, um die Konzentration innerhalb des Gewebes zu bestimmen. </li></ol></li></ol>

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GLB is owner of Leflore Technologies, LLC, a private company working to develop ELP-based drug delivery technology. Leflore Technologies provided no support for the publication of this paper or for the generation of data within it.

Während ex vivo Vollorgan Bildgebung im Allgemeinen einfach ist, kann die Einhaltung einiger grundlegender Konzepte und Techniken , um die Genauigkeit der Bio-Verteilungsmessungen verbessern. Kurze Wellenlängen des Lichts Erfahrung ein hohes Maß an Streuung und Absorption in den meisten Geweben, die wesentliche Auswirkungen auf die Nützlichkeit der kurzwelligen Fluorophore. Diese Fluorophore haben eine begrenzte Anwendung in Tiefgewebeuntersuchungen, aber sie haben effektiv in Experimenten verwendet wurden ...

Fluoreszenzmarkierung ist ein leicht eingesetzt und effektives Verfahren zur biologischen Verteilung von Verbindungen zu bestimmen, die eine Reihe von Geräten verwendet, die auf vielen Laboratorien üblich ist. Fluorophore sind überall erhältlich, relativ kostengünstig und kommen eine Vielzahl von Wellenlängen in, so dass mehrere markierte Moleküle ohne Störung gleichzeitig verwendet werden können. Die meisten Fluorophore haben eine Reihe von Chemien für die Konjugation an verschiedene reaktive Gruppen an Zielverbindungen und das Verfahren der Konjugation ist für die meisten Arten von reaktiven Stellen im allgemeinen einfach. Darüber hinaus sind die Geräte für die Messungen von fluoreszenzmarkierten Verbindungen erforderlich, die in vielen Labors. Fluoreszierende Mikroskope, Imager und Diascanner können alle unter verschiedenen Umständen verwendet werden, die sehr zugänglich Verwendung von fluoreszierenden Markierung zu machen. Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden , häufig die Biodistribution und die Kinetik der Verbindungen zu bestimmen , sowohl in vivo als auch ex vivo mit Live - Imaging - Geräte, wie zum Beispiel die IVIS Spectrum Imager und durch quantitative Gewebe Histologie 2,3. Die Verwendung von ex vivo Voll organ Abbildungs Live-Bilderzeugungsvorrichtungen verwendet , hat im Laufe der Zeit erhöhte sich aufgrund ihrer einfachen Verwendung und Fähigkeit, schnell einen genauen Vergleich der relativen Konzentrationen von markierten Verbindungen zu erstellen , ohne die Weiterverarbeitung von tissues4 erfordern. Während jedoch ex vivo Vollorgan Bildgebung für die einfache Analyse und den Vergleich ermöglichen kann, ist es nicht eine quantitative Messung der absoluten Konzentrationen der Verbindung innerhalb eines Gewebes zu erzeugen. Dies ist auf Lichtstreuungseffekte innerhalb intakter Organe. Da die Lichtstreuung (und in einem geringeren Ausmaß, Extinktion) variiert je nach Gewebegröße und Dichte können ganze Organbildgebungsgewebespiegel in großen oder dichten Organen unterschätzen. geeignete Standards für absolute Konzentrationsmessungen Formulieren ist auch schwierig, weil man die Dicke nachahmen mussund die Dichte jedes einzelnen Organs. Auf der anderen Seite, ist ganze Organ Bildgebung ein schnelles Verfahren, die relativen Gewebespiegel eines Mittels zu erhalten, und es ist ideal für die relative biologische Verteilung mehrerer verwandter Moleküle (wie in Drug-Targeting-Studien) verglichen wird. Eine alternative Strategie ist es, quantitative Fluoreszenz Histologie zu verwenden, eine Technik , die aus dem Verfahren der quantitative Autoradiographie abgeleitet, absolute Gewebespiegel eines Testmittels 5,6 zu erhalten. Anstatt Platzierung ein ganzes Tier oder ein Organ in ein Vorstellen Gerät erfordert quantitative Gewebe Histologie, dass jedes Gewebe geschnitten werden, auf Schlitten montiert, gescannt und einzeln analysiert. Standards des Testmittels werden mit der gleichen Dicke wie die Organproben vorbereitet und in Scheiben geschnitten. Durch das Schneiden wird alle Organe und Standards auf die gleiche Dicke, die Variabilität aufgrund von Lichtstreuung oder Absorption eliminiert und Gewebefluoreszenzintensität kann mit der Standardkurve fit absolute concent zu bestimmen,Ration. Während dieses Verfahren, wenn es richtig gemacht, quantitativ ist, es ist auch arbeitsintensiv und leicht falsch behandelt. die komplexer Natur der quantitativen Histologie und der deutlich höhere Arbeitskosten im Vergleich zu den gesamten Organ Bildgebung Da wird es lohnt sich zu untersuchen, wo jeder Prozess am praktischsten ist zu verwenden, wenn die Bio-Verteilung der fluoreszenzmarkierte Verbindungen zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine ausführliche Beschreibung, wie diese Verfahren zusammen verwendet werden, um effizient die biologische Verteilung von Rhodamin-markiertem Elastin-ähnliches Polypeptid (ELP), mit oder ohne den Zusatz der SynB1 oder Tat zellpenetrierenden Peptide zu vergleichen, über die intranasal (IN) und intravenösen (IV) Verabreichungswege.

<table><tbody><tr><td>&lt;u&gt;Reagents&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maleimide derivitized fluorophors (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td><td>Thermo Fisher</td><td>T6027, A20342</td><td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>1002243569</td><td>PBS Buffer for rinsing</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4585</td><td>Used for freezing and mounting</td></tr><tr><td>&lt;u&gt;Equipment&lt;/u&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For &lt;em&gt;ex vivo&lt;/em&gt; whole organ imaging</td></tr><tr><td>Cryomicrotome</td><td>Thermo</td><td></td><td>For cryosectioning</td></tr><tr><td>Fluorescence slide scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>For slide scanning</td></tr></tbody></table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

Fluoreszenzmarkierung ist ein gut etabliertes Verfahren , das Schicksal der markierten Moleküle unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen für die Prüfung sowohl in vitro als auch in vivo. Fluoreszenzsonden sind besonders nützlich bei der biologischen Verteilung von großen Molekülen verabreicht Bestimmung, wobei die Zugabe eines niedermolekularen fluoreszierenden Markierung unwahrscheinlich ist, die Kinetik oder bio-Verteilung der Verbindung beeinflussen. Eine Vielzahl von Methoden existieren Biodistribution zu untersuchen, die deutlich in der Aufwand variieren erforderlich ist und ob die sich ergebenden Messungen sind vollständig quantitative, sondern mehrere Methoden in Verbindung verwenden, können bio-Verteilungen ein schnelles und wirksames System für die Analyse bereitzustellen. Ex - vivo - Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein Verfahren , das schnell verwendet werden kann , um die relativen Konzentrationen von fluoreszierenden Molekülen innerhalb von Geweben vergleichen und zwischen mehreren Arten von Geweben oder Behandlungsgruppen. Mit Hilfe eines Imaging-platForm für lebende Tiere oder ganze Organ Bildgebung, Fluoreszenz in intakten Geweben kann ohne weitere Verarbeitung bestimmt werden, Zeit und Arbeitsersparnis und bietet gleichzeitig ein genaues Bild von der gesamten Bio-Verteilung ausgelegt. Dieses Verfahren ist ideal in Experimenten versucht, die Gewebespezifität einer Verbindung zu bestimmen, oder für den Vergleich von mehreren verschiedenen Verbindungen. Quantitative Gewebe Histologie auf der anderen Seite erfordert umfangreiche Weiterverarbeitung der Gewebe, um ein quantitatives Maß für die markierten Verbindungen zu schaffen. Zur genauen biologischen Verteilung beurteilen, alle Gewebe von Interesse muss in Scheiben geschnitten, gescannt werden, und in Bezug auf Standardkurven analysiert, um Vergleiche zwischen den Geweben oder Gruppen zu machen. Quantitative Gewebe Histologie ist der Goldstandard für absolute Verbindungskonzentrationen im Gewebe zu bestimmen. Hier beschreiben wir, wie beide Methoden verwendet werden können, zusammen effektiv die Fähigkeit verschiedener Verabreichungsmethoden zur Beurteilung einesnd Verbindung Modifikationen zielen und fluoreszierend markierte Moleküle an das zentrale Nervensystem 1 zu liefern.

Die Daten unten beschreiben die Lieferung von drei Verbindungen: ein Drug-Delivery - Vektor als ELP und zwei Versionen von ELP mit zellpenetrierendes Peptide (SynB1-ELP und Tat-ELP) 9 modifiziert bekannt. Alle drei Verbindungen wurden mit Tetramethylrhodamin-5-Maleinimid markiert und über zwei Verabreichungswege (IN und IV) geliefert. Das Ziel dieser Experimente war es, die Verbindung und Art der Anwendung zu bestimmen , in der besten Eindringen in das zentrale Nervensystem (ZNS) 3 führen würde....

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The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex - vivo - Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein schnelles Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von fluoreszierend markierten Verbindungen in und zwischen den Geweben oder den Behandlungsgruppen. Umgekehrt Histologie quantitative Fluoreszenz, während mehr arbeitsintensiv, ermöglicht die Quantifizierung der absoluten Gewebespiegel von markierten Molekülen.

Die Verwendung von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Whole-Orgel Imaging und Quantitative Tissue Histologie des Bio-Verteilung von fluoreszenzmarkierten Moleküle zu bestimmen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

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Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

9.5K Aufrufe.  The University of Mississippi Medical Center.  Ex - vivo - Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein schnelles Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von fluoreszierend markierten Verbindungen in und zwischen den Geweben oder den Behandlungsgruppen. Umgekehrt Histologie quantitative Fluoreszenz, während mehr arbeitsintensiv, ermöglicht die Quantifizierung der absoluten Gewebespiegel von markierten Molekülen. 

Serie: The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Forschung

Medizin

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Hybrid μCT-FMT-Bildgebung und Bildanalyse

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Biotechnik

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex vivo drug screenings. However, current adenosine triphosphate (ATP)-based drug screening assays do not capture the complexity of a drug response (cytostatic or cytotoxic) and intratumor heterogeneity that has been shown to be retained in PDTOs due to a bulk readout. Live-cell imaging is a powerful tool to overcome this issue and visualize drug responses more in-depth. However, image analysis software is often not adapted to the three-dimensionality of PDTOs, requires fluorescent viability dyes, or is not compatible with a 384-well microplate format. This paper describes a semi-automated methodology to seed, treat, and image PDTOs in a high-throughput, 384-well format using conventional, widefield, live-cell imaging systems. In addition, we developed viability marker-free image analysis software to quantify growth rate-based drug response metrics that improve reproducibility and correct growth rate variations between different PDTO lines. Using the normalized drug response metric, which scores drug response based on the growth rate normalized to a positive and negative control condition, and a fluorescent cell death dye, cytotoxic and cytostatic drug responses can be easily distinguished, profoundly improving the classification of responders and non-responders. In addition, drug-response heterogeneity can by quantified from single-organoid drug response analysis to identify potential, resistant clones. Ultimately, this method aims to improve the prediction of clinical therapy response by capturing a multiparametric drug response signature, which includes kinetic growth arrest and cell death quantification.

This protocol describes a semi-automated method for medium- to high-throughput organoid drug screenings and microscope-agnostic, automated image analysis software to quantify and visualize multiparametric, single-organoid drug responses to capture intratumor heterogeneity.

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...

Krebsforschung

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Verfolgung von Krankheitserregern im ganzen Organ durch Quantifizierung von fluoreszierenden Reportern

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der bakteriellen Reaktionen auf Antibiotika und Immunsystem in Geweben

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

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In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

A Novel Hochauflösende

Hybrid μCT-FMT-Bildgebung und Bildanalyse

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

Multiparametrisches Tumor-Organoid-Wirkstoff-Screening mit Weitfeld-Live-Cell-Imaging für die Bulk- und Einzelorganoid-Analyse

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen

Hochauflösende dreidimensionale Ganzorgantomographie von mikrobiellen Infektionen