Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.

HINWEIS: Alle verwendeten Tiere in diesem Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Mississippi Medical Center genehmigt. 1. Behandlung von Tieren und Gewebe <ol><li> Verwaltung und Opfer <ol><li> Anesthetize die Tiere unter Verwendung von 3% Isofluran für 5 Minuten und überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen der Zehen Prise Reflex zu beobachten. Bewerben Veterinär Salbe in die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Wiegen Sie das Tier und Pipetten eine 50 mg / kg Dosis von entweder Rhodamin-markiertes ELP, SynB1-ELP oder Tat-ELP in ein 1,5-ml-Röhrchen. Sparen Sie 100 ul der verabreichten markierten Verbindungen zur Formulierung von Standardkurven in späteren Schritten. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Standards von der gleichen Charge des markierten Proteins an die Tiere verabreicht, um gemacht werden, um Unterschiede zu vermeiden aufgrund der Variabilität in Fluoreszenzmarkierungseffizienz. Um Hintergrund fluores richtig entfernenzenz aus späteren Fluoreszenzmessungen, ein unbehandeltes Tier müssen die gleichen Methoden / Reagenzien wie den behandelten Tieren unter Verwendung geopfert werden. </li><li> Administrieren eine IV - Injektion , wie oben beschrieben 1 entweder die Schwanzvene oder die Oberschenkelvene unter Verwendung (der über eine 1 cm lange Inzision in der Leiste zugegriffen wird). Für Analgesie, wenn eine Leisten Einschnitt, verabreichen carprofen subkutan in einer Dosis von 5 mg / kg, und gelten sensorcaine an der Einschnittstelle vor dem Verschließen mit einer Wundklammer. Um über die intranasale (IN) Route verwalten, legen Sie das Tier in Rückenlage. </li><li> Mit einem 2-ul-Pipette, erstellen eine 1-ul Tropfen markierten Verbindung. Kurz den Kopf des Tieres gleiten aus der Narkose Kragen Zugang zu den Nasenlöchern zu ermöglichen. </li><li> Setzen Sie die Spitze der Pipette auf die Öffnung eines einzelnen nare und den Kolben langsam niederdrücken, so dass die Tröpfchen die Nare in die Nasenhöhle zu überfahren. Wiederholen Sie alle 1 min, nares jeden Tropfen, bis die volle Dosis ist abwechselnd AnzeigeHabe. Hinweis: Die maximale Lautstärke über administrierter nicht 10 überschreiten sollte - 15 &amp; mgr; l für Mäuse. </li><li> Lassen Sie die Tiere in Rückenlage unter Narkose für 10 Minuten nach der letzten Verabreichung vor ihnen jeweils in einem individuellen Käfig bewegen. Hinweis: Tiere nicht unbeaufsichtigt lassen, bis sie genügend Bewusstsein wiedererlangt haben Brustlage zu halten. </li><li> 1 h nach der Verabreichung Wieder anästhesieren die Tiere wie zuvor und opfern diese über transcardial Perfusion mit PBS (210,0 mg / L KH 2 PO 4, 9,000.0 mg / L NaCl, 726 mg / L Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) bei 10 mL / min für eine Gesamtmenge von 20 ml. Anmerkung: Die Perfusion der Tiere bei der Opferung aller Blut aus dem Gewebe zu entfernen, erforderlich, um die extravaskuläre Konzentrationen der markierten Verbindungen zu bestimmen. Perfusions-Reagenzien können zu Veränderungen der Hintergrundfluoreszenz führen und sollte konsistent gehalten werden. Das Verfahren des Opfers sollte konsistent seininnerhalb von Gruppen. Verschiedene Methoden der Opfer können in unterschiedlichen Ebenen von Blut innerhalb des Gefäßsystems zur Folge haben, die Änderung der Hintergrundfluoreszenz des Gewebes. </li></ol></li><li> Sammlung von Geweben <ol><li> Bereiten PBS wie zum Spülen der entnommenen Gewebe beschrieben. Anmerkung: Wenn ein anderer Puffer als der Perfusionsflüssigkeit eingesetzt wurde gründlich Gewebe in dem gleichen Puffer. </li><li> Entfernen Sie das Herz, Lunge, Magen, Leber, Milz und Nieren durch einfache Präparation. Kurz in PBS spülen, bevor Labor mit wischt überschüssige Feuchtigkeit zu trocken tupfen oder Feuchtigkeit ab und das Gewebe auf die Abbildungsmatte platzieren. </li><li> Enthaupten die Maus und entfernen Sie die Oberseite des Schädels mit Knochenfräser oder rongeurs. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen das Gehirn, halten die Riechkolben intakt. Spülen, trocken, und legen Sie es auf der Abbildungsmatte zur Verfügung gestellt. </li><li> So entfernen Sie das Rückenmark über schnelle Ausstoß 7, füllen einen 10-ml - Spritze mit PBS und fügen Sie eine abgestumpfte 18-Gauge - Nadel. Hinweis: 18-Gauge-fitsder erwachsene Spinalkanal vieler Mauslinien. Der erforderliche Durchmesser wird mit Tiergröße variieren. </li><li> Legen Sie das Tier in der Bauchlage zu gewährleisten, dass die Öffnung des Wirbelkanals an der Enthauptung Seite ist sauber geschnitten und frei von Blut. </li><li> Entfernen Sie die Haut aus der ganzen Wirbelsäule. Mit scharfen Knochenschneider oder einer Schere, schneiden durch die Wirbelsäule im Lendenbereich von bis zu den Hüften direkt rostral. </li><li> waschen Sie es kurz mit PBS den Spinalkanal zu visualisieren. Führen Sie vorsichtig die Nadel in den Spinalkanal. Hinweis: Die Nadel eng fühlen sollte und kann einige langsame Roll benötigen hin und her während des Einsetzens. Sollte die Nadel locker fühlen, ein mehr rostral Schnitt kann oder einen größeren Durchmesser Nadel hergestellt werden erforderlich sein könnten. </li><li> Mit dem Daumen und Zeigefinger, Druck auf die Wirbelsäule um die Nadel eingeführt. Drücken Sie den Kolben mit moderaten und konstanten Druck. Das Rückenmark intakt aus der rostrale Öffnung im Rücken auswerfenSpalte. Hinweis: Die vollständige Entfernung, Spülen und Trocknen aller wichtigen Organe vernünftigerweise in 5 abgeschlossen sein - 7 min. Diese kurze Zeit verhindert, daß die Notwendigkeit einer Langzeitlagerung in PBS, die in übermäßiger Belichtung und dem Auswaschen von markierten Proteine ​​aus dem Gewebe führen kann. </li></ol></li></ol> 2. Ganz Organ Ex vivo Fluoreszenz - Imaging <ol><li> Imaging-Parameter <ol><li> Starten Sie die Bildaufnahme-Software. In der rechten unteren Ecke des Erwerbs Control Panel, klicken Sie auf &quot;initialisieren&quot;. </li><li> Unter &quot;Aufnahmemodus&quot;, wählen Sie die &quot;fluoreszierend&quot; markieren. Unter &quot;Belichtungszeit&quot; die Option &quot;AUTO&quot;. </li><li> Unter &quot;Binning&quot;, wählen Sie &quot;klein&quot; und die F / Stop auf 2 gesetzt. </li><li> Wählen Sie die 535-nm-Anregung und 580-nm-Emissionsfiltern. Anmerkung: Diese variiert abhängig von der verwendeten Markierung. </li><li> Wählen Sie &quot;Field of View B&quot; und stellen Sie die target Höhe 0,3 cm. Anmerkung: Diese variiert auf die Gewebe je abgebildet werden. </li><li> Sobald die Temperatur-Anzeige grün leuchtet (die Maschine Bedeutung ist voll initialisierten), legen Sie die Gewebe auf dem schwarzen Hintergrund Matte versehen, um sicherzustellen, dass die Gewebe vollständig voneinander getrennt sind. Legen Sie die Matte in der Imager sicherzustellen, dass sämtliche Gewebe innerhalb der gewählten Region Gitter sind. Größere und inhomogenen Geweben, wie die ganze Leber, sollte angelegt werden, um die Überlappung der Flügel zu reduzieren. Anmerkung: Die Gewebe können zusammen in einer einzigen Gruppe angeordnet werden, so dass ein Bild eines einzelnen Tieres oder allen Geweben einer ähnlichen Art aufzunehmen. Dies macht Analyse und Organisation später einfacher. Wenn große Unterschiede in der Fluoreszenzintensität unter verschiedenen Geweben vorhanden sind, ist es am besten Bild sie einzeln oder als Gruppen aus dem gleichen Gewebetyp, wie eine einzelne Belichtungszeit nicht für alle Gewebestärken ideal sein kann. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Erfassen&quot;. </li><li> Nach der Bebilderung, entfernen Sie die Gewebe sofort und zu speichern oder sie für die quantitative Histologie einfrieren, wie in Schritt 4 beschrieben. </li></ol></li></ol> 3. Standards und Bildverarbeitung <ol><li> Standards <ol><li> In PBS Erstellen zweifache serielle Verdünnungen von jedem Protein in der Behandlung der Tiere verwendet, bei der ursprünglichen Konzentration beginnend, mit insgesamt 15-Verdünnungen. Hinweis: Der Konzentrationsbereich darauf abzielen sollte, die zu erwartenden Gewebekonzentrationen enthalten und können zusätzliche Verdünnungen der ursprünglichen Probe erfordern, abhängig von der Ausgangskonzentration. </li><li> Je 100 ul jeder Standard in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte. Fügen Sie ein gut aus reinem PBS ein gewisses Maß an Hintergrundfluoreszenz zu erhalten. </li><li> Bild die Standards mit den gleichen Parametern für die Gewebe-Bildgebung verwendet. </li><li> In der Bildaufnahmesoftware &quot;Tool-Palette&quot; unter &quot;ROI Tools&quot;, wählen Sie die &quot;Region of Interest (ROI&quot;) Kreis und den ROI ziehen um ein gut. Kopieren Sie, dass ROI zu allen anderen gefüllten Brunnen und klicken Sie auf &quot;die ROIs messen.&quot; </li><li> Subtrahiert den Wert der durchschnittlichen Strahlungseffizienz des reinen PBS aus den Werten der anderen Normen; Dadurch wird die Hintergrundfluoreszenz. Zeichnen Sie die Werte gegenüber der bekannten Konzentration in einem Streudiagramm. Anmerkung: Die sich ergebende Gleichung der linearen Trendlinie dann verwendet werden kann, um die relative Fluoreszenzwert zu berechnen. </li></ol></li><li> Bildverarbeitung <ol><li> In der Bildaufnahme-Software, wählen Sie den Freiform-ROI-Tool und ziehen ROIs um jede der einzelnen Gewebe. Klicken Sie auf &quot;Messen&quot;. </li><li> Mit den daraus resultierenden durchschnittlichen Strahlungswirkungsgradmessungen, subtrahieren, die von der unbehandelten Tier Messwerte für jeden Gewebetyp und zeichnen Sie diese Werte auf dem zuvor erstellten Standardkurve. Hinweis: Die resultierenden relativen Fluoreszenzwerte bieten eine schnelle und genaue Momentaufnahme derBioverteilung des markierten Verbindung. </li></ol></li></ol> 4. Quantitative Tissue Histologie <ol><li> Vorbereitung und Einfrieren von Gewebe für Slicing <ol><li> Erstellen oder erwerben Behälter mit ausreichender Größe, die die ausgewählten Gewebe und Kryostat zum Einfrieren verwendet werden. Verpackung Aluminiumfolie um einen entsprechend dimensionierten und geformten Gegenstand funktioniert gut. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung aus Isopropanol und Trockeneis um die Hälfte eines 500-ml-Becher mit Trockeneis füllen und das Hinzufügen von ~ 350 ml Isopropanol, damit ausreichend Flüssigkeit über dem Trockeneis ist, um teilweise den Gefrierbehälter versenken. Hinweis: Der flüssige Stickstoff im Bruch der optimale Schnitttemperatur Verbindung führt oft (OCT) und eingebetteten Geweben und sollte vermieden werden. </li><li> Füllen Sie den Gefrierbehälter teilweise mit Oktober, um sicherzustellen, dass es keine Blasen vorhanden sind. Wenn es Blasen sind, arbeiten die Blasen aus der Lösung mit einer Pinzette oder einem ähnlichen implementieren. </li><li> Entfernen Sie das Gewebevon PBS und gründlich trocknen es, entweder indem sie sie mit einem Labor und tätschelte sanft abzuwischen oder durch die Ränder der empfindlichen Gewebe in ein Labor zu berühren wischen und damit die Flüssigkeit weg Docht. </li><li> Legen Sie das Gewebe sanft in den Oktober im Inneren des Gefrierbehälters, um sicherzustellen, keine Blasen unter dem Gewebe einzuführen. Sobald das Gewebe an Ort und Stelle ist, fügen Oktober, bis das Gewebe vollständig bedeckt ist. </li><li> Unterzutauchen den Gefrierbehälter so weit wie möglich das Isopropanol ohne daß im Inneren des Behälters in Kontakt mit dem freiliegenden OAT kommen. Lassen Sie 30 bis 90 s (oder möglicherweise mehr für größere Gewebe) für das OCT und Gewebe vollständig einzufrieren, bevor sie für so lange wie nötig bei -80 ° C lagern. </li></ol></li><li> Herstellung von Standards für Slicing. <ol><li> Vorbereitung und entsprechend 1 ml-Einwegspritzen Label vom Ende der Trommel entfernt wird, so dass die gesamte Länge der Spritze ist ein Durchmesser. Dies ermöglicht es dem gefrorenen Zylinder später herausgeschoben werden. </li><li> Unsein 15-Schritt zweifache serielle Verdünnung der verabreichten Verbindungen ing Oktober, zu erstellen, wie sie zuvor mit PBS durchgeführt wurde, aber mit einem letzten resultierende Volumen von 1 ml. Fügen Sie eine Probe von reinem OCT zur Entfernung von Hintergrundfluoreszenz Werte. </li><li> Die Viskosität der OCT macht eine ausreichende Durchmischung schwierig. Drehen Sie die Rohre und ermöglichen es dem Oktober vollständig zu begleichen, bevor sie wieder zu invertieren. Wiederholen Sie diese 10 bis 20 mal um eine einheitliche Mischung zu gewährleisten. Halten Sie die Standardlösungen bei 4 ° C und vor Licht während des Mischens. </li><li> Nach dem Mischen herzustellen wieder ein Gemisch aus Isopropanol und Trockeneis, wie zuvor. Hinweis: Flüssiger Stickstoff kann auch anstelle des Isopropanol / Trockeneis-Mischung verwendet werden, die Spritzen schnell entfernt werden, nachdem sie festgefroren sind. </li><li> Zeichnen Sie die Oktober-Standard in die Spritze, wobei darauf geachtet, so wenig Blasen wie möglich einzuführen. Nach dem Ziehen des OCT-Lösung auf, tauchen sofort die Spritze direkt in die Isopropanol und lassen Sie die Lösung vollständig einzufrierenin der Spritze für 10 - 20 s. Speichern der Spritzen bei -80 ° C, so lange wie notwendig. </li></ol></li><li> Schneiden von Gewebe und Standards <ol><li> Platzieren beiden Geweben und Standards in -20 ° C und lassen genügend Zeit für alle Proben zu Temperatur kommen. Hinweis: Die ideale Schnitt Temperatur fällt in der Regel um die 10 ° C-Bereich für die meisten Gewebe, aber es hängt letztlich von Gewebegröße und Fettgehalt und muss empirisch verfeinert werden. </li><li> Mit Hilfe eines Kryostaten geschnitten Gewebe in 20 &amp; mgr; m dicke Scheiben schneiden und montieren sie auf Objektträger, wie zuvor 8 beschrieben. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C und halten sie weg von Licht so viel wie möglich während des Schneidens und bis Scannen. Hinweis: Es ist wichtig, dass hier die Abschnitte in geeigneter Weise über die gesamte Dicke des Gewebes verteilt sind, gemessen werden. </li><li> Um die Standards auf dem Kryostaten Bohrfutter montieren, nehmen Sie die Spritze aus dem Gefrierschrank und erwärmen die Außenseite 3 - 5 s durch holding es in der Hand. Drücken Sie den Kolben, bis ein kurzer Abschnitt (~ 1 cm) des OCT-Zylinder ist außerhalb der Spritze. <ol><li> Mit Hilfe einer Rasierklinge geschnitten durch den Zylinder und legen den resultierenden Zylinderabschnitt senkrecht auf das Futter, OAT es an Ort und Stelle zu halten. Diese Konfiguration sollte in gut definierte Kreise führen geschnitten. </li></ol></li><li> Schneiden Sie die Zylinder bei 20 &amp; mgr; m, Platzieren einer Scheibe von jeder Verdünnung auf eine einzelne Folie, so dass eine Folie die gesamte Standardkurve darstellt. Lagern Sie die Objektträger bei -20 ° C bis zum Scannen bereit. </li></ol></li><li> Scannen und Quantifizierung <ol><li> Starten Sie den Scan-Array-Software und klicken Sie auf &quot;543 Laser&quot;, um den Laser-Startprozedur beginnen. Warten Sie 15 min für die Laser bereit zu bekommen. </li><li> Sobald der Laser bereit ist, die Folien von -20 ° C zu entfernen und sie in einem großen, lichtgeschützten Behälter auf Temperatur zu kommen, bewegen und für 3 Minuten trocknen lassen. Dadurch wird die Bildung von Feuchtigkeit im sli verhindernde-Scanner. </li><li> Legen Sie die Folie in die Schieberaufnahme an der Dia-Scanner. Klicken Sie auf &quot;Scannen&quot; und wählen Sie &quot;easy-Scan ausgeführt werden.&quot; </li><li> Stellen Sie die Scan-Auflösung bis 50 um. </li><li> Wählen Sie das erste &quot;Use&quot; Checkbox unter &quot;Fluorophor&quot; und wählen Sie &quot;TRITC.&quot; Stellen Sie die PMT-Verstärkung auf 80%. Hinweis: Diese Einstellungen variiert in Abhängigkeit von dem Fluorophor und der Konzentration der markierten Moleküle. </li><li> Auf der linken Seite, sicherzustellen, dass der Abtastbereich die gesamte Folie umfasst. Klicken Sie auf &quot;Start&quot;. </li><li> Nach dem Scannen, wählen Sie &quot;Datei&quot; und &quot;Speichern unter&quot; und dann als .tif das Bild zu speichern. Hinweis: Folien von Geweben und Standards sollten auf den gleichen Einstellungen gescannt werden. </li><li> Legen Sie die resultierenden Bilder in ImageJ und wählen Sie ROIs um die Gewebe und Standards. Unter dem Reiter &quot;analysieren&quot;, wählen &quot;Messungen&quot; und wählen Sie &quot;Grauwert bedeuten.&quot; Click220; messen &quot;. Anmerkung: Wie bei der vorherigen Technik, die Hintergrundfluoreszenz von allen Messwerten subtrahiert werden muß. </li><li> Zeichnen Sie die mittleren Grauwertmessungen von den Standards gegen die bekannten Konzentration eine Standardkurve zu erstellen. Hinweis: Die resultierenden Messungen aus dem Gewebe sollte auf dieser Standardkurve in jedem Gewebe und aufgetragen gemittelt werden, um die Konzentration innerhalb des Gewebes zu bestimmen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure.">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li><li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+purification+and+delivery+systems+(PADS)+for+therapeutic+angiogenesis.">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li><li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model.">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li><li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+improved+blood&#8211;brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages.">The improved blood&#8211;brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li><li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography.">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li><li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy.">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain.">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).</li><li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative.">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li><li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging.">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li><li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins:+Advances+and+challenges.">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).</li><li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D.">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li></ol>

GLB is owner of Leflore Technologies, LLC, a private company working to develop ELP-based drug delivery technology. Leflore Technologies provided no support for the publication of this paper or for the generation of data within it.

Während ex vivo Vollorgan Bildgebung im Allgemeinen einfach ist, kann die Einhaltung einiger grundlegender Konzepte und Techniken , um die Genauigkeit der Bio-Verteilungsmessungen verbessern. Kurze Wellenlängen des Lichts Erfahrung ein hohes Maß an Streuung und Absorption in den meisten Geweben, die wesentliche Auswirkungen auf die Nützlichkeit der kurzwelligen Fluorophore. Diese Fluorophore haben eine begrenzte Anwendung in Tiefgewebeuntersuchungen, aber sie haben effektiv in Experimenten verwendet wurden ...

Fluoreszenzmarkierung ist ein leicht eingesetzt und effektives Verfahren zur biologischen Verteilung von Verbindungen zu bestimmen, die eine Reihe von Geräten verwendet, die auf vielen Laboratorien üblich ist. Fluorophore sind überall erhältlich, relativ kostengünstig und kommen eine Vielzahl von Wellenlängen in, so dass mehrere markierte Moleküle ohne Störung gleichzeitig verwendet werden können. Die meisten Fluorophore haben eine Reihe von Chemien für die Konjugation an verschiedene reaktive Gruppen an Zielverbindungen und das Verfahren der Konjugation ist für die meisten Arten von reaktiven Stellen im allgemeinen einfach. Darüber hinaus sind die Geräte für die Messungen von fluoreszenzmarkierten Verbindungen erforderlich, die in vielen Labors. Fluoreszierende Mikroskope, Imager und Diascanner können alle unter verschiedenen Umständen verwendet werden, die sehr zugänglich Verwendung von fluoreszierenden Markierung zu machen. Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden , häufig die Biodistribution und die Kinetik der Verbindungen zu bestimmen , sowohl in vivo als auch ex vivo mit Live - Imaging - Geräte, wie zum Beispiel die IVIS Spectrum Imager und durch quantitative Gewebe Histologie 2,3. Die Verwendung von ex vivo Voll organ Abbildungs Live-Bilderzeugungsvorrichtungen verwendet , hat im Laufe der Zeit erhöhte sich aufgrund ihrer einfachen Verwendung und Fähigkeit, schnell einen genauen Vergleich der relativen Konzentrationen von markierten Verbindungen zu erstellen , ohne die Weiterverarbeitung von tissues4 erfordern. Während jedoch ex vivo Vollorgan Bildgebung für die einfache Analyse und den Vergleich ermöglichen kann, ist es nicht eine quantitative Messung der absoluten Konzentrationen der Verbindung innerhalb eines Gewebes zu erzeugen. Dies ist auf Lichtstreuungseffekte innerhalb intakter Organe. Da die Lichtstreuung (und in einem geringeren Ausmaß, Extinktion) variiert je nach Gewebegröße und Dichte können ganze Organbildgebungsgewebespiegel in großen oder dichten Organen unterschätzen. geeignete Standards für absolute Konzentrationsmessungen Formulieren ist auch schwierig, weil man die Dicke nachahmen mussund die Dichte jedes einzelnen Organs. Auf der anderen Seite, ist ganze Organ Bildgebung ein schnelles Verfahren, die relativen Gewebespiegel eines Mittels zu erhalten, und es ist ideal für die relative biologische Verteilung mehrerer verwandter Moleküle (wie in Drug-Targeting-Studien) verglichen wird. Eine alternative Strategie ist es, quantitative Fluoreszenz Histologie zu verwenden, eine Technik , die aus dem Verfahren der quantitative Autoradiographie abgeleitet, absolute Gewebespiegel eines Testmittels 5,6 zu erhalten. Anstatt Platzierung ein ganzes Tier oder ein Organ in ein Vorstellen Gerät erfordert quantitative Gewebe Histologie, dass jedes Gewebe geschnitten werden, auf Schlitten montiert, gescannt und einzeln analysiert. Standards des Testmittels werden mit der gleichen Dicke wie die Organproben vorbereitet und in Scheiben geschnitten. Durch das Schneiden wird alle Organe und Standards auf die gleiche Dicke, die Variabilität aufgrund von Lichtstreuung oder Absorption eliminiert und Gewebefluoreszenzintensität kann mit der Standardkurve fit absolute concent zu bestimmen,Ration. Während dieses Verfahren, wenn es richtig gemacht, quantitativ ist, es ist auch arbeitsintensiv und leicht falsch behandelt. die komplexer Natur der quantitativen Histologie und der deutlich höhere Arbeitskosten im Vergleich zu den gesamten Organ Bildgebung Da wird es lohnt sich zu untersuchen, wo jeder Prozess am praktischsten ist zu verwenden, wenn die Bio-Verteilung der fluoreszenzmarkierte Verbindungen zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine ausführliche Beschreibung, wie diese Verfahren zusammen verwendet werden, um effizient die biologische Verteilung von Rhodamin-markiertem Elastin-ähnliches Polypeptid (ELP), mit oder ohne den Zusatz der SynB1 oder Tat zellpenetrierenden Peptide zu vergleichen, über die intranasal (IN) und intravenösen (IV) Verabreichungswege.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="819">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Reagents</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:231px;">Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide)</td>
			<td style="width:99px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:159px;">T6027, A20342</td>
			<td>Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:231px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">1002243569</td>
			<td>PBS Buffer for rinsing</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:231px;">Optimal Cutting Temperature Compound</td>
			<td style="width:99px;">Tissue-Tek</td>
			<td style="width:159px;">4585</td>
			<td>Used for freezing and mounting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Equipment</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For ex vivo whole organ imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Cryomicrotome</td>
			<td style="width:99px;">Thermo</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For cryosectioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fluorescence slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td>For slide scanning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of ex vivo whole-organ imaging and quantitative tissue histology to determine the bio-distribution of fluorescently labeled molecules

Fluoreszenzmarkierung ist ein gut etabliertes Verfahren , das Schicksal der markierten Moleküle unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen für die Prüfung sowohl in vitro als auch in vivo. Fluoreszenzsonden sind besonders nützlich bei der biologischen Verteilung von großen Molekülen verabreicht Bestimmung, wobei die Zugabe eines niedermolekularen fluoreszierenden Markierung unwahrscheinlich ist, die Kinetik oder bio-Verteilung der Verbindung beeinflussen. Eine Vielzahl von Methoden existieren Biodistribution zu untersuchen, die deutlich in der Aufwand variieren erforderlich ist und ob die sich ergebenden Messungen sind vollständig quantitative, sondern mehrere Methoden in Verbindung verwenden, können bio-Verteilungen ein schnelles und wirksames System für die Analyse bereitzustellen. Ex - vivo - Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein Verfahren , das schnell verwendet werden kann , um die relativen Konzentrationen von fluoreszierenden Molekülen innerhalb von Geweben vergleichen und zwischen mehreren Arten von Geweben oder Behandlungsgruppen. Mit Hilfe eines Imaging-platForm für lebende Tiere oder ganze Organ Bildgebung, Fluoreszenz in intakten Geweben kann ohne weitere Verarbeitung bestimmt werden, Zeit und Arbeitsersparnis und bietet gleichzeitig ein genaues Bild von der gesamten Bio-Verteilung ausgelegt. Dieses Verfahren ist ideal in Experimenten versucht, die Gewebespezifität einer Verbindung zu bestimmen, oder für den Vergleich von mehreren verschiedenen Verbindungen. Quantitative Gewebe Histologie auf der anderen Seite erfordert umfangreiche Weiterverarbeitung der Gewebe, um ein quantitatives Maß für die markierten Verbindungen zu schaffen. Zur genauen biologischen Verteilung beurteilen, alle Gewebe von Interesse muss in Scheiben geschnitten, gescannt werden, und in Bezug auf Standardkurven analysiert, um Vergleiche zwischen den Geweben oder Gruppen zu machen. Quantitative Gewebe Histologie ist der Goldstandard für absolute Verbindungskonzentrationen im Gewebe zu bestimmen. Hier beschreiben wir, wie beide Methoden verwendet werden können, zusammen effektiv die Fähigkeit verschiedener Verabreichungsmethoden zur Beurteilung einesnd Verbindung Modifikationen zielen und fluoreszierend markierte Moleküle an das zentrale Nervensystem 1 zu liefern.

Die Daten unten beschreiben die Lieferung von drei Verbindungen: ein Drug-Delivery - Vektor als ELP und zwei Versionen von ELP mit zellpenetrierendes Peptide (SynB1-ELP und Tat-ELP) 9 modifiziert bekannt. Alle drei Verbindungen wurden mit Tetramethylrhodamin-5-Maleinimid markiert und über zwei Verabreichungswege (IN und IV) geliefert. Das Ziel dieser Experimente war es, die Verbindung und Art der Anwendung zu bestimmen , in der besten Eindringen in das zentrale Nervensystem (ZNS) 3 führen würde....

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The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex - vivo - Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein schnelles Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von fluoreszierend markierten Verbindungen in und zwischen den Geweben oder den Behandlungsgruppen. Umgekehrt Histologie quantitative Fluoreszenz, während mehr arbeitsintensiv, ermöglicht die Quantifizierung der absoluten Gewebespiegel von markierten Molekülen.

Die Verwendung von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Whole-Orgel Imaging und Quantitative Tissue Histologie des Bio-Verteilung von fluoreszenzmarkierten Moleküle zu bestimmen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

the-use-ex-vivo-whole-organ-imaging-quantitative-tissue-histology-to

Research

JoVE Journal

Biology

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

9.5K Aufrufe.  The University of Mississippi Medical Center.  Ex - vivo - Ganzkörper -Bildgebung Organ ist ein schnelles Verfahren zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von fluoreszierend markierten Verbindungen in und zwischen den Geweben oder den Behandlungsgruppen. Umgekehrt Histologie quantitative Fluoreszenz, während mehr arbeitsintensiv, ermöglicht die Quantifizierung der absoluten Gewebespiegel von markierten Molekülen. 

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex-vivo-Kultur von embryonalen Maus-Haut-und-Live-Darstellung von Migration Melanoblasten

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Raum-Zeit-Mapping der Motilität in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Vorbereitung des Darms

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

Die c-fos-Protein Immunohistologische Nachweis: Ein nützliches Werkzeug als Marker der Mittelwegen beteiligt sind in spezifischen physiologischen Antworten<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Automatisierte Bildgebung und Analyse zur Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Makropinosomen

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

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