Wir danken Marek Weiler zum Durchführen der Phantomexperimenten. Diese Arbeit wurde durch den Europäischen Forschungsrat (ERC Starting Grant 309495: NeoNaNo) unterstützt, der deutschen Bundeslandes Nordrhein-Westfalen (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE); ForSaTum), der Deutschen Ministerium für Bildung und Forschung (BMBF) (Förderprogramme Virtual Liver (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), der RWTH Aachen (I 3 TM Seed Fund) und Philips Research (Aachen, Deutschland).

Das Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung der folgenden Schritte: Zuerst werden Phantome oder Mäuse und das multimodale Maus Bett zur Bildgebung bereit. Dann wird eine Ganzkörper-Scan im μCT erworben. Anschließend wird das Maus-Bett ist mit dem FMT wo zwei Scans werden (und umgedreht) erworben übertragen. Dies kann für mehrere Mäuse zu mehreren Zeitpunkten wiederholt werden. Nach Abschluss der Datenerfassung, müssen die Daten exportiert und sortiert, um automatische Segmentierung (Definiens eine Software-Lizenz erforderlich), sowie Bildfusion und Fluoreszenz-Rekonstruktion (ein Imalytics Präklinische Software-Lizenz erforderlich ist) zu ermöglichen. Schließlich wird gezeigt, wie das multimodale Datensätze visualisiert werden und wie Organe interaktiv segmentiert, um die biologische Verteilung der fluoreszierenden Sonden quantifizieren. 1. Phantom Vorbereitung HINWEIS: Phantoms sind nützlich, um das Abbildungssystem zu prüfen, sondern auch, um die Kalibrierung zu bestimmen factor für eine neue Sonde. <ol><li> Eine Lösung aus 200 ml Wasser, 2% igen, 1,8 g TiO 2 -Pulver, 50 ul Trypanblau. Nach dem Kochen, füllen die Lösung in eine rechteckige Form, etwa von 8 cm Länge, 3 cm Breite und 1,5 cm Höhe. </li><li> Bereiten Sie mehrere fluoreszierende Einschlüsse im Phantom mit Pipettenspitzen, die eine Mischung aus Fluoreszenz und μCT-Kontrastmittel. Um die Einschlüsse zu erstellen, schneiden Sie die Pipettenspitzen und versiegeln sie mit einem Feuerzeug. </li><li> Nachdem die Lösung verfestigt wird, legen Sie die Einschlüsse in das Phantom. Weggeschnitten einige Teile des Phantoms, um eine unregelmäßige Form zu erreichen, und um es in die multimodale Maushalterung passen. </li><li> Um den Kalibrierungsfaktor für eine neue Sonde zu bestimmen, sind einige Phantom Scans erforderlich. Hierzu wird der Standard FMT gestrichelt in Kombination mit bekannten Mengen der Sonde verwendet. Für eine erhöhte Genauigkeit, fügen 4% Lipid-Emulsion zu der Lösung, um den gleichen Streukoeffizienten im Inneren der Aufnahme als in der EmpfangsRest des Phantoms. Auch eine kleine Menge (2%) von μCT Kontrastmittel für einfachere Bildanalyse. </li></ol> 2. Maus Vorbereitung HINWEIS: μCT-FMT-Bildgebung erfordert besondere Vorbereitung einschließlich der Betäubung und Haarentfernung. <ol><li> Platzieren Sie die Maus auf Chlorophyll-freie Lebensmittel 7 Tage vor Bildgebung. Dies wird das Hintergrundsignal zu reduzieren und ist besonders wichtig für FMT Kanäle unterhalb 750 nm. </li><li> Alle Tierversuche werden unter Vollnarkose durchgeführt. Um die Narkose einzuleiten, die Maus in eine Kammer mit 2% Isofluran in Luft (Durchfluss 5 l / min) gefüllt, bis die Maus beim Einschlafen. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung von sanften Zehe oder Kneifen Haut und durch Überprüfung Entspannung der Muskelspannung (z. B. Kiefermuskel). Auf die Anästhesie aufrecht zu erhalten, fortsetzen Isofluran Anwendung mit einem Schlauch, der auf der Nase der Maus platziert ist (2% Isofluran in Luft, Flussrate 1 l / min). Um Augen drynes verhinderns, verwenden vet Salbe auf narkotisierten Mäusen. </li><li> Um Kontrastmittel zu injizieren, fixieren Sie die narkotisierten Maus auf einem Heizkissen mit Klebeband. Platzieren eines Katheters (Spritzennadel an einem Rohr angebracht ist) in die Schwanzvene injiziert und die Fluoreszenzkontrastmittel (beispielsweise 2 nmol, bei maximaler Injektionsvolumen von 5 ml / kg Körpergewicht, das heißt 150 ul einer 30 g Maus). </li><li> Zur Abtastung eines behaarten Maus weist der Abtastbereich im Voraus enthaart werden. Verwenden Sie dazu einen Rasierer oder Enthaarungscreme. Einige Stämme von Mäusen können Ausschläge von der Enthaarungscreme zu entwickeln. Daher überwachen die Mäuse für Hautveränderungen und kontaktieren Veterinärpersonal für die Pflege, wenn nötig. Testen Sie auch die Toleranz auf einer kleinen Anzahl von Tieren bei der Verwendung von neuen Mausstämme. </li><li> Halten Sie die Maus während μCT Bildgebung und FMT anästhesiert (2% Isofluran in Luft, Durchflussmenge 1 l / min). </li></ol> 3. Maus Bed Vorbereitung HINWEIS: μCT-FMT Scannen, verwenden Sie ein multimodalesMaus Bett, die beide in die μCT und der FMT passt. <ol><li> Vor der Bildgebung, die Maus reinigen Bett mit feuchten Tüchern. Verwenden Sie kein Ethanol, weil dies die Acrylglas beschädigen. Stellen Sie sicher, dass die Marker sind frei von Wasser, da dies die automatisierte Marker Erkennung beeinträchtigen. </li><li> Öffnen Sie die Schrauben des multimodalen Maus Bett und das Oberteil zu entfernen. </li><li> Befestigen Sie den Narkosegas Rohr auf der Maus-Bett und fixieren Sie es mit Klebeband. </li><li> Setzen Sie den narkotisierten Maus in die Maus Bett und legte die Nase in die Gasröhre. Sicherstellen, dass der Kopf der Maus ist auf der Vorderseite Indikator für die Maus Bett (Abbildung 1). </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Maus in der Mitte der Maus Bett optimal zu nutzen das Sichtfeld des FMT. </li><li> Schließen Sie die Maus Bett und bis die Maus fest gehalten Schrauben festziehen. Stellen Sie sicher, kann die Maus ständig durch visuelle Überwachung der Brustatmung Bewegungen atmen. </li></ol> 4. μCT Imaging ANMERKUNG: Eine Ganzkörper-Scan wird mit der μCT durchgeführt. Die erzeugte anatomischen Daten zur Bildfusion erforderlich ist, für eine verbesserte Fluoreszenzrekonstruktion und Bildanalyse. <ol><li> Platzieren Sie die Maus Bett mit der Maus in die μCT. Stellen Sie sicher, dass die Maus in einer Weise, dass es geht &quot;tail-first&quot; in die μCT platziert. Dies ist wichtig für die automatisierte Fusion. </li><li> Um Anästhesie aufrechtzuerhalten, wenn die μCT-Deckel geschlossen ist, schließen Sie die Rohre, um das Gas durch den Fall der μCT kanalisieren. Zuerst nehmen Sie den langen Schlauch von der Maus-Bett und hängen Sie es an den Anschluss an der Außenseite der μCT. Bringen Sie dann die verbleibende freie Ende an den Anschluss in der μCT. </li><li> Fahren Sie mit der Maus in die μCT Bett. Sicherstellen, dass das Gasrohr nicht locker ist und nicht durch die sich drehende Gantry verfangen. Falls erforderlich, fixieren Sie es mit Klebeband. Stecken Sie den Schlauch in die Aussparung des Halters der Maus Bett. </li&gt; <li> Schließen Sie die μCT und erwerben ein Topogramm. Wählen Sie mindestens zwei Unterabtastungen, um einen wesentlichen Teil der Maus und die Maus Bett, die für die Fusion und den Wiederaufbau ist bedecken. </li><li> Wählen Sie die μCT Scan-Protokoll namens HQD-6565-360-90, der 720 Projektionen mit 1032 x 1012 Pixel bei einer vollen Umdrehung die eine Scan-Zeit von 90 s pro Unterscan erwirbt. Röhrchen werden bei 65 kV Spannung und Strom 1,0 mA betrieben. Alternativ kann die Strahlendosis und Scandauer zu reduzieren, wählen Sie das Scanprotokoll SQD-6565-360-29 720 Projektionen, die mit 516 x 506 Pixeln mit Scanzeit 29 s pro Unterscan erwirbt. </li><li> Starten Sie die μCT-Scan. Der blaue Balken zeigt den Fortschritt. Die Unterabtastungen anschließend erworben werden. Unterkühlung und Flüssigkeitsverlust kein Problem wegen der kurzen Untersuchungszeit von nur wenigen Minuten. Den Deckel der μCT beim Scannen nicht öffnen, weil dies automatisch den Scan unterbrechen, um den Benutzer vor zu schützenStrahlung. </li><li> Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie den Deckel, schließen Sie das Narkose Rohr und lösen Sie die Mausbett aus der Halterung, um sie an die FMT transportieren. </li></ol> 5. FMT Imaging HINWEIS: Direkt nach μCT Abtastung wird die Maus in der FMT in zwei Konfigurationen (und auf dem Kopf), der für eine verbesserte Rekonstruktion Fluoreszenz zusammen verwendet werden abgetastet. <ol><li> Schalten Sie den Narkosegasversorgung (2% Isofluran in Luft, Durchflussmenge 1 l / min) für die FMT, bevor Sie den Maus-Bett in die FMT. Verwenden des FMT Steuerungssoftware, erstellen Sie eine Studiengruppe mit einer geeigneten Anzahl von Themen (dh Mäuse). Wählen Sie die Sonden, die für die Bildgebung (Verwendung OsteoSense für neuartige Sonden, die nicht aufgeführt sind) verwendet werden. </li><li> Tragen Sie die multimodale Maus Bett mit der Maus an die FMT. Der lange flexible Narkosegasrohr hält den Gasstrom. Vor dem Einsetzen des Maus-Bett in die FMT, entfernen Sie vorsichtig das Rohr, da esnicht im Inneren des FMT benötigt. Vermeiden Sie es, die Schrauben der Maus Bett. </li><li> Platzieren Sie die Maus in das Bett FMT mit dem roten Zeiger ersten (&quot;kopfüber&quot;). Dies ist wichtig für die Bildfusion, um im Einklang mit der μCT sein. </li><li> Schließen Sie die FMT. </li><li> Wählen Sie die richtige Studiengruppe und Thema. Wählen Sie den gewünschten Kanal des FMT (für OsteoSense 750EX, verwenden Sie die 750 nm-Kanal). </li><li> Fügen Sie eine Beschreibung, z. B. &quot;up&quot; oder &quot;down&quot; und erwerben einen Überblick Scan durch Drücken von &quot;Aufnahme&quot;. Dies erfasst einen Reflexions Bild des gesamten Sichtfeld. Achten Sie darauf, keine &quot;Reflexions Images Only&quot; ausgewählt, da es sonst nicht möglich ist, zu erwerben 3D scannt anschließend. </li><li> Passen Sie die Bildparameter für die 3D-Scan. Vergrößern Sie das Sichtfeld, so viel wie möglich von der Maus enthalten. Üblicherweise wird der Kopf und Schwanz nicht ganz in das Blickfeld zu passen, aber. Klicken Sie auf &quot;Advanced221; und überprüfen Sie die Imaging-Einstellungen. Eingestellt Abtastdichte bis 3 mm, und Empfindlichkeit gegenüber normalen Beleuchtungs min / max 5000 und 50000 auf. </li><li> Klicken Sie auf &quot;In den Wiederaufbau Warteschlange&quot; und klicken Sie dann auf &quot;Scan&quot;, um den Suchlauf zu starten FMT. Dies wird etwa 5 bis 15 Minuten dauern, abhängig von der Größe und Dicke der Maus, da längere Belichtungszeiten für dickere Gegenstände erforderlich. Das Gerät enthält einen beheizten Imaging-Kammer zu Unterkühlung zu vermeiden. </li><li> Nach dem Scan-Flip die Maus Bett einschließlich der Maus auf den Kopf und eine weitere Überprüfung zu erwerben. Dies bietet zusätzliche Daten für das Fluoreszenz-Rekonstruktion. </li><li> Wenn die μCT und die FMT-Scans abgeschlossen sind und die Maus erwacht aus der Narkose, nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend Bewusstsein, zum Beispiel wiedererlangt, zum Spazierengehen oder Brustlage zu halten. </li></ol> 6. Bild Fusion und Wiederaufbau HINWEIS: Nach derBeendigung der μCT-FMT Scanning, beispielsweise am Ende der Studie, muss die erfassten Daten, die sortiert werden, um die automatische Bildfusions und Fluoreszenz Wiederaufbau zu ermöglichen. <ol><li> Um die Scans für die Weiterverarbeitung zu sortieren, erstellen Sie einen Ordner für die Untersuchung. Für jede μCT-FMT-Scan, erstellen Sie einen Unterordner, dessen Name mit der Maus ID und den Zeitpunkt, z. B. M01_02h. </li><li> Für jede μCT-FMT scannen, exportieren Sie die FMT-Scans (oben und unten), wie .fmt Dateien und speichern Sie sie in das Unterverzeichnis mit Dateinamen mit der Endung entweder &quot;_up.fmt&quot; oder &quot;_down.fmt&quot;. Jedes .fmt Datei enthält die erworbenen Rohdaten, also die von der Kamera, den Metadaten erfasst Anregungs- und Emissionsbilder wie die Belichtungszeiten, und die Fluoreszenz Rekonstruktion durch FMT erzeugt. </li><li> Unter Verwendung der μCT Software eine Rekonstruktion mit isotropen Voxelgröße 35 &amp; mgr; m. Wählen Sie eine glatte Rekonstruktionskern (T10). Passen Sie das Sichtfeld sodass die gesamte Maus-Bett mit den Markern abgedeckt ist. Wählen MIFX / RAW als Ausgabeformat und starten Sie den Wiederaufbau. Nachdem der Wiederaufbau abgeschlossen ist, verschieben Sie die μCT Rekonstruktion Dateien in das Unterverzeichnis des μCT-FMT-Scan. </li><li> Exportieren Sie die μCT und FMT-Daten für alle Scans. Stellen Sie sicher, dass jedes Unterverzeichnis enthält zwei .fmt Dateien (oben und unten) und die μCT Wiederaufbau im MIFX / RAW-Format. Um Vollständigkeit zu überprüfen wählen Sie Menü-&gt; CT-FMT&gt; Überprüfen Sie mit Hilfe der Vollständigkeits Imalytics Präklinische Software. Eine Liste der Fehler könnte angezeigt werden, wie beispielsweise fehlende .fmt Dateien oder μCT Rekonstruktionen. Beheben Sie die Fehler, und überprüfen Sie die Vollständigkeit, bis alle Fehler behoben sind. </li><li> Verwendung Menü-&gt; CT-FMT&gt; Einstellungen, überprüfen Sie den Servernamen des Definiens Software und gegebenenfalls einstellen. Der Standardwert ist http: // localhost: 8184, unter der Annahme, dass der Definiens-Software auf demselben Computer installiert ist. Im nächsten Schritt, um die au ausführen wird der Definiens-Software erforderlichMated Segmentierung des Maus-Bett und Marker. </li><li> Klicken Sie auf Menü-&gt; CT-FMT&gt; Sicherungsgruppe in der Imalytics Präklinische Software zur automatisierten μCT-FMT-Fusion für die gesamte Studie durchzuführen. Dies dauert ein paar Minuten pro μCT-FMT scannen und die Ergebnisse in einem Ordner mit der Endung &quot;Package&quot; parallel zum Studium Ordner. Dieser enthält eine kleinere Teilmenge von Dateien (die μCT Daten und der verschmolzenen Hersteller bereitgestellten FMT Wiederaufbau), die für die weitere Analyse relevant sind. </li><li> Klicken Sie auf Menü-&gt; CT-FMT&gt; Rekonstruieren Gruppe (FMT) in der Imalytics Präklinische Software, um die Fluoreszenz Wiederaufbau einschließlich der Erzeugung von Absorptions- und Streu Karten 13 durchzuführen. Obwohl die Verarbeitung GPU-beschleunigte 20, wobei jeder Rekonstruktion erfordert 1 bis 4 Stunden in Abhängigkeit von der Größe der Maus. Die Ergebnisse werden in den Paketordner gespeichert werden. Hinweis: Um einen höheren Durchsatz zu ermöglichen, zur Zeit führen wir diese Rekonstruktionen auf einer GPU-Cluster mit 56 GPUs. </li&gt; </ol> 7. Bildanalyse WICHTIG: Um quantitative Messungen aus den Bilddaten zu extrahieren, wird die Segmentierung von Läsionen und Organe notwendig. <ol><li> Nachdem alle Datensätze verschmolzen und rekonstruiert, erstellen Sie eine Segmentierung für jedes μCT-Scans mit dem FMT Imalytics Präklinische Software. </li><li> Legen Sie eine μCT-Datei als Unterlage und die Fluoreszenz-Datei als Overlay. Drücken Sie &quot;3D&quot; auf dem Volume-Rendering drehen und überprüfen den Datensatz. </li><li> Segment die Lunge, klicken Sie auf Menü-&gt; Classes-&gt; Klasse hinzufügen, und erstellen Sie eine Klasse namens &quot;tmp&quot;. Dies kann auch über das Kontextmenü durchgeführt werden. Erstellen Sie eine neue Klasse setzt es automatisch als Ausgabeklasse für die anschließende Segmentierung Operationen. <ol><li> Führen Sie eine Schwellenwertoperation Segment alle Regionen mit geringer Intensität in der μCT Datensatz (klicken Sie auf Menü-&gt; Segmentation-&gt; Thresholding-&gt; Unten, und geben 600). Jetzt die Luft die tmp-Klasse enthält außerhalb des moverwenden, sondern auch das Lungengewebe. </li><li> Erstellen Sie eine &quot;Lung&quot; Klasse. Führen Sie einen &quot;Fill Region&quot; Betrieb (Rechtsklick in die Lunge ein und wählen Sie Menü-&gt; Füllen Region-&gt; Füllen Region unbegrenzt), um die Lunge von der Außenluft zu trennen. </li><li> Löschen Sie den tmp-Klasse, weil es nicht mehr benötigt wird. </li></ol></li><li> Segment konvexen Bereichen, z. B. der Blase, verwenden Sie den Scribble-Modus. Zunächst erstellen Sie eine Klasse &quot;Blase&quot;. <ol><li> Drücken Sie F1, um alle Kritzeleien zu löschen. </li><li> Unter Verwendung der Computer-Maus, ziehen Kritzeleien, die Grenzen der Blase abzugrenzen. </li><li> Drücken Sie F3, um die Region von den Kritzeleien mit einer temporären Maske, die als rot-Overlay erscheint eingeschlossen zu füllen. Iterativ hinzufügen mehr Kritzeleien (in jeder Schneidorientierung) und drücken Sie F3, bis eine ausreichende Genauigkeit erreicht. Typischerweise sind Skizzen in 10 Scheiben ausreichend. </li><li> Drücken Sie F4, um die temporäre Maske als &quot;Blase&quot; zu speichern. </li><li> Gehen Sie wie folgt zu segmentierenanderen konvexen Bereichen wie dem Herzen und Nieren. In vielen Regionen, z. B. der Magen oder die Leber, die durch wenige konvexe Bereiche angenähert werden. </li></ol></li><li> Um Segment der Wirbelsäule, zunächst ein &quot;Bone&quot; Klasse. <ol><li> Wählen ContextMenu-&gt; Thresholding-&gt; oben, um eine Schwellenwertoperation durchzuführen, um alle hellen Voxel zu klassifizieren (z. B. über 1600) als &quot;Knochen&quot;. </li><li> Eine Region Füllvorgang würde Segment versagen die Wirbelsäule, weil sie mit vielen anderen Teilen des Gerüsts, z. B. den Rippen verbunden ist. Führen Sie ein paar Schneidvorgänge durch iteratives Zeichnung Kritzeleien und F2 drücken, um die Wirbelsäule aus dem Schädel, den Rippen und dem Kreuzbein zu trennen. </li><li> Schließlich erstellen Sie eine Klasse &quot;Spine&quot; und führen Sie eine Region Füllvorgang, um die Wirbelsäule zu erhalten (Rechtsklick in die Wirbelsäule und wählen ContextMenu-&gt; Füllen Region-&gt; Füllen Region unbegrenzt). </li></ol></li><li> Speichern Sie die Segmentierung als eine Datei in the Unterordner des μCT-FMT-Scan. Verwenden Sie eine konsistente Namen, zB organs.seg, um die Stapelverarbeitung zu ermöglichen. </li><li> Wählen Sie Menü-&gt; Statistik-&gt; Klasse Statistiken (Overlay), eine Tabellenkalkulation, die die mittlere Fluoreszenzintensität, die Lautstärke und den Gesamtbetrag (Produkt der mittleren und Volumen) für jede Klasse enthält generieren. </li><li> Um eine einzelne Tabellenkalkulation, die die Werte für alle Regionen aller μCT-FMT-Scans erzeugen, klicken Sie auf Menü-&gt; Batch-&gt; Set Stapeleinstellungen und klicken Sie dann auf Menü-&gt; Batch-&gt; Batch-Statistiken. Dies vermeidet den Aufwand für die Erstellung und Zusammenführen von vielen Tabellenkalkulationsdateien, dh, eine für jede μCT-FMT-Scan. </li></ol> 8. Sondenkalibrierung <ol><li> Um den Kalibrierungsfaktor für eine Sonde zu berechnen, mehrere μCT-FMT Phantom Scans mit verschiedenen bekannten Mengen der Sonde erforderlich sind (siehe Schritt 1.4), z. B. mit 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol und 0 pmol. </li><li> Scannen Sie die Phantome, wie beschriebenAbschnitte 4 und 5. Auch für Phantom-Scans, nach oben und unten in der FMT-Scans erforderlich. </li><li> Exportieren Sie die Daten und führen Fusion und Rekonstruktion, wie in Kapitel 6 beschrieben. </li><li> Segment die Aufnahme mit Hilfe der μCT Daten für jeden Scan durch Schwellen (über 1.200) und Region Füllung. </li><li> Erzeugen Sie eine Tabelle mit den gemessenen Fluoreszenzwerte und zeichnen sie als Funktion der bekannten Mengen. Berechnen der Steigung einer linearen Regressionsanpassung. Dies ist der Kalibrierfaktor für die Sonde. </li></ol>

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M., Rasmussen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+with+optics:+primer+and+case+for+near-infrared+fluorescence+techniques+in+personalized+medicine.">Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine.</a> Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).</li></ol>

Felix Gremse ist Gründer und Inhaber der Gremse-IT, einem Startup-Unternehmen, das Software und Services bietet für die medizinische Bildanalyse in Zusammenarbeit mit Philips und der Abteilung für Experimentelle Molekulare Bildgebung der RWTH Aachen.

Wir beschreiben und anzuwenden ein Protokoll für die multimodale μCT-FMT-Bildgebung. Wir verwenden im Handel erhältlich und weit verbreitet FMT und μCT Geräte 3,11,15 - 17,21. Während sich das Protokoll erfordert eine spezifische FMT, kann das von einem anderen μCT μCT mit ähnlicher Funktionalität und vergleichbare Scanparameter, zB ersetzt werden kann, sollte das Sichtfeld groß genug ist, um die Maus Bett einschließlich der Markierungen bedecken. Das FMT für Bioverteilung Analyse ohne die Kombination mit μCT oder MRI-21 verwendet wurde, jedoch ist die anatomischen Daten von Vorteil, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, weil die Segmentierung auf der Organgrenzen, die in den μCT Daten 10 sichtbar sind basieren. Während integrierten μCT-FMT-Geräte wurden entwickelt, 2,7, sind diese nicht im Handel erhältlich. Weiterhin ist die Verwendung von zwei getrennten Geräten ermöglicht Rohrleitungen, das heißt., Die nächste Maus can im μCT abgebildet werden, während die erste Maus noch in der FMT, um den Durchsatz zu erhöhen. Um den manuellen Arbeitsaufwand zu reduzieren, führen wir automatisierte Marker Erkennung und Fusion. Weiterhin wird die Mausform automatisch segmentiert und diese Information der Fluoreszenz Rekonstruktion 11,13,22 signifikant verbessert. Für die quantitative Fluoreszenz Rekonstruktion sind Absorptions- und Streupläne benötigt 13,23. Wir leiten die Streu Karte automatisierte Segmentierung der μCT Daten und Zuweisen bekannten Streukoeffizienten von mehreren Gewebetypen (Lunge, Knochen, Haut, Fett und übrigen Weichteile) 24. Anschließend rekonstruieren wir ein Absorptions Karte von der optischen Rohdaten, die besonders wichtig für die gut durchbluteten Organen wie dem Herzen und der Leber 13,20 ist. Abtasten mehrerer Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten führt schnell zu einer großen Anzahl von Datensätzen zu analysieren. Für BiodisVerteilung Studien müssen mehrere Organe für jede μCT-FMT-Scan segmentiert werden. Leider kann die Segmentierungen nicht wiederverwendet werden, weil die Maus neu in den Maus Bett wiederholt positioniert. Wir benutzen ein Werkzeug für interaktive Segmentierung, an unserem Institut entwickelt wurde, aber auch andere Werkzeuge können auch entsprechende 25 sein. Wir generieren voxelweise Segmentierungen, da diese besser zu komplexen Organen als einfache Formen wie Ellipsen und Würfel 26 entsprechen. Automatisierte Ganztier Segmentierung wäre sinnvoll, um den manuellen Arbeitsaufwand 27 weiter zu reduzieren, aber eine interaktive Segmentierung Werkzeug immer noch erforderlich, um für die Segmentierung Fehler zu korrigieren. Darüber hinaus können automatische Segmentierung Werkzeuge kaum rechnen Sonderfälle wie Pathologien richtig. Da wir nativen μCT Scans einige Organe wie Milz sind sehr schwierig zu segmentieren, auch manuell. Kontrastmittel würde helfen, aber es gibt Probleme mit der Verträglichkeit, und es ist schwierig, der Wartung desna stetigen Kontrastmittelverteilung über die gesamte Längs Bildgebung. Unsere Phantomstudie zeigt, dass die Signallokalisierung wird bei der Verwendung der Forminformation für Fluoreszenz Rekonstruktion verbessert. In vivo wird eine ähnliche Verbesserung offensichtlich für den frühen Zeitpunkt (15 min nach der Injektion), wenn eine große Menge der Probe ist bereits in der Harnblase. Die Hydroxyapatit-bindende Sonde sammelt sich an Knochen und Gelenken. Es ist bemerkenswert, wie schnell dies geschieht, das heißt, das Signal bereits in der Wirbelsäule 15 Minuten nach der Injektion deutlich sichtbar. Dies ist wahrscheinlich durch die geringe Molekulargewicht der Sonde, die schnelle Extravasation und Diffusion zu den Zielregionen ermöglicht verursacht. Die Sonde bindet kovalent an seine Ziel Hydroxyapatit und die ungebundene Sonde ausgeschieden. Für die späteren Zeitpunkten zwischen 6 h und 24 h nach der Injektion bleibt die Signalintensität in der Wirbelsäule relativ stabil ist, wahrscheinlich, weil kaum Licht reschmerzt tief in die Maus, um die Fluoreszenz zu bleichen. Für unsere Studie haben wir die 750 nm-Kanal, der in geringen Hintergrundfluoreszenz so offensichtlich für die vor der Injektion erworbenen Scans führt. Bei niedrigeren Wellenlängen, mehr Hintergrundsignal zu erwarten 28 werden. Zusammengefasst beschreiben wir ein multimodales Bildgebungsprotokoll für handelsübliche FMT und μCT Geräte. Wir zeigen, dass die Kombination bietet Vorteile für die Fluoreszenz-Rekonstruktion. Wir veranschaulichen, wie die Bioverteilung Kurven aus der großen Menge von Bilddaten mit Hilfe von interaktiven Organsegmentierung und Stapelverarbeitung extrahiert. Wir glauben, dass diese standardisierten Workflow kann hilfreich für die Arzneimittelentwicklung und anderen bildgebenden Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten Sonden sein.

Fluoreszenz-vermittelte Tomographie, auch als Fluoreszenzmolekular Tomographie (FMT), ist eine vielversprechende Technik für die quantitative Erfassung der Fluoreszenzverteilung in diffuse Geweben, wie narkotisierten Mäusen oder menschlichen Körpergeweben, beispielsweise, Brust oder Fingergelenke. Im Gegensatz zu nicht-invasiven Mikroskopietechniken, die Abbildung von oberflächlichen Ziele auf subzellulärer Auflösung 1 zu ermöglichen, erlaubt FMT dreidimensionale Rekonstruktion von Fluoreszenzquellen in Tiefen von mehreren Zentimetern, wenn auch in geringerer Auflösung 2. Viele gezielte Fluoreszenzsonden zur Verfügung, um Bild die Angiogenese, Apoptose, Entzündungen und andere 2-5. Einige Sonden sind aktivierbar, z. B. durch spezifische Enzymspaltung führt zu unquenching von Fluorochromen. Darüber hinaus können Reportergene exprimieren, fluoreszierende Proteine ​​abgebildet werden, beispielsweise auf Tumorzellmigration 6 verfolgen. FMT stark profitiert von der Kombination mit einer anatomischen Modalität zB μCT 2,7 oder MRT 8. Während Stand-alone-FMT-Geräte sind im Handel erhältlich 9 sind die Fluoreszenzbilder schwierig, ohne anatomische Referenzinformationen zu interpretieren. Kürzlich konnten wir zeigen, dass die fusionierten anatomischen Bilddaten ermöglicht eine robustere Analyse 10. Die anatomischen Daten können auch verwendet werden, wie die äußere Form der Maus, die für genaues optisches Modellieren und Fluoreszenzrekonstruktions 11 Vorwissen, bereitzustellen. Darüber hinaus können optische Streuung und Absorption Karten mit Segmentierung der Gewebearten geschätzt werden kann und durch die Zuordnung klassenspezifischen Koeffizienten 12,13. Für Nahinfrarotlicht ist Hämoglobin Hauptabsorber bei Mäusen neben Melanin und Pelz 14. Da die relative Blutvolumen variiert regional um Größenordnungen, ist ein Absorptions Karte besonders wichtig für die quantitative Fluoreszenz Rekonstruktion 13. Ein Vorteil der Verwendung nicht-invasiver Abbildungsvorrichtungen ist, dass die Mäuse in Längsrichtung abgebildet werden, das heißt, zu mehreren Zeitpunkten. Dies ist wichtig, um das dynamische Verhalten von Sonden, also ihre Ziel Akkumulation, Bioverteilung und Ausscheidung 10,15 beurteilen, um die Progression der Erkrankung 16 beurteilen. Beim Abbilden mehrerer Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten wird eine große Menge von Bilddatensätzen entsteht. Um die Vergleichbarkeit zu ermöglichen, sollten diese in systematischer Weise, also erfasst, mit einer gut definierten und dokumentierten Protokoll. Die große Anzahl von Scans stellt eine Herausforderung für die Bildanalyse, die erforderlich ist, um quantitative Messungen von den Bilddaten zu extrahieren. Das Ziel unserer Studie ist eine detaillierte Beschreibung eines μCT-FMT Bildgebungsprotokoll, das wir verwendet und optimiert über mehrere Studien 10,13,15,17,18 bereitzustellen. Wir beschreibenwie die Datensätze erzeugt werden, verarbeitet, visualisiert und ausgewertet. Dies zeigt sich unter Verwendung eines etablierten molekularen Sonde, OsteoSense, das bindet an Hydroxyapatit 19, und kann zu Bildknochenerkrankungen verwendet werden und Umbau 2. Alle Verfahren, die Tiere wurden von der staatlichen Prüfungsausschuss für Tierpflege genehmigt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>FMT2000</td>
			<td>Device for fluorescence molecular tomography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;CT (micro computed tomography) Tomoscope Duo</td>
			<td>CT Imaging GmbH</td>
			<td>Tomoscope Duo</td>
			<td>Device for micro computed tomography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimodal Mouse Bed</td>
			<td>CT Imaging GmbH</td>
			<td>Experimental builder</td>
			<td>Partially transparent animal holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (isoflurane, USP)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>Isoflurane Inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia system</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>726419</td>
			<td>Complete Isoflurane Table-Top System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorophyll-free mouse food</td>
			<td>Ssniff</td>
			<td>E15051</td>
			<td>low chlorophyll / low fluorescence food</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 750EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10053EX</td>
			<td>Animal FMT contrast agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex Fine Bore Polythene Tubing</td>
			<td>Smith medical</td>
			<td>800/100/120</td>
			<td>Tube for injection catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican 30g</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>4656300</td>
			<td>Hypodermic needle for catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imeron</td>
			<td>Altana pharma</td>
			<td>INLA F.1/0203/3.5337.69</td>
			<td>CT contrast agent for the phantom inclusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>90-12-36-6</td>
			<td>Agarose for phantom production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1900,1000</td>
			<td>Titanium oxyde as phantom scattering agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>93595</td>
			<td>Trypan blue to adjust phantom light propagation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy7</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>15020</td>
			<td>Fluorochrome for the phantom inclusions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipovenoes 20%</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>3094740</td>
			<td>Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Definiens Developer XD Server</td>
			<td>Definiens AG</td>
			<td>Server XD</td>
			<td>Software platform for automated segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalytics Preclinical</td>
			<td>ExMI/Gremse-IT</td>
			<td>Version 2.0.1</td>
			<td>Software for image fusion, reconstruction and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVIDIA Geforce Titan</td>
			<td>Asus</td>
			<td>GTXTITAN6GD5</td>
			<td>High end computer graphics card, 6GB Memory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hybrid &#181;ct-fmt imaging and image analysis

Fluoreszenz-vermittelte Tomographie (FMT) ermöglicht Längs- und quantitative Bestimmung der Fluoreszenzverteilung in vivo und kann verwendet werden, um die Bioverteilung von neuartigen Sonden zu bewerten und um den Krankheitsverlauf zu bewerten unter Verwendung etablierter Molekularsonden oder Reportergene werden. Die Kombination mit einer anatomischen Modalität, wie beispielsweise Mikro Computertomographie (μCT), ist vorteilhaft für die Bildanalyse und Fluoreszenz-Rekonstruktion. Wir beschreiben ein Protokoll für die multimodale μCT-FMT-Bildgebung einschließlich der Bildverarbeitungsschritte erforderlich sind, um quantitative Messungen zu extrahieren. Nach der Herstellung der Mäuse und der Durchführung der Bildgebung werden die multimodalen Datensätze registriert. Anschließend wird eine verbesserte Fluoreszenz Rekonstruktion durchgeführt, was die Berücksichtigung der Form der Maus. Für die quantitative Analyse sind Organ Segmentierungen generiert basierend auf den anatomischen Daten mit Hilfe unserer interaktiven Segmentierung Werkzeug. Schließlich wird die Bioverteilung cuRVE werden unter Verwendung eines Batch-Verarbeitungsmerkmal generiert. Wir zeigen die Anwendbarkeit des Verfahrens durch die Beurteilung der Bioverteilung von einer bekannten Sonde, die an Knochen und Gelenken bindet.

Wir wendeten die beschriebenen Protokoll, um die Bioverteilung einer gezielten Sonde OsteoSense, die Hydroxyapatit bindet bewerten. 3 Mäusen (C57BL / 6 ApoE - / - Ahsg - / - Doppel-Knockout-Mäuse, 10 Wochen alt) wurden abgebildet, bevor und 15 min, 2 h, 4 h, 6 h und 24 h nach iv Injektion von 2 nmol OsteoSense. Unsere Software erfasst automatisch die Marker in den Maus multimodalen Bett aufgebaut (Figur 1, Figur 2A, B), die Fusion der anatomischen μCT Daten mit dem Fluoreszenz Rekonstruktion vom FMT (2C, D) durchgeführt wird aktiviert. Da OsteoSense ist eine Sonde mit einem niedrigen Molekulargewicht, eine schnelle renale Ausscheidung und damit hohe Signal in der Harnblase wird erwartet. Schmelzen des Fluoreszenz Rekonstruktion des FMT wurden Probleme wie verlegt Signal außerhalb der Blase (2C, D). Diese Probleme treten auf, weil die FMT nicht die wahre Form der Maus wissen und nimmt eine Blockform. Our Rekonstruktion bestimmt die genaue Form der μCT Daten und erzeugt Streuung und Absorption Landkarten 13, um eine genauere Rekonstruktion Fluoreszenz mit besserer Signallokalisierung, was sich besonders für die Blase (2E, F) ist, zu ermöglichen. Um das rekonstruierte Fluoreszenz geeignete Regionen zuzuordnen, wir interaktiv segmentiert mehrere Organe mit unserer Software (Abbildung 3). Für jede der 18 Abtastungen wurden 7 Bereiche eingeteilt, basierend auf den μCT Daten, dh., Herz, Lunge, Leber, Nieren, der Wirbelsäule, des Darms und der Blase. Anschließend wurde die Software verwendet, um die mittlere Fluoreszenz-Konzentration für jede der 126 Bereiche zu berechnen. Glücklicherweise bietet die Software eine Batch-Modus, der alle Werte berechnet und speichert sie in einer einzigen Tabelle. Um die Fluoreszenzverteilung zu visualisieren, wurden 3D-Renderings für jeden Zeitpunkt erzeugt werden,mit vergleichbaren Fenstereinstellung (4A-F). Mit den quantifizierten Organwerte wurde die Bioverteilung durch Mittelung der Organwerte über den drei Mäusen (4G) berechnet. Die Pre-Scans, vor der Injektion erworbenen zeigte vernachlässigbare Hintergrundsignal. 15 Minuten nach der Injektion erschien das stärkste Signal in der Harnblase, wegen der schnellen renale Ausscheidung. An den darauffolgenden Zeitpunkten, die verbleibende Sonde an Knochen und Gelenken angesammelt hatte. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig1.jpg" /> Abbildung 1. Multimodal Maus Bed. (A) Die multimodale Maus Bett enthält zwei Acrylglasplatten, die eng mit der Maus festhalten. Das Anziehen ist mit zwei Schrauben eingestellt. Die Maus Bett enthält Marker (leer Löcher) für die Bildfusion. Narkosegas wird mit einem flexiblen Schlauch, der mit t fixiert geliefertAffen. (B) Die Maus Bett auf einer Metallhalterung befestigt und in der Mitte der rotierenden Gantry μCT gehalten. (C) Vermeiden Sie eine Lücke zwischen Maus-Bett und der Metallhalter, denn sonst werden die Marker können falsch zugeordnet werden, was zu fehlerhaften Fusion. Das Narkosegasrohr sollte dem Rohrverbinder befestigt werden. (D) Die Maus Bett sollte in der FMT mit dem vorderen ersten um einen korrekten automatischen Schmelz ermöglichen eingefügt werden. (E) Die Marker sichtbar für die FMT-Kamera, die für die automatische Erkennung und Markierung Fusion verwendet wird, sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bildfusion und Wiederaufbau. (A, B) Marker und die äußere Form des mouse werden von dem automatisierten Segmentierungsalgorithmus bestimmt. (C, D) 15 min nach der Injektion von OsteoSense, eine beträchtliche Menge der Sonde wurde bereits in die Harnblase ausgeschieden worden. Nach dem Verschmelzen der Hersteller bereitgestellten Rekonstruktion mit der μCT Daten, werden Probleme sichtbar. Die meisten der Signal erscheint auf der Blase, aber nicht in der Blase und in der Luft einige Signal erscheint einmal. Dies geschieht, weil die FMT nimmt einen blockförmigen Maus. (E, F) Unsere verbesserte Fluoreszenz Rekonstruktion, mit der Form der Maus aus den μCT Daten abgeleitet, führt zu einer besseren Lokalisierung der Fluoreszenz in der Blase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52770/52770fig3.jpg" /> Abbildung 3. Interactive Organ Segmentat. Ion (A) Um die Fluoreszenzverteilung zu quantifizieren, werden mehrere Organe segmentiert: Herz (rot), Lunge (pink), Leber (braun), Magen (beige), der Wirbelsäule (lila), Nieren (gelb), Darm (grün) und Harnblase (Gold). (B) Die Lunge, der im Vergleich mit dem umgebenden Gewebe stark kontrastiert wird, wird mit Schwellenwertbereich und Füllung segmentiert. (C) Round Organe wie die Blase, der Nieren und Herzen werden mit &quot;Skizzen&quot; segmentiert. (D) Orgeln mit komplexer Form, zB Leber und Magen sind segmentierte inkrementell mit Kritzeleien. Um Segment der Wirbelsäule wird eine hohe Schwelle zum Segment alle Knochen aufgebracht. Dann einige Knochen, z. B. die Rippen, weggeschnitten, bis die Wirbelsäule bleibt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52770/52770fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 4: Bioverteilung. Um die Bioverteilung zu beurteilen, werden die Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten (AF) gescannt. (A) Die Pre-Scan, vor der Injektion, zeigt wenig Hintergrundsignal in der 750 nm-Kanal. (B) 15 min nach der Injektion, eine beträchtliche Menge der Sonde schon in der Harnblase. (C) an der 2 h Zeitpunkt wird die Maus uriniert hat, die in einigen Fluoreszenz außerhalb der Maus führt. Zu späteren Zeitpunkten (DF), wird das Signal vorwiegend an den Knochen und Gelenke, dh., Im Rücken und den Knien. (G) Die quantifizierten Fluoreszenzkonzentration wird für ausgewählte Organe gezeigt.

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Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Hybrid μCT-FMT-Bildgebung und Bildanalyse

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

13.1K Aufrufe.  RWTH Aachen University. We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (µCT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Serie: Hybrid  µCT-FMT imaging and image analysis

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at submicrometer resolution. One of the first such instruments producing whole-brain-scale data is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM)7, 5, 9, developed and hosted in the authors' lab. KESM has been used to section and image whole mouse brains at submicrometer resolution, revealing the intricate details of the neuronal networks (Golgi)1, 4, 8, vascular networks (India ink)1, 4, and cell body distribution (Nissl)3. The use of KESM is not restricted to the mouse nor the brain. We have successfully imaged the octopus brain6, mouse lung, and rat brain. We are currently working on whole zebra fish embryos. Data like these can greatly contribute to connectomics research10; to microcirculation and hemodynamic research; and to stereology research by providing an exact ground-truth. 
In this article, we will describe the pipeline, including specimen preparation (fixing, staining, and embedding), KESM configuration and setup, sectioning and imaging with the KESM, image processing, data preparation, and data visualization and analysis. The emphasis will be on specimen preparation and visualization/analysis of obtained KESM data. We expect the detailed protocol presented in this article to help broaden the access to KESM and increase its utilization.

The full process from brain specimen preparation to serial sectioning imaging using the Knife-Edge Scanning Microscope, to data visualization and analysis is described. This technique is currently used to acquire mouse brain data, but it is applicable to other organs, other species.

Probenvorbereitung, Imaging-und Analyse-Protokolle für Knife-edge-Scanning-Mikroskopie

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Forschung

Biotechnik

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting airways, whereas adenocarcinomas are typically more peripheral in location. Lung malignancy detection early in the disease process may be difficult due to several limitations: radiological resolution, bronchoscopic limitations in evaluating tissue underlying the airway mucosa and identifying early pathologic changes, and small sample size and/or incomplete sampling in histology biopsies. High resolution imaging modalities, such as optical frequency domain imaging (OFDI), provide non-destructive, large area 3-dimensional views of tissue microstructure to depths approaching 2 mm in real time (Figure 1)2-6. OFDI has been utilized in a variety of applications, including evaluation of coronary artery atherosclerosis6,7 and esophageal intestinal metaplasia and dysplasia6,8-10.
Bronchoscopic OCT/OFDI has been demonstrated as a safe in vivo imaging tool for evaluating the pulmonary airways11-23 (Animation). OCT has been assessed in pulmonary airways16,23 and parenchyma17,22 of animal models and in vivo human airway14,15. OCT imaging of normal airway has demonstrated visualization of airway layering and alveolar attachments, and evaluation of dysplastic lesions has been found useful in distinguishing grades of dysplasia in the bronchial mucosa11,12,20,21. OFDI imaging of bronchial mucosa has been demonstrated in a short bronchial segment (0.8 cm)18. Additionally, volumetric OFDI spanning multiple airway generations in swine and human pulmonary airways in vivo has been described19. Endobronchial OCT/OFDI is typically performed using thin, flexible catheters, which are compatible with standard bronchoscopic access ports. Additionally, OCT and OFDI needle-based probes have recently been developed, which may be used to image regions of the lung beyond the airway wall or pleural surface17.
While OCT/OFDI has been utilized and demonstrated as feasible for in vivo pulmonary imaging, no studies with precisely matched one-to-one OFDI:histology have been performed. Therefore, specific imaging criteria for various pulmonary pathologies have yet to be developed. Histopathological counterparts obtained in vivo consist of only small biopsy fragments, which are difficult to correlate with large OFDI datasets. Additionally, they do not provide the comprehensive histology needed for registration with large volume OFDI. As a result, specific imaging features of pulmonary pathology cannot be developed in the in vivo setting. Precisely matched, one-to-one OFDI and histology correlation is vital to accurately evaluate features seen in OFDI against histology as a gold standard in order to derive specific image interpretation criteria for pulmonary neoplasms and other pulmonary pathologies. Once specific imaging criteria have been developed and validated ex vivo with matched one-to-one histology, the criteria may then be applied to in vivo imaging studies. Here, we present a method for precise, one to one correlation between high resolution optical imaging and histology in ex vivo lung resection specimens. Throughout this manuscript, we describe the techniques used to match OFDI images to histology. However, this method is not specific to OFDI and can be used to obtain histology-registered images for any optical imaging technique. We performed airway centered OFDI with a specialized custom built bronchoscopic 2.4 French (0.8 mm diameter) catheter. Tissue samples were marked with tissue dye, visible in both OFDI and histology. Careful orientation procedures were used to precisely correlate imaging and histological sampling locations. The techniques outlined in this manuscript were used to conduct the first demonstration of volumetric OFDI with precise correlation to tissue-based diagnosis for evaluating pulmonary pathology24. This straightforward, effective technique may be extended to other tissue types to provide precise imaging to histology correlation needed to determine fine imaging features of both normal and diseased tissues.

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

A method to image ex vivo pulmonary resection specimens with optical frequency domain imaging (OFDI) and obtain precise correlation to histology is described, which is essential to developing specific OFDI interpretation criteria for pulmonary pathology. This method is applicable to other tissue types and imaging techniques to obtain precise imaging to histology correlation for accurate image interpretation and assessment. Imaging criteria established with this technique would then be applicable to image assessment in future in vivo studies.

Optical Frequency Domain Imaging der<em&gt; Ex vivo</em&gt; Pulmonary Resektionsproben: Beziehen One to One Image to Histopathologie Correlation

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of spectroscopy techniques. Combining imaging and spectroscopy techniques into a single optical probe may provide a more complete analysis of tissue health. In this article, two dissimilar modalities are combined, high-resolution fluorescence microendoscopy imaging and diffuse reflectance spectroscopy, into a single optical probe. High-resolution fluorescence microendoscopy imaging is a technique used to visualize apical tissue micro-architecture and, although mostly a qualitative technique, has demonstrated effective real-time differentiation between neoplastic and non-neoplastic tissue. Diffuse reflectance spectroscopy is a technique which can extract tissue physiological parameters including local hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This article describes the specifications required to construct the fiber-optic probe, how to build the instrumentation, and then demonstrates the technique on in vivo human skin. This work revealed that tissue micro-architecture, specifically apical skin keratinocytes, can be co-registered with its associated physiological parameters. The instrumentation and fiber-bundle probe presented here can be optimized as either a handheld or endoscopically-compatible device for use in a variety of organ systems. Additional clinical research is needed to test the viability of this technique for different epithelial disease states.

Multimodal Imaging and Spectroscopy Fiber-bundle Microendoscopy Platform for Non-invasive, In Vivo Tissue Analysis

The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.

Multimodale Bildgebung und Spektroskopie Faserbündelmikroendoskopie Plattform für Nicht-invasive,<em&gt; In Vivo</em&gt; Gewebeanalyse

Recent fiber-bundle microendoscopy techniques enable non-invasive analysis of in vivo tissue using either imaging techniques or a combination of ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient's cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Magnetic Levitation Gekoppelt mit tragbaren Imaging und Analyse für Krankheitsdiagnostik

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

Bildgestützte, laserbasierte Herstellung von Mikrofluidik-Networks-Vascular abgeleitet

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for electrical conduction between cardiomyocytes. The current method for quantifying this space by manual segmentation is slow and has low spatial resolution.We developed an algorithm that uses serial image dilations of a binary outline to count the number of pixels between two opposing 2 dimensional edges.This algorithm requires fewer man hours and has a higher spatial resolution than the manual method while preserving the reproducibility of the manual process.In fact, experienced and novice investigators were able to recapitulate the results of a previous study with this new algorithm.The algorithm is limited by the human input needed to manually outline the perinexus and computational power mainly encumbered by a pre-existing pathfinding algorithm.However, the algorithm&#39;s high-throughput capabilities, high spatial resolution and reproducibility make it a versatile and robust measurement tool for use across a variety of applications requiring the measurement of the distance between any 2-dimensional (2D) edges.

The purpose of this algorithm is to continuously measure the distance between two 2-dimensional edges using serial image dilations and pathfinding. This algorithm can be applied to a variety of fields such as cardiac structural biology, vascular biology, and civil engineering.

Quantifizierung der Intermembran Strecken mit seriellen Bild Dilatationen

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental technique and image analysis protocol presented here can also be applied for imaging microscopic bubbles in other fields of research; therefore, it has a wide range of applications. We apply this to image cavitation around dental ultrasonic scalers. It is important to image cavitation to characterize it and to understand how it can be exploited for various applications. Cavitation occurring around dental ultrasonic scalers can be used as a novel method of dental plaque removal, which would be more effective and cause less damage than current periodontal therapy techniques. We present a method for imaging the cavitation bubble clouds occurring around dental ultrasonic scaler tips using a high-speed camera and a zoom lens. We also calculate the area of cavitation using machine learning image analysis. Open source software is used for image analysis. The image analysis presented is easy to replicate, does not require programming experience, and can be modified easily to suit the application of the user.

Cavitation microbubbles are imaged using a high-speed camera attached to a zoom lens. The experimental setup is explained, and image analysis is used to calculate the area of the cavitation. Image analysis is done using ImageJ.

Bildgebung und Quantifizierung des Bereichs der schnelllebigen Mikroblasen mit einer Hochgeschwindigkeitskamera und Bildanalyse

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...