This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.

Singapur Ulusal Üniversitesi hayvan kullanımı ve (Protokol numarası 084/12) kullanımına ilişkin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uyulması tüm hayvan çalışmaları. 1. İn Vitro MB49-PSA Hücreleri Büyüyen ve PSA salgılanmasına Ölçme <ol><li> Bakım tamamlandı Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş (DMEM), 2 mmol / L L-glutamin, mesane kanseri hücreleri MB49-PSA 15, murin ve bir kuluçka makinesi içinde 0.05 mg / ml Penisilin-Streptomisin 37 ° C&#39;de ° C ve% 5 CO2. 200 ug / ml Higromisin B, PSA salgılayan hücrelerin seçimi basıncını korumak için ekleyin. </li><li> PSA salgısını, plaka 6 oyuklu bir kültür plakasına 1 x 10 6 hücre tespit etmek ve 48 saat boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C&#39;de inkübe etmek. </li><li> İki gün sonra, PSA ölçümleri için supernatant toplamak. <ol><li> Pasteur pipeti kullanarak, sup aktarmak15 ml bir santrifüj tüpüne ernatant. </li><li> yüzen hücreleri ve enkaz kaldırmak için 250 xg&#39;de 5 dakika santrifüj. 1.5 mL bir mikrosantrfuj tübünde 30 ° C - PSA deney farklı bir günde gerçekleştirilir ise, süpernatan saklayın. Değilse, hemen bir sonraki adıma geçin. </li><li> Insan-serbest PSA ELISA kiti 7 kullanarak PSA konsantrasyonunu belirleyin. </li></ol></li><li> kaplama hücreleri numaralandırmak. <ol><li> Pasteur pipeti kullanarak, yavaşça DMEM 1 mL yıkama hücreleri. Aspire ve tamamen ortamı çıkarın. </li><li> taze medya 1 ml ekleyin ve iyice hücreleri çıkarmak için bir hücre kazıyıcı ile hafifçe kazıyın. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüp hücreleri aktarmak ve bir tek hücre süspansiyonu sağlamak için iyice yeniden askıya. </li><li> Hücre süspansiyonu ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi eşit hacimlerde karıştırın. hemasitometre kullanarak (boya kadar yapmayız) canlı hücreleri saymak. </li></ol></li><li> ng olarak PSA ifadesini hesaplamakPSA / ml ortam / 10 6 hücre. 120 ng / ml / 10 6 hücre - farelerde implantasyon için MB49-PSA hücrelerinin PSA ifadesi 80&#39;dir. </li></ol> 2. ELISA ve Real-time PCR analizi ile PSA Ölçümleri Hassasiyet belirlenmesi <ol><li> Oyuk başına 1 x 10 6 hücre (yani, 10 0, 10 1, 10 2, 10 maksimum olduğu şekilde ebeveyn MB49 hücrelerin farklı miktarları ile 6 oyuklu bir kültür plakasına tam DMEM ortamında plaka MB49-PSA hücreleri 3, 10 4, 10 5, veya 10 6 MB49-PSA hücreleri) 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, ya da 10 0 MB49 hücreleri, sırasıyla 10, 6 kültürlenir. </li><li> aşama 1.3 &#39;de tarif edildiği gibi, bir gün sonra, PSA ölçümleri için supernatant toplamak. Insan-serbest PSA ELISA kiti 7 kullanarak PSA konsantrasyonunu belirleyin. </li><li> hücrelerinden RNA ekstrakte edin. <ol><li> LyseRNA ekstraksiyonu, reaktif 1 mL eklenerek doğrudan plaka hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe bir mikrosantrifüj tüpüne hücre lizat aktarın. kloroform 0,2 ml ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde numuneler girdap. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri. Dikkatlice interfaz bozmadan yeni bir tüp üst akıcı faz (0.5 mi) aktarın. </li><li> izopropil alkol, 0.5 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri. tüpün alt RNA çökelti bozmadan, tamamen süpernatantı. </li><li> % 75 etanol içinde bir kez 1 mL pelet yıkayın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 7500 x g&#39;de santrifüjleyin. Tüm etanol çıkarın ve 10 dakika için havayla kurumaya pelet sağlar. </li><li> nükleaz içermeyen su 30 uL RNA çözülür. bu nedenle geliştirmek için 60 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübelubility. </li><li> 260 nm&#39;de (A260) ultraviyole (UV) spektroskopisi kullanılarak absorbans ölçülerek RNA miktarını belirler. RNA saflık değerlendirmek için, 280 nm (A280) absorbans ölçmek ve 1.6 üzerinde olmalıdır A260 / A280 oranı hesaplanır. </li></ol></li><li> RNA 2 ug cDNA Ters yazıya. <ol><li> buz üzerinde reaksiyon karışımı hazırlayın ve 0.2 ml tüpler aktarmak. </li><li> Kısaca içeriğini aşağı doğru döndürün ve hava kabarcıklarını yok etmek için tüpler santrifüj. </li><li> aşağıdaki şartlarda termal döngü tüpleri yükleyin ve ters transkripsiyon yerine 95 ° C de 5 dakika süre ile 37 ° C&#39;de 60 dak. çalışma tamamlandığında, 4 ° C&#39;de cDNA örnekleri tutmak. </li><li> Uzun süreli depolama için 30 ° C - Örnekleri saklayın. </li></ol></li><li> PSA ve sitoplazmik P aktin için gerçek zamanlı PCR analizi gerçekleştirmek. Beta aktin örnekleri normalize etmek için kullanılır. 96 oyuklu bir pla ters transkribe RNA 100 ng ile tahlil gerçekleştirmete. üç kez tüm örnekleri deneyi. aşağıdaki parametrelerle 40 döngü yapın: 2 dk 50 ° C, 95 ° C de 10 dakika da, denatürasyon için 95 ° C &#39;de 15 saniye ve 60 ° C&#39;de 1 dakika. Bir döngü eşik 35 (BT) de algılama en düşük sınırını ayarlayın; böylece, 35 ötesinde bir CT değeri ile herhangi bir örnek algılanamaz olarak kabul edilir. </li></ol> 3. MB49-PSA Hücre Hattı tümörigenikliğini bakımı Not: in vitro uzun süreli büyüme tümöre neden olması arasında bir kaybına yol açar. tümörigenisite korumak için, MB49-PSA hücre hattı 2 yılda en az bir kez fare ile pasajlanır edilir. <ol><li> Hücreler. <ol><li> Hasat katlanarak steril bir hücre kazıyıcı ile onları hafifçe kazıyarak hücreleri büyüyor. Hücre süspansiyonu ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi eşit hacimlerde karıştırın. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayımı. Hücrelerin% 20&#39;den fazla ölü olup olmadığını implante etmeyin. </li><li> (1 x 10 gerekli canlı hücre miktarını hesaplayın7 hücre / ml) ve 15 ml bir santrifüj tüpüne transfer edin. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant atılır. DMEM boş medya hücre pelletini yeniden askıya. implantasyon öncesi FBS tüm izlerini silmek için yıkama üç kez tekrarlayın. </li><li> Fareler implantasyon için hazır olana kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li></ol></li><li> subkutan dorsal kanadında farelerde tümör hücrelerini implant. <ol><li> Vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL periton içine enjekte edilen bir anestezik ketamin karışımını medetomidini (75 mg / kg ve 1 mg / kg, sırası ile) ile 4 ila 6 haftalık C57BL6 / J fareleri, anestezisi. </li><li> Cildi ortaya çıkarmak için sağ kanadına tıraş. </li><li> Forseps bir çift kullanarak, subkutan 24 G iğne ile altta yatan kas ayırın ve hücre süspansiyonu (1 x 10 6 hücre) 0.1 mL enjekte cilt kaldırın. iğne çıkartılırken, tümör hücreleri yapmak, böylece 5 ila 10 saniye boyunca enjeksiyon bölgesini tutamenjeksiyon yerinde dışarı sızmasını. </li><li> Vücut ağırlığı 10 g 0.1 mL atipamezol (1 mg / kg) deri altından enjeksiyonu ile fare canlandırmak. </li></ol></li><li> kaliperler kullanarak tümör çapının ölçülmesiyle her iki günde bir tümör büyümesini izleyin. Tümör hacmi, &quot;a&quot; mm, hem en büyük boyutu ve &quot;B&quot; dik genişliği olduğu formül V = (AB 2) / 2, kullanılarak hesaplanır. </li><li> Tümör hacmi en az 50 mm 3 (yaklaşık 7 gün) olduğunda, CO 2 ile fare euthanize. DMEM bir aseptik koşullarda steril forseps ve makas çifti ve yeri ile tümör kitlesi tüketim. </li><li> 6-çukurlu bir kültür plakasına steril neşter kullanılarak küçük parçalar halinde tümör kıyma. ayrıca tümörü parçalara ayırma için &quot;havan&quot; olarak 1 ml şırınga pistonu kullanın. </li><li> Tam DMEM 3 ml ilave edilir ve muhafaza hücreleri bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2. </li><li> Hücreler plat uymak keze (bir iki gün arasında), steril bir Pasteur pipeti ile yavaşça aspire ortamı, enkaz ve yapışmayan hücreler çıkarıldı. DMEM ile iki kez yıkanır. Hücreleri rahatsız özen gösterin. </li><li> DMEM 1 ml ekleyin ve bir hücre kazıyıcı ile onları kazıma hücreleri hasat. 96 oyuklu bir kültür plakasına oyuk başına bir hemasitometre ve plaka 1 hücre kullanarak hücreleri sayın seçmek ve tek koloniler genişletmek için. Kültür, 37 ° C&#39;de 200 ug / ml Higromisin B DMEM hücre ve% 5 CO2. </li><li> ortamı değiştirmek ve her 4 antibiyotik - 5 gün. Onlar yaklaşık% 80-90 konfluent olana kadar hücreleri izleyin. Yeniden plaka pipetleme ile 24 oyuklu kültür plakası üzerine hücreler, hücreleri çıkarmak için. </li><li> 24 oyuklu bir kültür plakasına hücreler konfluent olduğunda, bir hücre kazıyıcı ile ovalama ile onları çıkarmak ve 6 oyuklu bir kültür plakasına bunları plaka. </li><li> PSA salgılanması için farklı klonları taramak, adım 1&#39;de açıklandığı gibi yüksek PSA ile gizli klonu Cryo-korumakiyon ve gelecekteki fare deneyleri için kullanabilirsiniz. </li></ol> 4. Tümör implante NOT: Her fare mesane 50 uL DMEM boş medya 1 x 10 5 MB49-PSA hücreleri ile implante edilir. Nedeniyle kateter ölü boşluğa, her zaman ekstra hacim (fare başına ilave en az 100 ul) hazırlamak. Alternatif bir yaklaşım, Kasman ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bir hava dolu şırınga kullanmak olacaktır. 5 yerine şırınga daha. <ol><li> Hücreler. <ol><li> Hücreler, yaklaşık% 80 konfluent geçit tam DMEM ortamında MB49-PSA, tümör hücreleri Bir gün implantasyondan önce, (% 10 FBS, 2 mmol / L L-glutamin, 0.05 mg ile takviye / ml Penisilin-Streptomisin ve 200 1 &#39;lik bir ayırma oranı ile 37 ° C&#39; de ug / ml Higromisin B) ve% 5 CO2: 2&#39;dir. </li><li> Prosedürün gününde, steril bir hücre kazıyıcı ile onları hafifçe kazıyarak hücreler hasat. Hücre süspansiyonu, eşit hacimleri birleştirilir ve% 0.4 tripan mavi çözelti. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayımı. Hücrelerin% 20&#39;den fazla ölü olup olmadığını implante etmeyin. </li><li> (2 x 10 6 hücre / ml) gerekli olan canlı hücre miktarını hesaplayın ve bir 15 mL santrifüj tüpüne transfer edin. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj ve süpernatant atılır. DMEM boş medya hücre pelletini yeniden askıya. implantasyon öncesi FBS tüm izlerini silmek için yıkama üç kez tekrarlayın. </li><li> Fareler implantasyon için hazır olana kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun. </li></ol></li><li> 4- ila 6-haftalık dişi C57BL / 6J fareleri işlem öncesi bir hafta süreyle ortama alışmaları için izin verin. Tüm hayvan çalışmaları steril koşulları sağlamak için bir biyolojik güvenlik kabini yapılmalıdır. <ol><li> Her bir fare tartın ve vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL intraperitoneal anestezi (75 mg / kg ketamin ve 1 mg / kg medetomidini) enjekte edilir. Canlı ağırlıkları 17 ve 22 g arasında olmalıdır. Hiçbir RESPO gözlemleyerek anesthetization onaylayınnse bir ayak tutam sonra. </li><li> tanımlama, bir kulak yumruk kullanarak kulak işaretleyin. </li><li> Hidrasyon için 2 saat - vücut ağırlığı 10 g, her 1 için 0.1 mL periton içine Hartmann&#39;ın çözeltisi ya da bileşik, sodyum laktat enjekte edilir. </li><li> Yanıp sönen refleks anestezi altında kayıp ve gözleri kurumasına olduğundan, steril pamuk ampul kullanarak her iki göze steril oftalmik merhem sürün. gerektiğinde yeniden uygulayın. </li><li> vücut ısısını korumak için (havayla temas ile aktive) bir ısı paketi üzerinde kağıt havlu üzerine yatar pozisyonda fareler yatırın ve aşağı arka ayakları bantlayın. </li></ol></li><li> bir parmak ile, alt karın bölgesinde hafif bir basınç uygulanır ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe mesaneden idrarı toplamak. Bu örnek idrar PSA bazal değer olarak hizmet vermektedir. </li><li> 1 ml şırınganın içine steril poli-L-lizin (PLL) çekiniz ve çıkarılmış iğne stile ile, 24 ayar IV kateter takın. kateter ve ins ucuna kadar yağ sürünkateterizasyonu rehberlik forseps kullanarak mesane içine üretra yoluyla kateteri ert. direnç hissedilir zaman durdurun. NOT: Araştırmacılar uygulanan intravezikal için anestezik ve işlem sonrası analjezik kullanımı ile yağlama jel kullanımı için ihtiyacı konusunda kendi veteriner kadrosu ile tartışmak gerekir. </li><li> Veziko-üreteral geri akış 18 önlemek için, 10 ul her 20 saniyede bir oranda yavaş yavaş PLL 50 uL aşılamak. dışarı akışını önlemek için bir tıpa ile 20 dakika için idrar torbasında kateter bırakın. </li><li> 20 dakika sonra, kateter kaldırmak ve nazikçe alt karın bölgesinde basarak herhangi bir içeriğin mesaneyi boşaltmak. Boş 1 ml şırınga kullanarak, kateter dışarı kalan içeriğini yıkayın. </li><li> pipetle iyice MB49-PSA hücreleri karıştırın ve 1 ml şırınga içine çekin. kateter takın ve kayganlaştırıcı uygulayın. 10 uL her 20 saniyede bir düşük hızda 1 x 10 5 hücre 50 uL aşılamak. tıpa DeğiştirKateter. Kontrol farelere tuzlu 50 uL verin. </li><li> 1 saat sonra, sonda ve bir içerik mesane boşaltmak. arka ayakları üzerinde bandını çıkarın ve ventral tarafta fareler yerleştirin. Vücut ağırlığı 10 g 0.1 mL ters ilaç (1 mg / kg atipamezol) enjekte deri altından fareler canlandırmak. </li><li> motilite görülmektedir kadar fareler izleyin. kafeslerine fareler dönün. </li><li> Tümör tespiti protokolü (Bölüm 5, 7 ya da 8), CO2 kullanılarak fareler euthanize tamamlanmasından sonra. Post-mortem tümör tespiti 6. bölümde tarif edilmektedir. </li></ol> ELISA ile 5. İzleme Tümör Büyüme NOT: Tümör varlığı ve büyüme idrar PSA salgısını ölçülerek farelerde izlenir. Araştırmacılar hayvan sağlığı ve refahı sonrası tümör implantasyonu ve insancıl uç noktaları izleme kendi veteriner kadrosu ile danışmalısınız. <ol><li> farelerin idrar toplamak için iki yöntem vardır. <ol><li> dışkı malzemeden idrar ayırmak için tasarlanmış bireysel metabolik kafeste tek bir fare koyarak idrar gecede toplayın. ayar soğutma sahip değilse, bir gece boyunca PSA bozulmasını önlemek için, idrar toplama tüpüne bir proteaz inhibitörü (100 uL) ilave edilir. Bununla birlikte mevcut metabolik kafesler sayısı idrar toplama bu yöntemin kullanımını sınırlar. </li><li> o (örneğin ABSL2 odalarında gibi) metabolik kafesleri kullanmak için lojistik imkansız olduğu durumlarda, aşama 4.2.1 anlatıldığı gibi fareler anestezi ise alt karın bölgesinde nazik baskı için parmağını kullanarak nokta idrar toplamak. Terapi telkin önce bu genellikle yapılır. Bizim deneyim, idrar en az 150 ul anestezi sonrası 1 saat alınabilir. </li></ol></li><li> Hemen buz üzerine toplanan idrar yerleştirin. Hematüri tümör implantasyonu sonrası ikinci haftasından itibaren görülebilir. Son derece hemolize numuneler ELISA analizini etkileyebilir. Bu nedenle, idrarbuz üzerine yerleştirilmiş ve toplandıktan sonra hızlı bir şekilde işlenmesi gerekir. </li><li> hücreler veya artıkları çıkarmak için 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 6,700 x g&#39;de idrar tüpleri santrifüjleyin. </li><li> Yeni tüpler içine idrar idrar fareler arasındaki çıktı, kısım farkı normalleştirmek ve bir deney seti 7 kullanarak bir ELISA kiti 7 kullanarak PSA ve kreatinin analizler gerçekleştirerek kadar -30 ° C&#39;de bunları saklamak için. farenin PSA üretmeyen da, ELISA kullanılarak saptandı spesifik olmayan bağlanma düşük seviyelerde mevcuttur. Numune pozitif kabul edilebilir olması için, bir eşik, normal farelere + 3 standart sapma (SD) 15 daha yüksek değerlerde ayarlanmalıdır. </li></ol> Gerçek zamanlı PCR ile 6. algılama Tümör Varlığı <ol><li> bitiminde, fare karın boşluğuna incelemek ve mesane bulun. mesane tüketim ve cryovial içine yerleştirin. sıvı nitrojen içinde hemen dondurun. </li><li> bir RNA extr dokuların homojenize RNA ekstrakteaksiyon reajanı. </li><li> Bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi, PSA ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı PCR analizi gerçekleştirmek. </li></ol> Floresans Görüntüleme 7. İzleme Tümör Büyüme <ol><li> Yakın-kızılötesi floresan boya 19 1 x 10 7 MB49-PSA hücreleri etiketleyin. </li><li> Hücreler 20 flow sitometri canlılığı ve floresan korumak if-Re plaka ve gün 4, 7, 11, 14, 18 etiketli hücreleri hasat ve 21 kontrol etmek için. </li><li> bölümünde 4 yukarıda tarif edildiği gibi, farenin mesane etiketli MB49-PSA hücreleri implante. </li><li> her iki günde bir floresan görüntüleme sistemi kullanılarak tümör büyümesini izleyin. </li><li> görüntüleme günde, ağır ve vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL periton içine enjekte edilen bir anestezik ketamin karışımını medetomidini (75 mg / kg ve 1 mg / kg, sırası ile) kullanılarak fareler anestezi. </li><li> Cildi ortaya çıkarmak için karın bölgesini tıraş. </li><li> görüntüleme odasında fareler yerleştirin ve kazanmakgörüntüleme sistemi ile sağlanan yazılımı kullanarak mesanelerin görüntüler. </li><li> Vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL bir ters ilaç (1 mg / kg atipamezol) enjekte deri altından fareler canlandırmak. </li></ol> Yüksek frekanslı ultrason Görüntüleme 8. İzleme Tümör Büyüme <ol><li> bölümünde 4 yukarıda tarif edildiği gibi farelerde implant tümörler. </li><li> Her iki gün, ultrason görüntüleme kullanılarak tümör büyümesini izlemek. </li><li> görüntüleme günde, ağır ve vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL periton içine enjekte edilen bir anestezik ketamin karışımını medetomidini (75 mg / kg ve 1 mg / kg, sırası ile) kullanılarak fareler anestezi. </li><li> Cildi ortaya çıkarmak için karın bölgesini tıraş. </li><li> 24 ayar IV kateter kullanılarak mesane içine steril% 0,9 tuz 100 uL aşılamak. tuzlu mesaneyi gerilmek ve ultrason görüntüleme sırasında görünürlüğünü artırmak olacaktır. </li><li> ultrason platformu üzerinde fare yerleştirin ve l iletken jel uygulayınower karın. </li><li> Cilde el probu indirin ve görüntüleme platformu 21 mesanenin B-mod görüntü kazanır. </li><li> Vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL miktarında deri altından enjekte ters ilaç (1 mg / kg atipamezol) fareler canlandırmak. </li></ol>

<ol>
	<li>Gunther, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+(MB49).">Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49).</a> Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).</li><li>Dobek, G. L., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+model+of+murine+bladder+cancer.">An orthotopic model of murine bladder cancer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Chade, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathological+characterization+of+a+syngeneic+orthotopic+murine+bladder+cancer+model.">Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model.</a> Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).</li><li>Chan, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+orthotopic+bladder+tumor+implantation+in+a+syngeneic+mouse+model.">Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model.</a> J Urol. 182, 2926-2931 (2009).</li><li>Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthotopic+bladder+cancer+model+for+gene+delivery+studies.">An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181 (2013).</li><li>Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CpG+oligonucleotide+therapy+cures+subcutaneous+and+orthotopic+tumors+and+evokes+protective+immunity+in+murine+bladder+cancer.">CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer.</a> J Immunother. 28, 20-27 (2005).</li><li>Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+Microenvironment+Modification+during+Progression+of+Murine+Orthotopic+Bladder+Cancer.">Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer.</a> Clin Dev Immunol. , 865684 (2011).</li><li>Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+for+detecting+and+treatment+monitoring+of+orthotopic+murine+bladder+tumor+implants.">Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants.</a> J Urol. 145, 1297-1301 (1991).</li><li>Kikuchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitative+analysis+of+early+stage+orthotopic+murine+bladder+tumor+using+in+vivo+magnetic+resonance+imaging.">Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging.</a> J Urol. 170, 1375-1378 (2003).</li><li>Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotechnology+and+cancer:+improving+real-time+monitoring+and+staging+of+bladder+cancer+with+multimodal+mesoporous+silica+nanoparticles.">Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles.</a> Cancer nanotechnology. 7, 3 (2016).</li><li>Tanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+bladder+cancer+in+an+orthotopic+murine+model+with+green+fluorescence+protein+cytology.">Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology.</a> J Urol. 170, 975-978 (2003).</li><li>Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+to+monitor+bladder+cancer+cell+adhesion+in+vivo:+a+new+approach+to+optimize+a+syngeneic,+orthotopic,+murine+bladder+cancer+model.">Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model.</a> BJU Int. 101, 120-124 (2008).</li><li>Newton, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-interleukin-10R1+monoclonal+antibody+in+combination+with+bacillus+Calmette--Guerin+is+protective+against+bladder+cancer+metastasis+in+a+murine+orthotopic+tumour+model+and+demonstrates+systemic+specific+anti-tumour+immunity.">Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity.</a> Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).</li><li>Patel, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transabdominal+micro-ultrasound+imaging+of+bladder+cancer+in+a+mouse+model:+a+validation+study.">Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study.</a> Urology. 75, 799-804 (2010).</li><li>Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+response+of+orthotopic+bladder+tumors+to+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+therapy+using+the+prostate-specific+antigen+gene+as+a+reporter.">Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter.</a> Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).</li><li>Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+prostate+specific+antigen+to+measure+bladder+tumor+growth+in+a+mouse+orthotopic+model.">Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model.</a> J Urol. 172, 2414-2420 (2004).</li><li>Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+the+reporter+green+fluorescent+protein+under+simulated+tumor+conditions.">Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions.</a> Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).</li><li>Biot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preexisting+BCG-specific+T+cells+improve+intravesical+immunotherapy+for+bladder+cancer.">Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer.</a> Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172 (2012).</li><li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+near-infrared+cell+tracker+reagent+for+multiscopic+in+vivo+imaging+and+quantification+of+leukocyte+immune+responses.">A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses.</a> PLoS One. 2, 1075 (2007).</li><li>Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+CD4+CD25+Foxp3++cells+in+peripheral+blood+in+relation+to+urinary+bladder+cancer+malignancy+indicators+before+and+after+surgical+removal.">Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+Ultrasound+Imaging+of+Mouse+Cervical+Lymph+Nodes.">High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes.</a> J Vis Exp. , e52718 (2015).</li><li>Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonographic+evaluation+of+orthotopic+bladder+tumors+in+mice+treated+with+TNP-470,+an+angiogenic+inhibitor.">Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor.</a> Academic radiology. 8, 121-127 (2001).</li><li>Folin, O., Morris, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+determination+of+creatinine+and+creatine+in+urine.">On the determination of creatinine and creatine in urine.</a> JBC. 17, 469-473 (1914).</li><li>Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+assay+based+on+colloidal+gold+conjugates+with+trypsin.">A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin.</a> Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).</li><li>Shi, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joint+enhancement+strategy+applied+in+ECL+biosensor+based+on+closed+bipolar+electrodes+for+the+detection+of+PSA.">Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA.</a> Talanta. 154, 169-174 (2016).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescent+immunosensing+of+prostate-specific+antigen+based+on+silver+nanoparticles-doped+Pb+(II)+metal-organic+framework.">Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 79, 379-385 (2016).</li><li>Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+electrochemical+immunosensor+for+PSA+biomarker+detection+in+prostate+cancer+cells+using+gold+nanoparticles/PAMAM+dendrimer+loaded+with+enzyme+linked+aptamer+as+integrated+triple+signal+amplification+strategy.">Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 74, 915-923 (2015).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+comparison+of+orthologous+gene+expression+in+human+bladder+cancer+and+carcinogen-induced+rodent+models.">Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models.</a> Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).</li><li>Gong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+Novel+Bladder+Cancer+Xenograft+Model+in+Humanized+Immunodeficient+Mice.">Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Protokolde en kritik adımlar 1) başarıyla hücre hattı tümörigenikliğini bakımını yapmak; 2) farelerde, tümör hücresi implantasyonundan önce ölçülebilir PSA salgısını sağlanması; Tümör büyüklüğünün değişik azaltacak şekilde 3), implantasyon için tek bir hücre süspansiyonu üretilmesi; ve 4) böbrekte tümör hücre implantasyonu ile sonuçlanır veziko-üreteral reflü önlemek için yavaş bir hızda hücrelere aşılamak. In vitro olarak uzun s?...

Bu yöntemin amacı, fare ortotopik mesane tümörleri üretmek ve tümör implantasyonu olmadan fareler uç noktası analizinde tedavi sanılan değildir bu yüzden, mümkün olduğu kadar doğru implante tümörleri izlemektir. Genel olarak, yöntem deneysel analiz için farelerin çok sayıda ihtiyacını azaltmak ve tedavi sonuçlarını belirlemede büyük doğruluğunu sağlayacaktır gösterilen. implante tümör hücreleri deri altına klinik hastalığın çevreyi özetlemek veya tedavi stratejilerinin geliştirilmesini sağlamak değil gibi kanser için ortotopik bir model geliştirilmesi önemlidir. Mesanenin mimarisi doğrudan minimal sistemik etkileri ile mesane içine mesane kanseri tedavilerinin damlatma izin verir. Bu durumda, bu ortotopik bir model olarak, bu ortam özetlemek hayvan modelleri, yeni tedavilerin değerlendirilmesi için önemlidir. herhangi bir deneysel set-up çıkarılan sonuçlar bağımlı hazırlık vardırModelin sınırlamalar üzerine t. Çeşitli teknikler farelerde ortotopik mesane tümörlerinin üretimi için geliştirilmiştir. Bunlar, mesanenin glikozaminoglikan tabakası zarar implante edilecek tümör hücrelerinin sağlayan güveniyor. Kullanılan teknikler mesane 1,2 tek bir sitede tümör gelişimine yol açan, mesane duvarı hasar tek bir noktada sonuçlanır elektrokotere içerir. Bununla birlikte, elektrokoter kullanılarak tümör implantasyonu başarı oranı operatöre bağlıdır 10 arasında değişen bir -% 90, ve periton boşluğu içinde gelişen tümörlerin neden mesane duvarı delinmiş olan tehlikesini içerir. Kimyasal koter gümüş nitrat, zarar mesane duvarı 3 kullanılarak gerçekleştirilir. Benzer şekilde, asit, mesane duvarı 4 zarar kullanılmıştır. Tripsin da iyi 5 ile mesane zarar kullanılmıştır. Bu yöntemler, mesane birden fazla tümör oluşmasına da neden olabilir.kimyasallar çok uzun süre mesane duvarı ile temas halinde bırakılırsa Ayrıca, mesane ciddi hasar tehlikesi vardır. Ninalga ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntem. pozitif yüklü poli-L-lisin (PLL), kat mesane duvarı 6 molekülleri kullanır; Bu mesane glikozaminoglikan tabakası sadık negatif yüklü tümör hücreleri sağlar. Bu yöntem, genel olarak mesanede geliştirme birden fazla tümör ile sonuçlanır, ancak tümör implantasyonu 80 olan -% 100 4,7. Teknik olarak, bunu gerçekleştirmek için en kolay prosedür aynı zamanda. geliştirilmesi tümörler da boyutu oldukça emin olmak için, tümör hücreleri implantasyondan önce, büyük yığınlar halinde gruplanmaz önemlidir. terapötik etkinliğini değerlendirmek amacıyla, oldukça benzer boyutlu tümörleri olan fareler bu çalışma yapmak için uygundur. Böylece, implantasyon hemen sonra tümör boyutu ölçmek için iyi bir algılama sistemi çok önemlidir. Çeşitli stratejiler arıN tümörleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu manyetik rezonans görüntüleme (MRI), 8-10, floresan 11 biyoluminesans 12,13, ultrason 14 ve enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), 15,16 bulunmaktadır. MR ve ultrason tümör hücrelerinin değişiklik gerektirmeyen birlikte, MRI hassas ekipman ve kontrast maddeleri için bir ihtiyaç vardır. lüminesans, Floresan-, ELISA bazlı deneyler, bu yöntemler ile saptanabilir işaretleyici proteinleri ifade etmek için, tümör hücrelerinin değişiklik gerektirir. lüminesans, bir alt-tabaka lusiferaz aktivitesinin saptanması için gereklidir; Bu şekilde, ilave bir aşama ve artan maliyeti vardır. Hem parlaklık ve floresan özel ekipman gerektirir. floresan üretmek için moleküler oksijen ile katalize edilir, yeşil flüoresan proteini (GFP) siklizasyon, gereklidir. Böylece, GFP ifade bu oldukça güvenilmez işaretleyici yaparak, oksijen erişimi bağlı bir tümör kitlesi içinde değişken olabilir <sup&gt; 17. Bir belirteç Başka bir strateji olarak murin mesane kanseri hücre çizgisi MB49 modifikasyonu insan prostat spesifik antijen (PSA) 15,16 salgılamaya. Bu belirteçler, deneyin sonunda tümör varlığını teyit olanağına immünohistokimyasal alternatif yapma için alternatif yollar sağlar. Bu çalışma, ortotopik tümör implantasyonundan PLL metodu bildirir ve tümör algılama sistemleri, yani ELISA, floresan ve ultrason görüntüleme bir karşılaştırmasını göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="893">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:404px;">MB49-PSA cells</td>
			<td style="width:188px;">N/A</td>
			<td style="width:188px;">N/A</td>
			<td style="width:113px;">ref (Wu QH, 2004)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">RPMI 1640 media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) media</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal Bovine Serum (FBS) South American</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S181B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">L-glutamine</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>X0550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hygromycin B</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">free PSA (Human) ELISA kit</td>
			<td>Abnova</td>
			<td>KA0209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TRIzol Reagent for RNA extraction&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4374967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TaqMan Universal PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TaqMan Gene Expression Assay &#8211; Mouse Actb</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Mm00607939_s1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TaqMan Gene Expression Assay &#8211; Human KLK3</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4331182</td>
			<td>Hs00426859_g1</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">C57BL/6J female mice</td>
			<td>In Vivos</td>
			<td></td>
			<td>4-6 wk old</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine)</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reversal drug (1mg/kg Atipamezole)</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ear punch</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72893-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hartmann&#39;s solution or Compound sodium lactate</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat pack - HotHands handwarmers</td>
			<td>Heatmax Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Introcan Certo IV catheter</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4251300</td>
			<td>24G x 3/4&#8243;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aquagel Lubricating jelly</td>
			<td>Local pharmacy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">&#160;Poly-L-lysine solution, 0.01%,</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Quantichrom Creatinine Assay Kit</td>
			<td>BioAssay Systems</td>
			<td>DICT-50&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fluorescent dye - VivoTrack 680</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEV12000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>4427575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Equipment and Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">7500 Realtime PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">7500 Software v2.3</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Metabolic Cage</td>
			<td>Tecniplast&#160;</td>
			<td>Vertical type rack for 12 cages</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BD FACSCanto I system&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">BD FACSDiva software v7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">IVIS SpectrumCT in vivo imaging system&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Living Image Software v3.1</td>
			<td>Caliper Life Sciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vevo 2100 imaging system&#160;</td>
			<td>VisualSonics&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine orthotopic bladder tumor model and tumor detection system

Bu protokol, insan prostat spesifik antijen (PSA) salgılar üzere tadil edilmiş olan murin mesane kanseri hücre çizgisi MB49 kullanılarak dişi C57BL / 6J farelerde mesane tümörlerine üretimini tarif eder, ve tümör implantasyonundan teyidi için prosedür. Kısaca, fareler enjektabl ilaçlar kullanılarak anestezi uygulanır ve dorsal pozisyonda yatıyordu yapılır. İdrar mesaneden boşalan ve poli-L-lisin (PLL), 50 uL yavaş yavaş 24 g, IV, kateter kullanılarak 10 mL / 20 s bir hızda damlatılır. Bu kateter tapayla kapatılması ile 20 dakika için idrar torbasında bırakılır. Sonda çıkarılır ve PLL mesane hafif basınç boşalan edilir. Bu murin mesane kanseri hücre çizgisi 10 uL / 20 s bir hızda (1 x 10 5 hücre / 50 uL) bir damlatma izlemektedir. Kateter erken tahliye önlemek için kapatılmakta. 1 saat sonra, fareler bir ters ilaç ile yeniden canlandırılması ve mesane boşalması. Yavaş instilasyon oranı, önemli olanbu tümörler, üst idrar yollarında ve böbreklerde oluşmasına neden olabilir veziko-üreteral reflü, azaltır. hücre hattı da bu implantasyondan sonra düzensiz tümör boyutları yol gibi, hücre topaklanma azaltmak için yeniden askıya alınmalıdır. Bu teknik, yüksek verimlilik ile tümörleri neden olmaktadır. Tümör büyümesi, üriner PSA salgılama ile izlenir. PSA markör izleme mesane tümör varlığının tespiti için ultrason veya floresan görüntüleme daha güvenilirdir. tedavi edilmediği takdirde 4 hafta - farelerde tümörler genellikle yaklaşık 3 ile maksimum boyutu olumsuz etkiler sağlık ulaşır. tümör büyümesini izleyerek, başarılı tümörlerinin implante değil olanlardan tedavi fareler ayırt etmek mümkündür. Sadece uç nokta analizi ile, ikincisi yanlışlıkla terapi ile tedavi edilmiş kabul edilebilir.

MB49 hücrelerinden PSA salgılama büyüme ortamı ile değişir bulunmuştur. Bu artan PSA salgılama (Şekil 1A) ile sonuçlanır, çünkü MB49-PSA DMEM ortamında yetiştirilir. PSA ELISA ve gerçek zamanlı PCR duyarlılığını tespit etmek için, MB49-PSA salgılayan hücrelerin farklı sayıda MB49 ebeveyn hücre ile karıştırıldı. Gerçek zamanlı PCR analizi, 100, PSA salgılayan hücre / 1 x 10 6 hücre (Şekil 1C)</st...

Watch this Scientific Journal Video about A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System at JoVE.com

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Bu protokol, dişi C57BL / 6J fareler, tümör büyümesi izlenmesinde sıçangil ortotopik mesane tümörlerinin üretimini tarif eder.

Bir Fare Ortotopik Mesane Tümör Modeli ve Tümör Tespit Sistemi

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

a-murine-orthotopic-bladder-tumor-model-and-tumor-detection-system

Research

JoVE Journal

Cancer Research

14.5K Görüntüleme.  National University of Singapore, National University Health System.  Bu protokol, dişi C57BL / 6J fareler, tümör büyümesi izlenmesinde sıçangil ortotopik mesane tümörlerinin üretimini tarif eder. 

Video: A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Orijinal Tümör Geliştirme Murin Deneysel Modeli ve Periton Metastaz<em&gt; yoluyla</emYumurtalık Kanseri Hücreleri ile&gt; Ortotopik aşılama

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Kanser Araştırmaları

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

Periferik Radyasyonla Bağlı Yorgunluk A Fare Modeli

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when stimulated by T lymphocytes, oncogenic B cells survive and expand autonomously in undefined organ niches. Mantle cell lymphoma (MCL) is one such B cell disorder, where the median survival rate of patients is 4 - 5 years. This calls for the need of effective mechanisms by which the homing and engraftment of these cells are blocked in order to increase the survival and longevity of patients. Therefore, the effort to develop a xenograft mouse model to study the efficacy of MCL therapeutics by blocking the homing mechanism in vivo is of utmost importance. Development of animal recipients for human cell xenotransplantation to test early stage drugs have long been pursued, as relevant preclinical mouse models are crucial to screen new therapeutic agents. This animal model is developed to avoid human graft rejection and to establish a model for human diseases, and it may be an extremely useful tool to study disease progression of different lymphoma types and to perform preclinical testing of candidate drugs for hematologic malignancies, like MCL. We established a xenograft mouse model that will serve as an excellent resource to study and develop novel therapeutic approaches for MCL.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a difficult to treat B cell disorder and it is equally difficult to establish a xenograft mouse model of primary MCL to study and develop therapeutics. Here, we describe the successful establishment of MCL xenografts in mice to help understand its underlying biology.

Tümör Engraftment insan Mantle hücreli lenfoma, Xenograft fare modeli

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory regions of oncogenes and tumor suppressors can lead to changes in gene expression and play an important role in the pathogenesis of brain tumors. Native chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a popular technique that allows the detection of modifications or other proteins tightly bound to DNA. In contrast to cross-linked ChIP, in native ChIP, cells are not treated with formaldehyde to covalently link protein to DNA. This is advantageous because sometimes crosslinking may fix proteins that only transiently interact with DNA and do not have functional significance in gene regulation. In addition, antibodies are generally raised against unfixed peptides. Therefore, antibody specificity is increased in native ChIP. However, it is important to keep in mind that native ChIP is only applicable to study histones or other proteins that bind tightly to DNA. This protocol describes the native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

Epigenetic mechanisms are frequently altered in glioma. Chromatin immunoprecipitation could be used to study the consequences of genetic alterations in glioma that result from changes in histone modifications which regulate chromatin structure and gene transcription. This protocol describes native chromatin immunoprecipitation on murine brain tumor neurospheres.

Fare Beyin tümör Neurospheres kullanarak yerel Kromatin Immunoprecipitation

Epigenetic modifications may be involved in the development and progression of glioma. Changes in methylation and acetylation of promoters and regulatory ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

Kollarındaki ve floresan Orthotopic Syngeneic fare modeli androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and colorectal cancer (CRC). More than 50% of patients with muscle-invasive UCC, despite curative therapy for clinically-localized disease, will develop metastases and die within 5 years, and metastatic CRC is a leading cause of cancer-related deaths in the US. Xenograft models that consistently mimic UCC and CRC metastasis seen in patients are needed. This study aims to generate patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) models of UCC and CRC for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of LN stromal cells mimicking the progression of human metastatic diseases for drug screening. Fresh UCC and CRC tumors were obtained from consented patients undergoing resection for HG-UCC and colorectal adenocarcinoma, respectively. Co-inoculated with LN stromal cell (LNSC) analog HK cells, luciferase-tagged UCC cells were intra-vesically (IB) instilled into female non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice, and CRC cells were intra-rectally (IR) injected into male NOD/SCID mice. Tumor growth and metastasis were monitored weekly using bioluminescence imaging (BLI). Upon sacrifice, primary tumors and mouse organs were harvested, weighed, and formalin-fixed for Hematoxylin and Eosin and immunohistochemistry staining. In our unique PDOX models, xenograft tumors resemble patient pre-implantation tumors. In the presence of HK cells, both models have high tumor implantation rates measured by BLI and tumor weights, 83.3% for UCC and 96.9% for CRC, and high distant organ metastasis rates (33.3% detected liver or lung metastasis for UCC and 53.1% for CRC). In addition, both models have zero mortality from the procedure. We have established unique, reproducible PDOX models for human HG-UCC and CRC, which allow for tumor formation, growth, and metastasis studies. With these models, testing of novel therapeutic drugs can be performed efficiently and in a clinically-mimetic manner.

This protocol describes the generation of patient-derived orthotopic xenograft models by intra-vesically instilling high-grade urothelial cell carcinoma cells or intra-rectally injecting colorectal cancer cells into non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of lymph node stromal cells, which mimics the progression of human metastatic diseases.

Insan Üromotorial Hücre Karsinomu ve kolorektal kanser tümörü büyüme ve spontan Metasrik için hasta türevi Ortootopik xenograft modelleri

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.