Name: capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary
Uploaded: 2017-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
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The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Ab&#250;ndez, Jes&#250;s Padilla-Calder&#243;n, Jaime M. Uribe-Wiechers, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.

1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Bereiten Sie die BGE - Lösung. <ol><li> Herstellung von 100 ml einer Lösung, bestehend aus 0,05% (m / v) Hydroxypropyl Methylcellulose (HPMC), 200 mM ε-Amino-n-Capronsäure (EACA) und 30 mM Lithiumacetat. HINWEIS: HPMC ein viskoelastisches Polymer ist, gießen Sie das Pulver in ein Becherglas, fügen Sie 80 ml Wasser und schließlich den Rührstab hinzufügen. Weiter zu den übrigen Reagenzien, wie sie normalerweise die Zugabe. Schutzbrille tragen beim Umgang mit Lithium-Acetat, wie es zu Augenreizungen führen kann. </li><li> Passen Sie auf einen pH-Wert 4,8 ± 0,1 mit 50% (v / v) Essigsäure. Lassen Sie die Lösung für 5 min zur Stabilisierung und ggf. korrigieren. </li><li> Fügen Sie Wasser, um bis zu einem endgültigen Volumen von 100 ml in Messkolben. </li><li> Filter durch eine hydrophile Membran mit einer 0,2 &amp; mgr; m Porengröße. </li><li> Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 7 Tage. </li></ol></li><li> Bereiten Sie den internen Standard. <ol><li> Bereiten Sie 1 mleiner Lösung von 1% (m / v) Histamin besteht. </li><li> Filter durch eine hydrophile Membran mit einer 0,2 &amp; mgr; m Porengröße. </li><li> Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 1 Tag. </li></ol></li></ol> 2. Probenvorbereitung <ol><li> Bereiten 180 ul mAb Probe mit Tris-Puffer verdünnt (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan, pH 8,0) auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml. </li><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l von 1% (m / v) Histamin. </li><li> Mischen und Zentrifugieren bei 1000 × g für 5 Sek. </li><li> Legen Sie ein Mikro Fläschchen in einem Universal-Fläschchen. </li><li> Übertragen Sie die Probe in die Mikro Fläschchen und die Kappe des Universal Fläschchen. Dispense die Probe nach oben, um alle Blasen zu vermeiden einzuführen. </li><li> Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 1 Tag. </li><li> Legen Sie die Universal-Fläschchen (mit Mikrofläschchen, die Probenlösung enthält) in der Probeneinlassfach. </li></ol> 3. Herstellung von CE-System. <ol><li> CE Systemreinigung. HINWEIS: Verhalten thist Verfahren mindestens einmal pro Woche, um elektrischen Strom Leckage aus Ansammlung von Staub und Schmutz abgeleitet zu vermeiden. Jedoch abhängig von der Anwendung (zB Verwendung eines BGE mit erhöhter Viskosität oder mit hoher Salzkonzentration, Proben mit erhöhter Viskosität) Elektroden und Öffnungshebel erfordern häufig gereinigt mehr zu Kreuzkontamination und Probenverschleppung zu vermeiden. <ol><li> Schalten Sie den Netzschalter des CE-Gerät aus und öffnen Sie die vordere Tür. </li><li> Reinigen Sie die Oberfläche der Probe Abdeckung, Probenhaltesystem (Probe und Puffer Tabletts), Patronenabdeckung, Klemmleiste, Schnittstellenblock und Elektroden mit einem mit Wasser angefeuchteten Vlies wischen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten wischen und trocken vor dem Gebrauch. </li><li> Spülen Sie die Öffnungshebel gründlich mit Wasser. Reinigen Sie die Oberfläche mit einem Vlies wischen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten wischen und trocken vor der Installation. </li><li> Reinigen Sie die beiden Enden des Glasfaserkabels vorsichtigly mit einem mit Wasser angefeuchteten Mikrofasertuch. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten Tuch. </li></ol></li><li> Kassetteneinheit. <ol><li> Nehmen Sie eine neue neutrale Kapillare (50 &amp; mgr; m Innendurchmesser) aus der Verpackung. </li><li> Band nach unten ein Ende der Kapillare Schutzschlauch an der Werkbank. Abrollen, begradigen und die Kapillare aus dem Schlauch ziehen. </li><li> Kleben Sie ein Stück Klebeband oder Papier an der Werkbank und fügen Messmarken wie folgt: Länge zum Detektor (30 cm), Kapillar - Fenster (0,2 cm) und einer Länge zum Auslaufende (10 cm) (dh 40,2 cm Gesamtlänge, 30,0 cm effektive Länge). </li><li> Richten Sie die Kapillare Fenster auf die 0,2 cm Messmarke im Referenzpapier. Befestigen Sie die Kapillare mit Band und markieren Sie die Kapillare endet 2 mm außerhalb der Messmarken. </li><li> Schneiden Sie die Schutzkappe an der Kapillareinlass Ende (das Ende der am weitesten vom Fenster) in einer einzigen geraden Bewegung den Flush Rand des Abspaltungs Stein verwenden.<ol><li> Tauchen Sie die Kapillare Ende in einem verschlossenen Universal-Fläschchen mit Wasser gefüllt, um dauerhafte Schäden an der kapillaren Innenbeschichtung zu vermeiden. Wiederholen Sie jedes Mal, dieses Verfahren das kapillare Ende für mehr als 1 min der Umgebung ausgesetzt ist. </li></ol></li><li> Legen Sie die Kapillareinlass Ende in die Ausgangsseite der Patrone. </li><li> Schieben und die Kapillare durch die Patrone nach Bedarf ziehen, bis die Kapillare Fenster in die Kassette Fenster zentriert ist. </li><li> Legen Sie die Blende Stecker (100 &amp; mgr; m × 200 &amp; mgr; m) in das Kassettenfenster. HINWEIS: Bestätigen, dass weißes Licht durch das Fenster, wenn zu einer weißen Lichtquelle ausgesetzt wird. Wenn das Licht, das ein bräunliches Aussehen hat durchläuft, ggf. einstellen. </li><li> Legen Sie die Kapillare in die vorgeformten Kühlmittelrohrleitung für insgesamt Kapillarlänge von 40,2 cm (mit vorinstallierter Schlauchmutter, Zwinge und O-Ring an beiden Enden in dieser Reihenfolge). </li><li> Schieben Sie die Kapillare durch die coolant Schlauch wie nötig, bis die Kapillare an der anderen Seite des Schlauchs erscheint. </li><li> Führen Sie das Ende des Kühlmittelrohrleitung in die Ausgangsseite der Patrone und ziehen Sie die Schlauchmutter. </li><li> Legen Sie die Kapillareinlass Ende in die Einlassseite der Patrone. </li><li> Hub und die Kapillare durch die Patrone nach Bedarf ziehen, bis die Kapillare an der Einlassseite der Kassette angezeigt wird. </li><li> Führen Sie das Ende des Kühlmittelrohrleitung in die Einlassseite der Patrone und ziehen Sie die Schlauchmutter. </li><li> Schneiden Sie die Schutzkappe an der Kapillarauslass Ende (das Ende nächsten aus dem Fenster) in einer einzigen geraden Bewegung den Flush Rand des Abspaltungs Stein verwenden. </li><li> Legen Sie die Dichtung-Halteklammern über die Kapillare Enden und drücken Sie in die richtige Position zu schnappen. Sichtprüfung der Kapillare endet. Wenn sie nicht einmal sind, wiederholen Sie den Vorgang. </li><li> Legen Sie die Kapillare Länge Vorlage auf dem Rand der Werkbank. </li><li> Legen Sie die Patrone nach unten against die Kapillare Länge Schablone und richten Sie die Kapillare mit den Referenzlinien auf der Vorlage endet. Wenn die Kapillare Messmarken (siehe 3.2.4) nicht mit den Referenzlinien ausrichten, ggf. einstellen. </li><li> Halten Sie die Kapillare gegen die kapillare Länge Schablone und schneiden beide Enden der Kapillare auf der Vorlage die flush Kante des Abspalten Stein 2 mm unterhalb der Referenzlinien verwendet wird. </li><li> Sichtprüfung der Kapillare mit einem Vergrößerungsglas endet. Wenn Kapillarenden nicht glatt sind, polieren sie das weiche Gesicht des Abspaltungs Stein verwenden. </li><li> Legen Sie die Öffnung O-Ring in die Öffnung Zündkerzenloch den O-Ring Einsatzwerkzeug verwendet wird. </li><li> Installieren Sie mit einer Kappe bedeckt Universal gefüllt Fläschchen mit Wasser in das Kassettengehäuse und Platz Patrone in Fall sofort mit Kapillar-Enden in Ampullen eingesetzt. Für Kurz- und Langzeitlagerung halten bei 2-8 ° C. </li></ol></li><li> Herstellung von Puffer Tabletts. <ol><li> Füllen Sie und legen Sie mit einer Kappe bedeckt universal Phiolen in dem Puffer Eintritts- und Austrittswannen (Abbildung 1). Wiederholen Sie Fläschchen Positionen in den Spuren 2, 3, 4 und 5 gemäß der Anzahl der zu analysierenden Proben, eine Spur für alle sechs Probeninjektionen platzieren. HINWEIS: Vermeiden Sie die Fläschchen-Kappen, um Frittstrom Auslaufen zu verhindern. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> Abbildung 1: Lage und den Füllstand des Universalfläschchen in den Puffer Einlass und Auslass Tabletts. Füllstände: 1/1 = 1400 &amp; mgr; l, 3/4 = 1300 &amp; mgr; l und 1/2 = 1000 &amp; mgr; l. Abkürzungen: W = Wasser, HCl = 0,1 M Salzsäure. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="4"><li> CE Systemkomponenten Montage. <ol><li> Installieren Sie den UV-Detektor. </li><li> Installieren Sie die Öffnungshebelindem sie in den Schnittstellenblock nach oben drücken. </li><li> Installieren Sie das Glasfaserkabel. Legen Sie die entsprechende Ende mit der Klemmleiste und, während beide Enden halten, drehen im Uhrzeigersinn. Schließen Sie das andere Ende mit dem UV-Detektor. HINWEIS: Behandeln Sie das Glasfaserkabel mit Sorgfalt während dieses Verfahrens, da Biegen seiner Fraktur verursachen könnte. </li><li> Platz Probe und Puffer Tabletts in den Probenhaltesystem und einrasten. </li><li> Legen Sie die Kapillarpatrone in den Schnittstellenblock und, während Sie die Klemmleiste an beiden Enden, ziehen Sie die Knöpfe. </li></ol></li></ol> 4. Instrument Methoden Set-up <ol><li> Erstellen Sie die Anlage, Laufen und Shutdown-Instrument Methoden nach mit den folgenden Parametern und Tabelle 1: Spannung, max: 30,0 kV; Strom, max: 300,0 uA; Cartridge Temperatur: 20,0 ° C; Probenlagertemperatur: 10,0 ° C; UV-Detektor Anfangsbedingungen: Wellenlänge: 214 nm; Datenrate: 4 Hz; Filter: Normal; Peakbreite (Punkte): 16-25; Absorptions-Signal: Direct. HINWEIS: Datenerfassungsrate erhöht werden kann, bis zu 25 Hz, um die Abdeckung der schmalen Trennzonen zu verbessern. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> Konditionierungsverfahren Zeitprogramm </td></tr><tr><td> Zeit (min) </td><td> Event </td><td> Wert </td><td> Dauer </td><td> Inlet Phiole </td><td> Outlet Phiole </td><td> Zusammenfassung </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td> &lt;td&gt; Wasser </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> Separate - Spannung </td><td> 15,0 KV </td><td> 10,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 Min Rampe, normale Polarität </td><td> Getrennte </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2758 mbar </td><td> 10,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Vorwärts </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20,01 </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> Rinse-Tipps </td></tr><tr><td colspan="8"> Laufende Verfahren Zeitprogramm </td></tr><tr><td> Zeit (min) </td><td> Event </td><td> Wert </td><td> Dauer </td><td> Inlet Phiole </td><td&gt; Outlet Phiole </td><td> Zusammenfassung </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Wasser </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 4,0 min </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> Spritzen - Druck </td><td> 34 mbar </td><td> 20,0 sec </td><td> SI: A1 </td><td> BO: B1 </td><td> Außer Kraft setzen, nach vorne </td><td> Probeninjektion </td></tr><tr><td> - </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,4 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Wash-Tipps </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Separate - Spannung </td><td> 15,0 KV </td><td> 30,0 min </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0,17 Min Rampe, normale Polarität, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Probentrenn </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> Auto Zero </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30,01 </td><td> Stopp-Daten </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30,02 </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 2,0 min </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Wasser </td></tr><tr><td> 32,03 </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out Fläschchen inc 6 </td><td> Rinse-Tipps </td></tr><tr><td> 32,04 </td><td> Ende </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Ende </td></tr><tr><td colspan="8"> Shutdown-Methode Zeitprogramm </td></tr><tr><td> Zeit (min) </td><td> Event </td><td> Wert </td><td> Dauer </td><td> Inlet Phiole </td><td> Outlet Phiole </td><td> Zusammenfassung </td><td> Bemerkungen </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 1,0 min </td><td> BI: E6 </td><td> BO: E6 </td><td> Vorwärts </td><td> HCl 0,1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Spülen - Druck </td><td> 2068 mbar </td><td> 6,0 min </td><td> BI: F6 </td><td> BO: F6 </td><td> Vorwärts </td><td> Wasser </td></tr><tr><td> - </td><td> Lampe - Aus </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Warte ab </td><td> - </td><td> 0,0 min </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> Rinse-Tipps </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Konditionierung, Laufen und Shutdown - Zeit - Programme. 5. Datenerfassung und -verarbeitung <ol><li> Programmieren Sie die Probe eingestellt. <ol><li> Programmieren Sie die Kapillare für die Konditionierung der Konditionierung Instrument Methode. Wenn die Kapillare zum ersten Mal verwendet wird, Programm vier Wiederholungen; programmieren sonst nur zwei Wiederholungen des Konditionierungsmethode. </li><li> Programm, um die Proben werden analysiert, um die ablaufenden Instrumenten-Methode. </li><li> Programmieren Sie die Kapillare zur Speicherung der Shutdown Instrument Methode und wiederholen Sie den in Abschnitt 3.2.22 Verfahren. </li></ol></li><li> Führen Sie das Experiment. </li><li> Exportieren Sie die Elektropherogramme. </li><li> Berechnen Sie die Migrationszeit und der Anteil an Grund-, Haupt-and sauren Isoformen vertikalen Falllinie Integration des Elektropherogramm-Profil. </li></ol>

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The authors Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz and Emilio Medina-Rivero are employees of Probiomed S.A. de C.V., which is developing, manufacturing and marketing biosimilar products. All authors are involved in the development of biosimilar products for Probiomed.

In diesem Tutorial zeigen wir die Bedeutung der richtigen Praktiken bei der Durchführung von CZE von mAb analysiert, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, um erfolgreich zu sein. Wenn jedoch CZE auf einer Routinebasis verwendet wird, Probleme entstehen zwangsläufig 12. Für die besten Ergebnisse ist es wichtig, die Hinweise zu folgen, die das ganze Protokoll aufgenommen wurden, da sie den Analytiker schwierige Schritte zu überwinden und zu beheben helfen. Eine wichtige Überle...

Monoklonale Antikörper (mAb) sind Biotherapeutikum Proteine mit steigendem Interesse aufgrund ihrer Handlungsfähigkeit gegen mehrere chronische und degenerative Krankheiten 1. Wie andere Biomoleküle sind mAbs anfällig mehrere physikalisch - chemische Modifikationen in allen Phasen ihres Lebenszyklus zu unterziehen (dh von Biosynthese zum Endprodukt). Solche Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf : Desamidierung, Glykosylierung, Oxidation, Cyclisierung, Isomerisierung, Aggregation und proteolytische Spaltung 2. Daher analytische Techniken der Lage intrinsische Isoformen zu lösen sind erforderlich mAbs Heterogenität und Stabilität, um zu überwachen, um Qualitätsanforderungen herzustellen. Kapillarelektrophorese (CE) ist ein Hochleistungstrenntechnik outinside eines schmalen Quarzglasröhre (&amp; mgr; m-Bereich) gefüllt durch mit einem Hintergrundelektrolyten (BGE). Bei Anlegen eines elektrischen Feldes (bis zu 30.000 V), geladenes Moleküls wandern in Richtung der Elektrode mit entgegengesetzter Ladung (dh elektrogetriebene Trennung). Die Verwendung von hohen Spannungen in CE ermöglicht schnelle Analysen und erhöhte Effizienz, die der Elektrophorese klassischen Gel überlegen sind. Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist eine CE-basierte Technik routinemäßig in der biopharmazeutischen Industrie für die Produktqualität Beurteilung verwendet 3-9. Im Gegensatz zu anderen Formen der CE (zB Kapillar - Gel - Elektrophorese, Kapillar - isoelektrische Fokussierung) oder Chromatographie-basierte Methoden können CZE ohne Verwendung von Denaturierungsmitteln oder Festphasen - Schnittstellen durchgeführt werden, so dass die Analyse der inhärenten Heterogenität der mAbs nahe an ihrem nativen Zustand 10 . CZE Trennung von mAb - Isoformen auftritt innerhalb einer Fused-Silica - Kapillare mit einem hydrophilen Polymer (neutral Kapillare) abgedeckt und auf der Basis ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität, die durch Ladung, Masse, Größe und Form (oder hydrodynamischen Volumen) 11 ausgeschlossen ist. mAb-Einheiten detektiert, wennsie mobilisiert und durch das Erfassungsfenster, das 4 durch ein Ultraviolett (UV) Absorptionsdetektor bei 214 nm gemessen wird. Die erfolgreiche Umsetzung dieser Analysetechnik wird vor und während des Experiments zu Details über angemessene Aufmerksamkeit abhängen. Acting sonst wird die Kosten und die Zeit erhöhen, um die Analyse durchzuführen, was letztlich zu konstanten Versagen und Frustration führen. Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, eine erfolgreiche Analyse von mAb Heterogenität durch CZE durch die detaillierte Erläuterung der Herstellung von Lösungen und Proben durchzuführen, die Herstellung von CE-System, das Instrument Verfahren einzurichten, die Datenerfassung und das Verarbeiten. Für die Zwecke dieses Tutorial, eine rekombinante vollständig humanen Anti-Tumor-Nekrose-Faktor alpha (anti-TNF) mAb als Proteinmodell verwendet wird; jedoch kann dieses Protokoll leicht für die Analyse von anderen Proteinen unter Berücksichtigung kurze Änderungen angepasst werden. EINußerdem, mehrere Empfehlungen zu mildern sind mögliche Probleme vorgeschlagen. Der Leser wird aufgefordert, zu streng, die vorgeschlagene Protokoll folgen, da die Wahrscheinlichkeit erhöhen, um erfolgreich zu sein.

<table><tbody><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Tecsiquim</td><td>AT0035-7</td><td></td></tr><tr><td>ACS grade hydrochloric acid</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine dihydrochloride</td><td>Fluka</td><td>53300</td><td></td></tr><tr><td>(Hydroxypropyl) methyl cellulose&amp;nbsp;</td><td>Fluka</td><td>09963</td><td></td></tr><tr><td>Lithium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminocaproic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&amp;nbsp; pH 8</td><td>Beckman Coulter</td><td>477427</td><td></td></tr><tr><td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66528</td><td></td></tr><tr><td>eCAP Neutral capillary&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>477441</td><td></td></tr><tr><td>Vial, Micro, 200 &amp;micro;l</td><td>Beckman Coulter</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>Universal Vial Caps</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62250</td><td></td></tr><tr><td>Universal Vials</td><td>Beckman Coulter</td><td>A62251</td><td></td></tr><tr><td>Cable, Optics, UV/Vis</td><td>Beckman Coulter</td><td>144093</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis Detector Module</td><td>Beckman Coulter</td><td>144733</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td><td>Beckman Coulter</td><td>144738</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Figur 2 zeigt den typischen elektrischen Stromprofil eines 200 mM EACA, 30 mM Lithiumacetat, pH 4,8 BGE mit anti-TNF &amp; agr; mAb Probe mit Tris - Puffer (50 mM, pH 8,0). Wie beobachtet werden kann, ist der Strom in der gesamten Analyse stabil und zwischen Werten von 30 bis 35 &amp; mgr; A oszillieren kann. Abbildung 3 zeigt die CZE Elektropherogramm einer Blindprobe , wo der detektierte Peak, der dem Histamin interner Standard entspricht. Es ist für ...

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Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.6K Aufrufe.  Unidad de Investigación y Desarrollo, Probiomed S.A. de C.V.. Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Serie: Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Forschung

Biochemie

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using affinity chromatography.&#160;While affinity chromatography using porous protein A agarose beads packed in columns is arguably the most common method of laboratory scale isolation of antibodies and recombinant proteins expressing Fc fragments of IgG, it can be a time consuming and expensive process.&#160;Time and financial constraints are especially daunting in small basic science labs that must recover hundreds of micrograms to milligram quantities of protein from dilute solutions, yet lack access to high pressure liquid delivery systems and/or personnel with expertise in bioseparations. Moreover, product quantification and characterization may also excessively lengthen processing time over several workdays and inflate expenses (consumables, wages, etc.).&#160;Therefore, a fast, inexpensive, yet effective protocol is needed for laboratory scale isolation and characterization of antibodies and other proteins possessing an Fc fragment.&#160;To this end, we have devised a protocol that can be completed by limited-experience technical staff in less than 9 hr (roughly one workday) and as quickly as 4 hr, as opposed to traditional methods that demand 20+ work hours. Most required equipment is readily available in standard biomedical science, biochemistry, and (bio)chemical engineering labs, and all reagents are commercially available.&#160;To demonstrate this protocol, representative results are presented in which chimeric&#160;murine galectin-1 fused to human Fc (Gal-1hFc) from cell culture supernatant was isolated using a protein A membrane adsorber.&#160;Purified Gal-1hFc was quantified using an expedited Western blotting analysis procedure and characterized using flow cytometry. The streamlined workflow can be modified for other Fc-expressing proteins, such as antibodies, and/or altered to incorporate alternative quantification and characterization methods.

Compared with traditional affinity chromatography using protein A agarose bead-packed columns, protein A membrane adsorbers can significantly speed laboratory-scale isolation of antibodies and other Fc fragment-expressing proteins.&#160;Appropriate analysis and quantification methods can further accelerate protein processing, allowing isolation/characterization to be completed in one workday, instead of 20+ work hours.

Isolation und Charakterisierung von chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

Biotechnik

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that may facilitate the development of vaccines and peptide drugs. Peptide scanning is a simple and efficient method that straightforwardly maps the linear epitope recognized by a monoclonal antibody (mAb). Here, the authors present an epitope determination methodology involving serially truncated recombinant proteins, synthetic peptide design, and dot-blot hybridization for the antigenic recognition of nervous necrosis virus coat protein using a neutralizing mAb. This technique relies on the dot-blot hybridization of synthetic peptides and mAbs on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The minimum antigenic region of a viral coat protein recognized by the RG-M56 mAb can be narrowed down by step-by-step trimmed peptide mapping onto a 6-mer peptide epitope. In addition, alanine scanning mutagenesis and residue substitution can be performed to characterize the binding significance of each amino acid residue making up the epitope. The residues flanking the epitope site were found to play critical roles in peptide conformation regulation. The identified epitope peptide may be used to form crystals of epitope peptide-antibody complexes for an x-ray diffraction study and functional competition, or for therapeutics.

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Peptid-Scanning-gestützte Identifizierung eines monoklonalen Antikörpers anerkannte Linear B-Zell-Epitop

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Immunologie und Infektion

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Verfahren und wichtige Optimierungsstrategien für eine automatisierte Kapillar elektrophoretischen basierende Immunoassay-Methode

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

Biologie

Capillary Electrophoresis (CE)

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique that separates molecules in an electric field according to size and charge. CE is performed in a small glass tube called a capillary that is filled with an electrolyte solution. Analytes are separated due to differences in electrophoretic mobility, which varies with charge, solvent viscosity, and size. Traditional electrophoresis in gels is limited in the amount of voltage that can be applied because Joule heating effects will ruin the gel and the separation. Capillaries have a large surface area-to-volume ratio and thus dissipate heat better. Therefore, the voltages applied for a capillary electrophoresis experiment are quite large, often 10,000&#8211;20,000 V.
Capillary electrophoresis is useful for high-performance separations. Compared to liquid chromatography, CE separations are often faster and more efficient. However, capillary electrophoresis works best to separate charged molecules, which is not a limitation of liquid chromatography. CE has a greater peak capacity than high-performance liquid chromatography (HPLC), meaning the separations are more efficient and more peaks can be detected. The instrumentation can be very simple. However, HPLC is more versatile and many stationary and mobile phases have been developed for different types of molecules.

Capillary Electrophoresis: Principle, Procedure and Applications

Kapillarelektrophorese (CE)

Source: Laboratory of Dr. B. Jill Venton - University of Virginia
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique that separates molecules in an ...

Lehre

JoVE Science Education

Chemie

Grundlagen der analytischen Chemie

An Affinity Chromatography Technique for the Purification of Monoclonal Antibodies

Source: Elgundi, Z., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55153">Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique for purifying monoclonal antibodies from the culture supernatant obtained from an antibody-producing cell culture. The process involves using a matrix of crosslinked agarose beads with conjugated Protein A, which immobilizes the antibodies in the supernatant on the beads, allowing for effective separation from contaminants. By applying an elution buffer with low pH, the protein A-antibody interaction is loosened, facilitating the collection of antibody-containing fractions.

Eine Affinitätschromatographie-Technik zur Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern

1. Antibody Purification by Affinity Chromatography Using an Automated Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System
NOTE: The following procedure can ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

DFE-Based Affinity Chromatography: A Technique for Purification of 2F5 Monoclonal Antibodies from a Crude Sample Using High Ionic Strength-Based Elution Conditions

Source: Kn&#246;dler, M. et al., <a href="https://www.jove.com/v/59933">Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes an affinity chromatography technique for purifying 2F5 monoclonal antibodies using the DsRed-2F5-Epitope or DFE ligands. The purified 2F5 monoclonal antibodies are essential drugs in immunotherapy.

DFE-basierte Affinitätschromatographie: Eine Technik zur Aufreinigung von monoklonalen 2F5-Antikörpern aus einer Rohprobe unter Verwendung von Elutionsbedingungen mit hoher Ionenstärke

Source: Kn&#246;dler, M. et al., Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case ...

Biological Techniques

Chromatography Techniques

A Capillary Electrophoresis Immunoassay for Protein Biomarker Detection

Source: Sage, J. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/60638">Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates a capillary electrophoresis immunoassay protocol for detecting a protein biomarker associated with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human blood platelets. Confirmation of the presence of the ALS biomarker protein is achieved through size-based separation of the platelet proteins followed by chemiluminescent detection.

Ein Kapillarelektrophorese-Immunoassay für den Nachweis von Protein-Biomarkern

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of buffers and ...

Characterization and Functional Analysis

Electrophoresis: Overview

Electrophoresis is a powerful analytical separation technique that relies on the differential migration of charged species when subjected to an electric field. The core strength of electrophoresis lies in its ability to separate high-molecular-weight species in complex mixtures. It has found widespread use in biochemistry, molecular biology, and analytical chemistry, allowing the separation of compounds like amino acids, nucleotides, carbohydrates, and proteins with excellent resolution.
There are two main formats for electrophoretic separations: slab electrophoresis and capillary electrophoresis. Slab Electrophoresis uses a gel matrix, such as agarose or polyacrylamide, which acts as a sieve, allowing molecules to move through the pores. Capillary electrophoresis employs a narrow capillary tube filled with a buffer solution, providing high-resolution separation with rapid analysis time and minimal sample requirements. Although slab electrophoresis is widely used in biochemistry and biology to separate high-molecular-mass species, capillary electrophoresis is a more recent development with several advantages.
Capillary electrophoresis is a separation technique used to analyze complex mixtures of analytes based on their differential migration rates in an applied electric field. In this method, a sample is injected into a narrow capillary tube filled with a buffered solution, and an electric field is applied to facilitate separation. The migration rate of the analyte depends on its charge and size. The smaller, more highly charged ions migrate faster than the larger, less charged ones. In capillary electrophoresis, the migration of sample components is influenced by two types of mobility: electrophoretic mobility and electroosmotic mobility. Electrophoretic mobility is the solute&#39;s response to the applied electric field, with cations moving toward the negatively charged cathode, anions moving toward the positively charged anode, and neutral species remaining stationary. Electroosmotic mobility occurs when the buffer solution moves through the capillary in response to the electric field, typically toward the cathode.
Under normal conditions, capillary electrophoresis separates cations first, followed by neutral species, and finally, the anions. This separation is based on their respective electrophoretic mobilities and electroosmotic flow velocities. Notably, all separated species are eluted from the same end of the capillary, allowing their detection using quantitative detectors. The detector signals produce an electropherogram resembling a chromatogram but feature narrower peaks.
Capillary electrophoresis is a powerful tool for qualitative and quantitative analysis of complex mixtures. It provides information similar to that obtained from other separation techniques, such as gas chromatography (GC) or high-performance liquid chromatography (HPLC).

Elektrophorese: Überblick

Electrophoresis is a powerful analytical separation technique that relies on the differential migration of charged species when subjected to an electric ...